维生素D受体基因启动子的甲基化状态良性和恶性肾上腺肿瘤

文摘

我们之前显示维生素D受体(VDR) mRNA的表达下降/蛋白质在一小群肾上腺皮质癌(ACC)组织,表明失去保护作用,对恶性细胞生长在这个癌症类型。Downregulation VDR基因表达可能导致表观遗传学事件,也就是说,甲基化的胞嘧啶核苷酸的CpG岛VDR基因启动子。我们分析了CpG网站VDR基因启动子的甲基化在正常肾上腺和肾上腺皮质肿瘤样本。CpG-rich 5′的甲基化区域被酸性亚硫酸盐测序PCR评估使用bisulfite-treated DNA档案microdissected石蜡包埋肾上腺皮质组织。三个正常的肾上腺和23个不同的肾上腺皮质肿瘤样本(15腺瘤和癌8日)进行了研究。启动子区域的甲基化VDR基因被发现在3/8 ACCs,虽然没有VDR基因甲基化在正常肾上腺和肾上腺皮质腺瘤。VDR信使rna和蛋白质含量低ACCs比良性肿瘤和VDR疣状在ACCs弱或消极的,包括所有3甲基化组织样本。VDR基因启动子甲基化之间的关系,降低了VDR基因表达ACC的并不是一个罕见的事件,这表明VDR表观遗传失活可能肾上腺皮质癌形成的作用。

1。介绍

除了经典的作用,钙和骨内稳态,1α,25-dihydroxycholecalciferol D3 (1α25 (OH)₂D₃](骨化三醇),维生素D的活性代谢物,被公认的“noncalcemic”效应在各种细胞后绑定到维生素D受体(VDR NR1I1),核受体超家族的成员,包括类固醇受体,甲状腺激素,和视黄酸1]。类维生素a的VDR形式为或形成X受体(RXR NR2B),允许特定的DNA结合。1的绑定α25 (OH)₂D₃VDR-RXR复杂紧随其后的是附件这种复杂的维生素D响应元素,然后启动转录在目标基因的启动子2,3]。配体VDR的影响取决于目标基因的表观遗传景观(4]。

有证据表明,1α25 (OH)₂D₃由几种VDR-mediated机制防止肿瘤形成,包括监管增长逮捕,细胞分化,迁移,入侵,和细胞凋亡,这使得癌症候选人代理监管(5- - - - - -7]。维生素D之间的关系系统和肾上腺病理生理学和增长最近突出(8]。我们显示的VDR mRNA和蛋白表达下降一小群人肾上腺皮质癌(ACCs),表明失去保护作用,对恶性肿瘤细胞增长,作为其他癌症类型的建议(9,10]。

全球和gene-specific DNA启动子甲基化异常一直在观察人体肾上腺皮质肿瘤,良性或恶性,暗示失调类固醇生物合成和肾上腺的增长11- - - - - -15]。Downregulation VDR基因表达的肾上腺癌可能导致表观遗传事件,也就是说,甲基化的胞嘧啶核苷酸CpG岛VDR启动子。事实上,启动子甲基化能够扭曲了转录因子结合位点,从而导致转录沉默。

与我们的以前的观测(连续性10),我们的研究的目的是分析VDR基因启动子的甲基化GpG网站不同的和更大的一系列人体肾上腺皮质组织,比较肾上腺皮质腺瘤(留住)ACCs样本。

2。材料和方法

2.1。病人和组织样本

本研究机构审查委员会批准依法帕多瓦大学医院的赫尔辛基宣言》1983年修订的指导方针。知情同意是获得所有个体参与者包括在这项研究中。术前诊断是根据病史、症状、体征、内分泌评估和影像学检查(如MRI、CT)。档案microdissected石蜡包埋的幻灯片的病人被用于组织学检查和分子研究。根据组织病理学诊断为肾上腺恶性肿瘤进行维斯等人提出的标准。16)和《提出的修改等。17]。三个正常肾上腺皮质肾上腺的肾脏捐赠者也进行了研究。组织病理学幻灯片被两个分类病理学家独立(司令部和自动跟踪),以及它们之间不存在差异。

2.2。VDR启动子甲基化分析

总基因组DNA提取formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)肾上腺皮质组织使用QIAamp DNA FFPE组织工具包(试剂盒、米兰、意大利)。DNA样本进行亚硫酸氢转换使用EZ DNA Methylation-Gold工具包(Zymo研究有限公司、意大利米兰)。重亚硫酸盐处理产生的化学转化unmethylated胞嘧啶尿嘧啶,检测胸腺嘧啶在PCR。

甲基胞核嘧啶免受化学转化。Bisulfite-treated DNA放大使用两套重亚硫酸盐测序引物设计通过使用MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)包含该地区从693个基点−−65 bp上游VDR转录起始点。

引物序列如下:M1F 5′-GGAATTCGGGATTAGGGATTAGGGAAG-3′。M1R 5′-AATACGTCACCCCCACCTAAACTAACCAAAC-3′。M2F 5′-GTTAGTCGCTAGGCGTTTTTTAGCGTTTCGC-3′。M2R 5′-TATAAAACAAAATTATCGATAATTATAAATA-3′。M3F 5′-GTAGAATTACGGTAGGAAGGGTGGGGGGTTG-3′。M3R 5′-CCCCGCCCACAAATCCAATCCTCTCTTAGG-3′。

PCR电泳分离的产品和孤立使用Centri-Sep列(普林斯顿分色,意大利米兰)。DNA测序使用反向引物与应用生物系统公司(M1R和M2R)自动荧光测序器(应用生物系统公司、米兰、意大利)。在DNA序列,甲基化网站视觉计算。

2.3。RNA隔离/定量实时PCR (qPCR)

细胞总RNA提取从FFPE肾上腺组织样本幻灯片使用RNeasy普遍装备(试剂盒,马里兰州)。短暂,FFPE组织与蛋白酶K deparaffinized和治疗,并为总RNA提取基因组DNA被删除了。总RNA被NanoDrop量化1000光谱仪(ThermoScientific威尔明顿·德·)。RNA质量分析了安捷伦2100年生物分析仪(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。基因表达的评估是由定量rt - pcr,如前所述在我们最近的出版物10]。定量PCR对船舶和管家hmb (hydroxymethylbilane合酶)基因引物如下:5′-GAAGCCTTTGGGTCTGAAGTG-3′(VDR向前),5′-CCGCCATTGCCTCCATCC-3′(VDR反向)和5′-GGCAATGCGGCTGCAA-3′(hmb), 5′-GGGTACCCACGCGAATCAC-3′(hmb反向)。退火温度是60°C的所有基因。使用DNA进行PCR引擎(内髓2连续荧光检测系统,乔丹研究,沃尔瑟姆,妈,美国)。对于每一个样品,结果与hmb rRNA规范化。

2.4。免疫印迹和密度测量分析

肾上腺组织幻灯片deparaffinized使用二甲苯(σ)3×10分钟和蛋白质提取使用Qproteome FFPE组织工具包(试剂盒、米兰、意大利)和幻灯片Tris-HCl受到免疫印迹分析10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(英杰公司有限公司,尤金,或者美国)在运行缓冲(三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸/ SDS液)。探讨了膜在4°C隔夜anti-VDR老鼠多克隆抗体(VDR-D6 1: 500年,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)和鼠标β肌动蛋白,克隆AC-15 (1: 10.000) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。主要anti-VDR和反β肌动蛋白抗体检测与二次山羊anti-mouse荧光抗体(IRDye 800连续波,Li-Cor生物科学,米兰,意大利)(1:15.000)。信号被Li-Cor收购奥德赛Clx (Li-Cor生物科学)。量化个体蛋白质的乐队是衡量Li-Cor数字图像工作室。对于每一个样品,结果归一化与管家蛋白β肌动蛋白。

2.5。免疫组织化学

疣状在formalin-fixed VDR蛋白表达进行石蜡包埋肾上腺组织幻灯片,正如我们最近的出版物中所描述的(10]。疣是由streptavidin-biotin放大方法使用Histfine工具包(Nichirei有限公司、东京、日本)。抗原检索是由加热5分钟的幻灯片在高压釜柠檬酸缓冲(2毫米柠檬酸、柠檬酸三钠的9毫米脱水,pH值6.0)。主要的抗体的稀释1:50。抗原抗体复合物是可视化与3、3′-diaminobenzidine解决方案[1毫米3、3′-diaminobenzidine, 50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值7.6),和0.006%的H₂O₂),用苏木精复染色。人类乳腺癌标本被用作积极控制。负控制孵化与正常小鼠抗血清的主要抗体,统一了没有反应(没有显示)。

2.6。统计数据

对于两个示例比较,差异意味着被Mann-Whitney评估测试。连续变量之间的关系进行评估计算斯皮尔曼等级相关系数。所有的结果是连续变量表示为平均数±标准差。值< 0.05作为具有统计学意义。执行统计分析使用GraphPad Prism 6.0版本软件(GraphPad软件)。

3所示。结果

23例(12个雌性,雄性11日)接受肾上腺切除术零星的肾上腺皮质肿瘤之间的2006年和2014年被列为留住()和ACCs ()。队列是不同于我们之前的出版物中描述(10]。十五2 ACA包括cortisol-producing腺瘤患者,10醛固酮增多症相关的腺瘤,无功能腺瘤和3:7是女性和8个男性,31到67岁(平均年龄51.3岁)。八ACCs由5女性和3男性,从33岁至73岁(平均年龄52.7岁)。

临床和8 ACC病人的肿瘤特征,包括ENSAT阶段手术(18),如表所示1。五ACCs患者内分泌症状和皮质醇分泌过剩的迹象;三个病人所患肾上腺质量。所有患者ACCs与米托坦抗肾上腺素的药物治疗,1,1-dichloro-2 - (o-chlorophenyl) 2 (p-chlorophenyl)乙烷(o, p′ddd),手术前。具体来说,米托坦是手术前的五个库兴氏综合征患者因为hypercortisolism不会顺从其他类固醇生成抑制剂;其余3例服用米托坦作为第二次手术前辅助治疗复发性疾病。意思是肾上腺肿瘤直径在留住和ACCs组14毫米和120毫米,分别。患者平均随访时间均为72个月(范围12 - 120个月)为留住和26个月ACCs 6-48个月(范围)。

VDR启动子甲基化是在3/8 ACCs标本,其中包括两个cortisol-producing和1所患癌患者(C3、C4和C6病人表1)。两个PCR产品,包括地区从693−−65个基点,包含42 CpG岛,其中27(64%)甲基化。一个代表性的案例是呈现在图1。甲基化的网站都是相同的在所有3 ACCs组织标本。没有发现VDR启动子甲基化在其他5 ACCs 3正常肾上腺,15留住。

qPCR分析显示变量的VDR mRNA水平在所有肾上腺肿瘤,与上级VDRmRNA表示在留住ACCs (与任意单位,)(图2(一个))。VDR免疫印迹在代表正常肾上腺(NA)的情况下,留住,ACCs如图2 (b)。VDR /β肌动蛋白蛋白质含量,测量在整个一系列的肿瘤标本,显示结果类似于VDR mRNA的良性和恶性肿瘤的区别(和0.04±0.06任意单位,)(图2 (b))。观察低或没有VDR表达式留住或ACCs的个案。VDR mRNA和VDR /之间的正相关关系β肌动蛋白水平(观察(图)2 (c))。

免疫组织化学染色对VDR的代表一个正常肾上腺的情况下,一个ACA,一个3甲基化ACCs报道在图2 (d)。核和细胞质VDR疣状,符合易位的VDR从细胞质核配体结合后(10),观察3正常肾上腺和留住。在方差,表达了VDR察觉或很弱,只局限于分散在所有ACCs肿瘤细胞,包括3甲基化情况下(图2 (d))。

4所示。讨论

reduced-absent VDR mRNA的表达和蛋白质的肾上腺皮质癌可能是由于不同的分子机制。体细胞VDR基因突变可以发生,反映出一种机制(即。,loss of tumor-suppressor function) implicated in the malignant transformation of adrenocortical cells. We did not analyze this possibility in our samples, but VDR gene is rarely mutated during carcinogenesis [19]。没有证据表明在最近的一次whole-exome测序VDR基因突变分析大量的ACCs [20.]然而不可能让这事件。人类VDR的表观遗传失活,降低其mRNA和蛋白表达,已被证明在不同癌症类型(4,21),支持抗增殖作用VDR的损失(10),而可能发生在ACCs。VDR基因的启动子是在一个GC-rich岛和包含强有力的监管元素的转录活动(22]。中断启动子活性的DNA甲基化是表观遗传灭活机制经常观察到肿瘤抑制基因(23]。我们目前的结果支持VDR沉默的子群ACCs通过表观遗传机制。因为越来越多的证据表明,基因启动子甲基化可以转录失活的结果,而非原因,VDR甲基化的假设恶性转化的结果也不能排除。此外,VDR启动子的甲基化没有专门报道所有肾上腺皮质癌全基因组甲基化研究(12- - - - - -14]。

不同的表观遗传机制的差别解释对这些VDR基因表达也可以假设我们剩余ACCs和我们的一些较低的腺瘤病例VDR表达式。改变活动的监管VDR转录活动的元素,如阻遏蛋白/辅阻遏物或不平衡的增强剂,可以考虑(4,24]。此外,VDR基因启动子数组包含假定的结合位点的转录因子调节PKA的活动和PKC途径(22),反过来知道收敛在几个特定的转录因子。配体的作用机理VDR也依赖于大量的酶共价调节组蛋白修饰,这后生监管体系已经发现经常改变癌症。

我们不能排除在肾上腺皮质肿瘤VDR基因的低表达,以及在某些良性腺瘤,而可能是由于激素化合物的影响,即雌激素、甲状腺激素、糖皮质激素,同样能改变VDR mRNA /蛋白质含量(3]。有趣的是,我们显示雌激素和ER的关键作用α在肾上腺肿瘤发生[25]。此外,米托坦,我们所有的ACC的药物用于治疗病人,被刺激CYP3A4的表达,可能导致减少1α25 (OH)₂D₃生物利用度,降低了VDR表达式在肾上腺10]。也有证据表明,一些短的非编码rna可能抑制VDR转录后的调控在癌症26),和他们的特定的角色VDR监管机构在肾上腺皮质肿瘤是可能的(27]。

5。结论

我们的研究的主要限制是相对较少的样本,与一个更大的ACCs研究人口需要确认我们的结果。这项研究可以使用肾上腺组织扩大银行ENSAT(欧洲网络在肾上腺肿瘤)协作小组,致力于研究和治疗肾上腺肿瘤,提供研究项目和招收研究团队这种疾病。然而,我们的研究结果代表一个协会的第一个证据之间VDR基因启动子甲基化和减少在ACC VDR表达式。这意味着一个潜在的VDR表观遗传失活在恶性肾上腺皮质肿瘤发生中的作用。肾上腺皮质癌,沉默或者激素活性,是一种罕见的肿瘤,预后很差,导致其对无线电高度侵袭性表型和明显抵抗——和化疗(28]。VDR启动子甲基化可能是治疗肾上腺肿瘤药理代理人的目标在选定的情况下(29日]。在这方面,人类的肾上腺皮质癌H295R细胞系,为ACC提供最合适的模型研究[30.),没有VDR基因甲基化(个人观察)。允许的可用性肾上腺细胞模型在体外DNA甲基化抑制剂的使用应该被解决。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Catia Pilon和安德里亚Rebellato同样这项工作。

确认

这项工作是由洋底Investimenti Ricerca迪基(FIRB) Accordi di Programma 2011年RBAP1153LS-02从教育部,大学和研究,罗马,意大利。作者感谢Vincenzo Ciminale博士有益的讨论。

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