文摘
客观的。间充质干细胞(msc)从脐带分离及其条件媒体(CM)可以很容易地获得和精制而从其他来源的干细胞。这里,我们探索的可能性,这些细胞在治疗糖尿病伤口的好处。方法和结果。延迟伤口愈合动物模型,从而建立了一个标准的背伤18 db / db小鼠,与6小鼠被分为三组:组I, II, III收到PBS, UC-MSC,分别和CM。UC-MSC及其厘米显著加速伤口闭合而接受pbs的伤口,这是最快速CM-injected伤口。在第14天伤口,三组之间的显著差异在毛细血管密度指出(;),更高水平的VEGF, PDGF和KGF表达在CM -和UC-MSC-injected伤口相比接受pbs的伤口。PDGF的表达水平β高和KGF CM-treated伤口比UC-MSC-treated伤口。结论。UC-MSC的移植和CM有益于糖尿病伤口愈合,和CM已被证明是比UC-MSC治疗更好,至少在糖尿病伤口愈合。
1。介绍
糖尿病无疑已成为21世纪的一个主要公共卫生问题。各种研究估计的影响,糖尿病,似乎数字正以前所未有的速度增长。国际糖尿病联合会声称,有3.66亿人患有糖尿病,2011年到2030年,这个数字将增加到5.52亿,而这在2011年造成460万人死亡(1]。约15%的糖尿病患者患足部溃疡(2]。难治性糖尿病伤口也与外周血流减少,经常抵抗目前的疗法。这些实现愈合率只有50%甚至最好的治疗方法,如此,短期(2,这些病例的4/5最终屈服于下肢截肢的3,4]。正常的伤口,没有潜在的病理缺陷,容易愈合,但糖尿病患者伤口的愈合缺乏可以归因于几个因素,包括生长因子减少生产和减少血管再生。间充质干细胞是多能的nonhematopoeitic祖细胞组织再生,蕴含着巨大的希望。从脐带间充质干细胞分离及其条件媒体可以很容易地获得和精制而从其他来源的干细胞。虽然移植的治疗潜力人类脐带衍生干细胞被广泛探讨作为一个有前途的工具在一些人类疾病的治疗,包括移植物抗宿主病(5- - - - - -8)、糖尿病(9,10),克罗恩病(8)、心脏病(11- - - - - -13],和固体肿瘤癌症[14,15),它对糖尿病伤口愈合的影响还没有被研究过相同的程度。
2。材料和方法
2.1。材料
2.1.1。细胞培养
隔离和脐带间充质干细胞衍生的文化。妊娠年龄的脐带(39-40周)从妇产科学系获得第三中南大学湘雅医院后正常交货。组织收集研究机构审查委员会批准的第三个中南大学湘雅医院。后被剁碎成1 - 2毫米3片段,脐带孵化了0.075%胶原酶II型30分钟,然后0.125%胰蛋白酶与温和搅拌30分钟37摄氏度。消化混合物是通过100微米的过滤获得细胞悬浊液。细胞被镀的密度1×106细胞/厘米2在noncoated细胞培养瓶。生长介质由杜尔贝科的修改鹰介质与低葡萄糖和20%胎牛血清补充谷酰胺4 ng / mL bFGF和2毫米。文化是保持在湿润的气氛中有5%的二氧化碳在37摄氏度。经过3天的文化、媒介取代,不依从细胞被移除。中修改了两次然后周之后。一旦达成了80%的融合,贴壁细胞密度的山肩1×104/厘米2脐带生长介质的扩张。UC-MSC杜尔贝科的修改的主要培养鹰中直到附近汇合(通道1)大约是一个星期。UC-MSC放大了两周的时间进程,直到第三通道,然后UC-MSC被应用于创面。
Immunophenotype分析。细胞的形态是从脐带是呈在显微镜下观测到的。表面标记包括CD29、CD44、CD73 CD90、CD105是积极的。CD34、CD45、CD31, HLA-DR是负的。细胞染色在一个标签,然后通过fluorescent-activated流式细胞术分析细胞分选仪(流式细胞仪)。
制备条件的媒体。采用无血清条件媒体是来源于培养UC-MSCs M199媒体37°C 24小时和被离心清除和集中。24小时后,上层清液收集作为0.2媒体和过滤条件μ立即使用m过滤器。
间充质干细胞:表征及其分化活动。间充质干细胞的特性进行测试,之后他们检测能够分化成不同的间叶细胞谱系包括脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞。脂肪形成的分化诱导1×10−8mM地塞米松和胰岛素5微克/毫升,液滴使用油红o染色进行治疗间充质干细胞成骨分化诱导了10−8地塞米松,10毫米beta-glycerol-phosphate, 50微克/毫升抗坏血酸,和分化细胞被茜素红染色鉴定。Chondrogenic分化培养基是由high-glucose杜尔贝科的修改鹰中补充了40微克/毫升脯氨酸ITS-plus 50毫克/毫升、丙酮酸钠100微克/毫升、GlutaMAX, ascorbate-2-phosphate 50微克/毫升、10 ng / mL转化生长因子3和1×10−8毫米地塞米松。Chondrogenic分化被阿尔新蓝染色可视化。
为糖尿病伤口愈合动物模型。十八岁男性db / db老鼠(BKS.Cg -米+ / +,db+/ db+;10 - 14周大;男性;体重()g;血糖> 16.67毫米)获得南京大学模式动物研究中心。动物被随机分为三组(每组),切除愈合模型生成。每天每交替测量血糖水平在这个实验在伤口愈合过程。葡萄糖水平仍超过16.67毫米的所有老鼠团体,也没有显著差异在三组之间的血糖水平在整个14天的实验。小鼠镇静的腹腔内政府6%的水合氯醛(4毫升/公斤体重)之前的过程。然后老鼠上刮背,全背侧皮肤缺损是背中线上创建使用6毫米直径活检评估伤口愈合。所有人道对待动物根据准则指南中提供的护理和使用实验动物,美国国立卫生研究院发布的。所有的动物都被安置在标准条件下分别。这项研究是通过制度动物保健和使用委员会第三中南大学湘雅医院。
入选标准。动物随机血糖超过16.67毫米被包括在研究。测量一式三份。
2.2。方法
2.2.1。在伤口处细胞管理
后伤口感应,每个伤口收到2.0×106细胞在60μL PBS注入皮下注射的沿边缘背伤四注射部位应用到伤口床()。条件培养基是立即执行,在每一个交替的日子里(),而同等体积的PBS对照组(管理的以同样的方式)。一个透明bioocclusive胶带(Comfeel +透明敷料)放置在伤口。皮肤上的胶带在老鼠身上测试之前,这对任何皮肤刺激或过敏反应实验,并没有。另透明敷料是改变每一天保持湿伤口条件。受伤的动物被安置在标准条件下分别。伤口愈合是评估通过测量上皮差距每两周交替的一天。一把尺子放在旁边的伤口,伤口拍摄从一个等距任意水平。然后使用图像面积计算专业优先。比例尺为1毫米。
2.2.2。愈合面积估计
愈合区域评估术后每交替的一天。在不同时间点(0、2、4、6、8、10、12和14天)受伤后,病变闭包是用数码相机记录。图像处理和分析通过跟踪伤口边缘和计算像素区域使用图像专业优先。Reepithelialization报道最初的伤口面积的比例和计算Reepithelialization比例=。一天的全层伤口完全关闭被视为完全愈合。从最初的伤口愈合面积计算区域(= 6毫米直径)和无法愈合面积每隔两周交替的一天。
2.2.3。组织学检查
全层3毫米打孔活检进行从伤口边缘后,伤口完全愈合,并被实施安乐死。每组6个样本随机检查和分析。标本在10%福尔马林固定石蜡和嵌入。部分被削减的石蜡包埋标本和与苏木精和伊红染色。苏木精和伊红染色的图像幻灯片的伤口获得最大横截面是数字,然后伤口得分(表完成1)。
2.2.4。rt - pcr分析
总RNA (1μg)从伤口中提取组织收割后14天伤口处理诱导和使用上标为互补脱氧核糖核酸合成第一链合成系统(表达载体),其中cDNA放大后用gene-specific 40周期的PCR引物,如表所示2。实时PCR进行使用Transtart绿色qPCR SuperMix UDG系统。数据分析是基于ΔΔCt与原始数据的归一化方法,管家基因,GAPDH,包括在实验。所有的反应都是一式三份。
2.2.5。免疫组织化学
伤口部分处理0.3%过氧化氢淬火内源性过氧化物酶,然后抗原表位被加热在目标检索检索的解决方案。在10%的正常山羊血清部分被封锁后,他们对待anti-von血友病因子(vWF);美国Abcam)。
2.2.6款。数据管理和统计分析
数据由SPSS 16.0软件进行了分析和提出了均值±SEM。学生的搭配以及进行配对样本的数据比较,方差分析Bonferroni紧随其后的事后多重比较执行测试来确定三组之间的显著差异。一个概率()值小于0.05的被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。UC-MSCs的移植和CM加速伤口关闭在糖尿病小鼠
移植的疗效脐带间充质干细胞和条件媒体在遗传糖尿病治愈伤口db / db老鼠是重要的(表3)。db / dbPBS的小鼠注射显示明显延迟伤口愈合。UC-MSCs及其厘米皮下注射时周围全层皮肤伤口上创建糖尿病小鼠,伤口关闭明显加速早在受伤后第四天CM-treated伤口,在第八天UC-MSC-treated受伤后伤口相比接受pbs的第14天(数据变得更加明显1(一),1 (b),1 (c))。这显著增加愈合伤口面积一直观察到第14天(厘米()%,UC-MSC ()%,PBS ()% 14天)。统计上的显著差异观察愈合率在所有组12和14天(天)。在第14天,所有6 CM-treated伤口db / db老鼠和3 6伤口UC-MSC-treated伤口完全关闭,但没有完全封闭的伤口在接受pbs老鼠()。此外,大大减少横截面积的肉芽组织中所有组14天()(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
组织学评价的伤口db / db老鼠在14天内公布在媒体条件增强组织愈合伤口(完整的上皮形成在所有6伤口检查;)与UC-MSC-treated(完成reepithelialization 3 6伤口;)或接受pbs伤口(在没有完成reepithelialization;)。伤口在14天的分析表明伤口处理媒体和UC-MSC条件增加了血管相比,接受pbs控制(图2(一个))。此外,在媒体的肉芽组织和UC-MSC-treated伤口似乎厚但面积较小。符合这些发现,伤口第14天伤口在三组的得分显著(图2 (b))。
(一)
(b)
(c)
3.2。注入UC-MSC和增加CM受伤组织的新血管形成
毛细血管密度在第14天伤口评估后对vWF免疫组织化学染色。Immunohistological染色组织切片的vWF有条件媒体处理伤口的脉管系统增加了14天与UC-MSC-treated或接受pbs的伤口(数字3(一个)和3 (b))。显著提高毛细血管密度条件媒体处理(/毫米2在UC-MSC-treated)和(/毫米2)伤口而接受pbs (/毫米2)伤口被发现(;)。
(一)
(b)
(c)
3.3。从间充质干细胞分泌因子和CM直接刺激经济增长因素可能与皮肤愈合
间充质干细胞和是否采用无血清条件媒体来自培养UC-MSCs M199媒体24小时可以通过旁分泌作用,增强血管生成实时聚合酶链反应分析进行伤口组织收获在14天GAPDH和规范化作为相对比。它揭示了更高水平的VEGF、PDGF和KGF表达在CM -和UC-MSC-injected伤口相比接受pbs的伤口。PDGF的表达β高,KGF CM-treated伤口相比UC-MSC-treated伤口。与三个独立样本得到的数据准备和表示为±SEM(图4)。
4所示。讨论
当然没有怀疑的余地创新治疗预防、缓解和/或总治愈糖尿病伤口有很强烈的需求。在这里,我们表明,派生脐带间充质干细胞在糖尿病小鼠提高伤口愈合,促进reepithelialization,旁分泌因子的分泌和新血管形成。
同基因的品系的小鼠在实验中使用。这些被认为是不朽的克隆基因相同的动物。鼠标的纯度股票可以保证一个真正的科学家,确定实验,并在实验医学今天,天生的遗传材料的使用是一样必要的使用无菌手术和防腐措施(16]。Gruneberg 1952年进一步强调使用近亲繁殖株说近交品种引入生物学可能是可比的重要性与分析天平在化学(17]。我们使用了一个变形的愈合模型遗传糖尿病db / db老鼠,已知明显受损的伤口愈合,并建立模型来研究治疗试剂对伤口愈合的影响(18- - - - - -22]。db / db与显著高血糖小鼠模型的特点是早期高胰岛素血进步随着年龄的慢慢发展中胰岛失败。这些动物展览高血糖在六周的年龄增加16.67毫米的严重性。我们的研究表明,伤口关闭明显延迟糖尿病老鼠,和脐带间充质干细胞移植显著加速伤口愈合糖尿病小鼠在这项研究。一致的发现,类似的研究中,虽然不同来源的间充质干细胞,包括那些来自骨髓(18,21],脐带血[23,脂肪组织(24),在糖尿病小鼠也加速伤口愈合。其他研究重申这些自体干细胞的疗效在伤口愈合的病人也被报道(25- - - - - -30.]。
同种异体间充质细胞是由各种路线在动物愈合模型(31日- - - - - -36];然而,最优类型还没有被很好地定义的。这些包括局部(37,38,静脉注射36],局部注射[18,31日,34,36),和系统性管理(27,37]。在大多数研究中,细胞被交付单剂量;然而,一项研究报告了研究与多个剂量(28]。没有明显的不利影响迄今为止报道的同种异体血统-骨髓细胞,尽管是有效的在小鼠糖尿病伤口愈合愈合模型(38]。此外,在一致性与我们的发现,人类脂肪组织衍生干细胞送到糖尿病(db / db)在伤口愈合老鼠显示效果,也没有不利影响39]。在研究Badiavas et al .,混合骨髓细胞的人口被用来治疗慢性伤口病人通过局部注射和局部应用生理盐水,他们国家没有指出[不良事件40,41]。剂量的变化在这些研究范围从单个到多个应用程序与剂量2×108细胞/管理。Falanga等人提出了发现剂量超过1×106细胞·厘米−2是直接关系到加速伤口关闭(28]。
间充质干细胞的免疫调节特性允许一个同种异体来源的疗法。可能的自体来源相同的缺点可以反映在相关的慢性疾病愈合的伤口,如糖尿病和自身免疫性疾病,由于骨髓细胞的异常,包括间充质干细胞(42- - - - - -46]。慢性伤口患者骨髓细胞来自显示减少增长文化相比正常同行(41),和政府的同种异体msc可以优先在这种情况下(44- - - - - -47]。健康的捐赠者的疗效同种异体间充质干细胞可能超过那些可以通过移植自体间充质干细胞来源于慢性伤口的病人。
新血管形成,新血管的形成,为了维持新形成的肉芽组织和角化细胞的生存,被认为是在伤口愈合的重要过程之一(3,48,49]。在这项研究中,我们证明MSC-treated伤口有增强毛细血管密度,这表明这些细胞促进血管生成。也发现UC-MSC和CM注入导致增加大量KGF和PDGF的伤口。PDGF -的水平β和KGF更加明显比UC-MSC-injected CM-injected伤口伤口在这项研究。事实上,血管生成的另一个重要作用是由vasculoendothelial生长因子,通过刺激血管内皮细胞增殖、迁移和组织成小管(49,50]。此外,VEGF增加循环内皮祖细胞(50]。VEGF是相对比接受pbs UC-MSC -和CM-injected伤口伤口在这项研究中。血管生成在CM-injected伤口UC-MSC相比更加明显,但VEGF的水平被发现在两组相似。VEGF水平测定在第14天伤口。一个可能的原因是,CM管理每交替的天,和它使稳定和有效的长期释放VEGF UC-MSC相比,因此,更明显比UC-MSC血管生成。
血管生成是一个复杂的过程控制的平衡proangiogenic和抗血管新生因子50]。我们的研究结果表明,UC-MSCs道伤口的释放proangiogenic因素,随后导致MSC-mediated增强血管生成。msc分化为角化细胞中发现我们的研究是类似的其他研究的结果一致51,52]。在我们的研究中,我们发现注入厘米可以加速伤口闭合,和增强甚至比这更好、更快速的通过UC-MSC移植与吴等人的结果。18),尽管他们使用MSC从不同的来源。这些结果表明,msc分化可能的一个主要角色球员在MSC-mediated皮肤的修复、再生,尽管旁分泌因子是重要的。
在我们的研究中确实存在一些局限性。人类msc交货可能会扮演独特的角色无法愈合的伤口,不能完全复制动物模型。动物模型的慢性伤口只是delayed-healing模型,与病理生理学之间的显著区别53- - - - - -55]。伤口的大小超过5厘米2在人类和持续时间超过6个月(56,57)和与年龄相关的变化和慢性疾病中常见的慢性伤口病人几乎不可能在动物研究[58]。老年患者慢性伤口更容易应对同种异体治疗这些患者由于免疫失调(59]。间充质干细胞的这些重要因素,加上固有的缺陷慢性伤口的动物模型,显示在人类更广泛调查的重要性。
有争议的数据关于msc在调节肿瘤生长的影响动物和已报告在体外模型(60- - - - - -63年]。移植细胞的致瘤性需要全面评估,尽管没有报道到目前为止,肿瘤形成UC-MSCs移植后(64年]。
我们的研究表明UC-MSCs的有益作用和CM糖尿病大鼠皮肤的再生和伤口愈合中通过血管生成和旁分泌作用。UC-MSCs和厘米代表一个定义和扩展的细胞与潜在的治疗在糖尿病的治疗伤口,使用和CM是治疗更好,至少,在糖尿病伤口愈合。
5。结论
UC-MSC的移植和CM加速伤口关闭糖尿病老鼠,甚至加速伤口愈合的速度比MSC-treated实现在CM-treated伤口伤口。分泌的因素从UC-MSC和CM直接刺激生长因子(VEGF、PDGF和KGF)可能与皮肤愈合。PDGF -β和KGF CM-injected伤口的水平明显比UC-MSC-injected伤口。注入UC-MSC和增加CM受伤组织的血管生成。厘米后的血管生成在受伤组织管理不仅仅是通过UC-MSC管理。
缩写
| CM: | 的媒体 |
| GAPDH: | Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶 |
| KGF: | 角化细胞生长因子 |
| msc: | 间充质干细胞 |
| PBS: | 磷酸盐缓冲溶液 |
| 聚合酶链反应: | 聚合酶链反应 |
| PDGF -α: | 血小板源生长因子-α |
| PDGF -β: | 血小板源生长因子 |
| UC-MSCs: | 脐带间充质干细胞 |
| VEGF: | 血管内皮生长因子 |
| vWF: | 血管性血友病因子。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
本研究从湖南省科技提供资助项目,中国(批准号2010 sk3117)。