文摘

多氯萘(PCNs)是一群organochlorinated化合物表现出类二恶英的性质。此前公布的数据显示,直接行动的PCN-rich卤蜡1051卵巢卵泡类固醇生成。考虑所观察到的生物效应PCNs可能经常副作用产生的代谢物解毒,本研究的目的是确定活动和表达的酶参与第一阶段(细胞色素P450,家庭1 (CYP1A1))和二期(sulfotransferase (SULT1A)和catechol-O-methyltransferase (COMT的))解毒代谢。Cocultures收集的性发育成熟的颗粒细胞和卵泡膜interna猪受到1 pg / mL 10 ng / mL卤蜡1051 1 - 48小时,CYP1A1水平和活动后,SULT1A, COMT的测量。剂量依赖性增加CYP1A1活动的观察和表达。高剂量的卤蜡1051 COMT和SULT1A活动被抑制和减少了蛋白质的水平。总之,快速激活期酶的同时抑制二期酶表明先前观察卤蜡1051对卵泡类固醇生成的影响可能部分源于代谢物行动发生在卵泡。

1。介绍

多氯萘(PCNs)氯化有机化合物,用于各种行业作为电容器体型,电绝缘化合物,抗火的海豹冷凝器,测量液体和润滑剂,因为它们有益的属性(1]。直到1980年代,PCNs作为副产品被合成的混合物在北美(卤蜡)和欧洲(如Nibren蜡、Basileum Seekay蜡)(2]。目前,没有商业用途PCNs [1]。PCNs已经停止生产由于其替换由更少的有毒化学物质(3]。尽管PCNs的生产已经结束,人类仍然面临PCNs通过食品消费(4- - - - - -7]。

与其他多氯二芳碳氢化合物,PCNs是亲脂性的化合物,在环境中持续存在和生物蓄积在生物组织(8]。有报告表明PCNs在脂肪组织和体液的人暴露于这些代理(6,9,10]。

尽管大量研究的各样本及其类二恶英PCNs属性,数据关于他们的行动如内分泌干扰物是稀缺的。Akerblom et al。11)表明,卵母细胞成熟的差异之间存在控制和PCNs-exposed卵巢。进一步,我们实验室公布的数据显示1051年卤蜡直接行动在卵巢卵泡类固醇生成12]。在一起,这些报告表明PCNs可以扰乱内分泌系统,从而导致生殖缺陷。

应该考虑的是,接触PCNs的影响可能是由于PCN的副作用代谢物。环境化学物质如PCNs可能更多的极性化合物在生物体代谢。例如,PCNs可以转化成羟化代谢产物(3]。细胞色素P450 (cyp)蛋白质代谢和消除扮演关键角色的外源性物质。酶属于CYP家族被称为第一阶段酶;他们monooxygenate、减少和水解各种物质,如脂类、甾类激素,和外源性物质(13]。酶表达阶段我主要在肝脏,但他们也存在于其他组织如子宫、肾上腺,胎盘,肾、脑、睾丸14]。在发表论文之前,我们表明,三个细胞色素P450 (CYP)亚型,CYP1A1、CYP1A2和CYP2B出现在猪青春期前的卵巢细胞(15- - - - - -17]。

第一阶段反应后,外源性物质可能会进一步代谢接合与指控物种如谷胱甘肽、硫酸,甘氨酸,或葡萄糖醛酸形成更多的极地产品,更有效地消除的有机体。兔子暴露一氯或dichloronaphthalenes排出70 - 90%的四天,这些化合物主要是共轭的葡萄糖醛酸(54 - 69%)和硫醇尿酸(13 - 18%)。少量的萘硫酸盐和酚醛配合也分泌(3]。二期酶表达主要在肝脏,但他们也发现卵巢。Catechol-O-methyltransferase (COMT的)是在猪和人类颗粒细胞中表达17,18)和sulfotransferase (SULT1A)是在猪卵巢中表达的17,19]。在确定的新陈代谢2,2′,4,4′-tetrabromodiphenyl醚(BDE-47)猪卵巢,Karpeta et al。17CYP2B1/2]显示快速激活,激活COMT的晚些时候,和缺乏SULT1A激活。这证实了二期酶的作用在卵巢和建议的行动之前国产羟化代谢产物解毒。

在这项研究中,我们应该确定PCNs卵巢通过检查中代谢的影响卤蜡1051期(CYP1A1)和二期(SULT1A和COMT的)酶活性和表达在培养的颗粒和鞘interna细胞。

2。材料和方法

2.1。试剂

卤蜡1051年从Koppers有限公司获得美国。股票的解决方案这个化合物溶解在DMSO溶液。最后在中0.1% DMSO溶液的浓度。帕克的介质(M199)缺乏酚红,台盼蓝,Laemmli lysis-buffer,二甲亚砜(DMSO),三、十二烷基硫酸钠(SDS),渐变20日4-nitrocatechol,山姆,3,5-diniotrocatechol, PAPS,硫酸对硝基苯,2-naphthol, 2, 6-dichloro-4-niotrophenol从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。胎牛血清(的边后卫,热灭活),磷酸盐(PBS)和Trypsin-EDTA,抗生素,抗真菌的解决方案(青霉素100 U /毫升,链霉素100μ0.25 g / mL,两性霉素Bμg / mL)获得从PAA实验室GmbH (Colbe,德国)。

2.2。组织培养

猪青春期前的卵巢得到从当地屠宰场。颗粒细胞(Gc)和外壁interna细胞(Tc)获得来自同一毛囊随后准备根据Stoklosowa描述的技术et al。20.,21]。隔离后,Gc和Tc收集和悬浮在M199中补充10%胎牛血清。细胞的生存能力在播种之前确定的台盼蓝排斥试验;可行性是60 - 75%为Gc和Tc 85 - 90%。Gc和Tc接种浓度所观察到的类似在活的有机体内(Gc: Tc, 4: 1)。文化是维持在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂为24小时允许附件。细胞培养的一个额外的1,6日,24日,或与卤蜡1051剂量的1 48 h, 10, 100 pg / mL和1或10 ng / mL。

2.3。实验的程序

确定CYP1A1活动,细胞被播种在96 -组织培养板1.5×10的浓度⁵可行的细胞每口井和暴露的测试化合物1,6日24或48小时。最后孵化,媒体被移除和细胞被洗冷磷酸缓冲盐(PBS)和存储在−70°C。

确定SULT1A和COMT的活动,细胞被播种在48-well组织培养板2.5×10的浓度⁵可行的细胞每接触的测试化合物6,24或48小时。最后孵化,媒体被移除和细胞被洗冷PBS和储存在−70°C。

检查的剂量和时间影响卤蜡1051 CYP1A1、SULT1A,转移酶蛋白表达,细胞被播种在24-well组织培养板5.0×10的浓度⁵可行的细胞/好,暴露于卤蜡1051 1,6日或48 h。孵化后,媒体被移除和细胞被洗冷PBS然后细胞溶解使用Laemmli lysis-buffer。总细胞溶解产物被储存在−70°C。

2.4。CYP1A1活动

冷冻细胞细胞溶解,当从冰箱中删除和允许解冻了10分钟。ethoxyresorufin-O-deethylase试验(EROD) CYP1A活动的具体办法,如肯尼迪和琼斯所述执行22]。的荧光转换生成的resorufin CYP1A ethoxyresorufin的测量在15分钟的时间间隔长达2 h荧光板阅读器(美国Bio-Tek FLx 800)使用530 nm激发过滤器和590海里排放过滤器。2 h后,蛋白质浓度在每一个由fluorescamine蛋白质测定(σ化工有限公司莫,美国)。结果针对resorufin校准标准曲线(0 - 100 nM)和BSA标准曲线(0 - 1000μg)。

2.5。COMT的活动

COMT的活动是衡量使用修改后的比色测定Herblin[描述23)(它使用的甲基化4-nitrocatecholas COMT的活动)的标记有以下修改。冷冻细胞解冻了10分钟。每个反应收到200μL 25μMgCl M 4-nitrocatechol, 0.01 M₂,1毫米Tris-HCl缓冲区(pH值7.0)。盘子是preincubated 10分钟37°C。然后0.2毫米S-adenosyl蛋氨酸添加和孵化一个额外的60分钟。反应被终止的1 M氢氧化钠和吸光度测量的波长520 nm使用micro-ELISA板读者(Bio-Tek仪器)。

2.6。SULT1A活动

SULT1A活动框架开发的测量使用修改后的比色测定et al。24]。这种方法是基于释放p-nitrophenol从3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate (PAPS)再生系统。冷冻细胞解冻了10分钟。每个反应包含50 mM的磷酸钾缓冲,MgCl 5毫米₂,20μM PAPS、对硝基苯硫酸5毫米和0.1毫米2-naphthol总量的250μl .消极的控制细胞培养48 h SULT1A的选择性抑制剂,2,6-dichloro-4-nitrophenol,剂量为0.5μM . 37°C的反应是孵化60分钟,然后终止的0.25 Tris-HCl缓冲区(pH值8.7)。吸光度测量的波长405 nm使用micro-ELISA板读者(Bio-Tek仪器)。

2.7。免疫印迹分析

等于样品卷通过sds - page电泳分离到PVDF膜使用Bio-Rad Mini-Protean 3装置(美国Bio-Rad实验室,Inc .)根据制造商的指示。一夜之间,屁股被孵化1:200稀释的抗体针对CYP1A1 (sc - 9828), SULT1 (sc - 27980),和COMT (sc - 25844)(从圣克鲁斯生物技术公司,CA,美国)和1:2000稀释的抗体的β肌动蛋白(A5316)(σ化工有限公司,密苏里州,美国)。一个反β肌动蛋白抗体被用作加载控制。主要通过辣根peroxidase-conjugated二级抗体抗体检测:P0447 (DakoCytomation、丹麦)β肌动蛋白稀释1:5000;sc - 2020(圣克鲁斯生物技术有限公司、钙、美国)CYP1A1和SULT1稀释1:2000;COMT稀释和sc - 2004对1:2000年,基本上根据制造商的指导方针。信号被增强化学发光检测采用免疫印迹发光氨试剂(sc - 2048,圣克鲁斯生物技术)和可视化使用ChemidocTM XRS +系统(Bio-Rad实验室)。化学发光是可视化的数据量化利用图像LabTM 2.0软件(Bio-Rad实验室)。

2.8。统计分析

每个处理重复三次()一式四份。使用GraphPad棱镜5执行统计分析。统计上显著的差异团体与不同字母表示;相同字母表示差异不显著,< b < c < d < e < f;统计上显著的差异控制和治疗组明显。所有数据()表示为平均值±标准错误的意思。

3所示。结果与讨论

3.1。第一阶段的新陈代谢

CYP1A1酶活性是使用ethoxyresorufin-O-deethylase分析化验。基底CYP1A1活动6 h(孵化(最高的值:;;;和pmol / 100μg蛋白分⁻¹后1、6、24和48 h(文化、职责)。这是按照我们去年公布的数据(17)也显示高卵泡基底CYP1A1活动6 h的文化。观察刺激影响CYP1A1活动后6 h(接触剂量的卤蜡1051(图使用1)。基底CYP1A1蛋白表达增加文化从1 h - 24 h,然后减少在48小时的时间点。卤蜡1051后1小时暴露在所有剂量的刺激对CYP1A1蛋白表达的影响。此外,只有剂量的10 ng / mL的激活CYP1A1蛋白表达保持48 h(图2)。我们先前的研究显示compound-dependent CYP1A1的时候激活的差异:速度感应的CYP1A1蛋白质PCB3(从1到48 h)比17 -β雌二醇(从6 - 48 h) [25]。

观察到的快速激活CYP1A1的影响下卤蜡1051可能是与类二恶英PCN的属性而持久激活PCB-3或17——的影响下β雌二醇与nondioxin-like测试化合物的性质。这表明,激活时间不仅取决于剂量还使用试剂的类型。

同样,EROD活动增加肝脏的少年波罗的海鲑鱼,大西洋鲑暴露于卤蜡的混合物1001年,1014年和1051年(11和老鼠的肝脏暴露于PCNs26]了。在此之前,维伦纽夫et al。27)估计的相对效能个人PCNs与2、3、7日8-tetrachlorodibenzodioxin标准通常氯取代的增加而增加,最高的大多数氯代化合物。在1051年卤蜡高度氯化PCNs存在。据我们所知,这报告是第一个显示的影响卤蜡1051微粒体酶在卵巢,表明代谢物PCNs形成局部的器官。

3.2。二期新陈代谢

第二,可能最重要的是,发现是卤蜡1051年活动的抑制作用和转移酶的表达和SULT1A。第二阶段的解毒代谢尤为重要,因为它会导致化合物的形成是通过泌尿系统中删除。在现有的文献中,没有数据显示任何PCNs二期的解毒酶的卵巢。一项早期研究(由康沃尔和块)(28)显示,代谢物的七,octachloronaphthalenes(卤蜡的主要化合物1051)缺席的尿液兔子PCNs口服后,表明这些化合物的代谢只是部分。

基转移酶活动,,0.065±0.004相对吸光度单位6后,24日,分别和48 h。的抑制作用剂量的卤蜡1051 COMT的活动曝光(图48 h后指出3)。高水平的转移酶蛋白表达在文化的控制后6 h。转移酶蛋白表达降低相对于控制6 h后暴露在100 pg / mL, 1 ng / mL和10 ng / mL,经过48小时的暴露在1051(图10 ng / mL的卤蜡4)。

COMT的广泛分布在整个动物王国,主要是与许多组织包括猪颗粒细胞的胞质分数(17,29日]。转移酶的底物包括异型生物质儿茶酚、儿茶酚胺和苯邻二酚雌激素。已经表明,暴露在2,2′,4,4′-tetrabromodiphenyl醚(BDE-47)增加COMT的活动24和48 h后没有对蛋白表达的影响,以ELISA和免疫印迹分析。这表明亲水methoxylated可能在卵巢局部形成苯醚。没有以前的数据的影响卵巢卤蜡1051 COMT的活动;然而,埃尔南德斯等人。30.)显示,怀孕的大鼠产生COMT的抑制动脉高血压和内皮功能障碍由于减少一氧化氮的生物利用度。此外,洛杉矶美林et al。31日]表明,暴露在2、3、7日8-tetrachlorodibenzodioxin COMT表达式在小鼠乳腺,降低激素依赖性组织也。因此,本文结果与先前的报道是一致的,表明亲水methoxylated PCNs不是形成于卵巢。

基底SULT1A活动是,,相对吸光度单位后6、24和48 h,分别。卤蜡1051 SULT1A活动的抑制作用是著名的在每个剂量和时间点。的最强效果观察混合后6 h的暴露剂量从10 pg / mL 10 ng / mL(图5)。基底SULT1A蛋白表达之间的区别1和6 h(文化但48 h后减少文化。SULT1A蛋白表达下降后只有6小时的孵育10 ng / mL卤蜡1051(图6)。

SULT1A是最丰富的sulfotransferase;它有一个广泛的底物特异性和广泛的组织分布32]。几个SULT1A硫酸亚科成员导致内源性底物的结合,如甲状腺激素17β雌二醇,以及外源性化合物包括外源性物质(33,34]。硫酸结合通常导致减少的生物活性和增加亲水性化合物,促进排泄。正如前面提到的,先前的研究表明,兔子可能排出70一氯或dichloronaphthalenes摄入的90%。不幸的是,没有后续研究关于PCN激活的酶参与代谢解毒的第二阶段。然而,一些研究表明,多氯联苯等外源性物质可能抑制SULT1A活动(35]。如COMT的活动的情况下,没有先前的报道卤蜡的影响1051年卵巢SULT1A活动。考虑到硫酸接合的外源性物质通常会降低其毒性,我们建议这个通路的抑制可能导致长期暴露于复合卵巢功能的卵巢和随后的混乱。

4所示。结论

第一阶段的激活酶(CYP1A1)和抑制二期酶(SULT1A和COMT的)确认PCNs类二恶英的特性。快速激活的酶参与第一阶段和并发抑制酶参与二期新陈代谢表明卤蜡1051的观察效果可能部分源于代谢物在卵泡形成的作用。

承认

这个工作是由K / DSC / 000884/2012,克拉科夫,波兰盖隆大学,。