文摘

糖尿病是一种常见的内分泌紊乱的特点是高血糖导致非酶的糖化蛋白,负责慢性并发症。质谱技术的发展能给在蛋白质组学领域高度特定的和可靠的结果是医生的广泛兴趣,给他们新的工具来监测疾病进展和可能出现的并发症与糖尿病有关,以及治疗治疗的有效性。本文报道和讨论了相关的一些数据获得的蛋白在糖尿病患者糖化matrix-assisted激光解吸电离(MALDI)质谱(MS)。进行了初步研究在体外蛋白糖化试验显示明显差异糖化和unglycated蛋白质的分子量。然后,注意力都集中在血浆蛋白人血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(免疫球蛋白)。酶的降解产物在体外研究了糖化HSA来模拟在活的有机体内酶消化糖化物种的免疫系统导致高活性先进的糖化产物肽(年龄)。进一步的研究评估了糖化Apo -ⅰ和糖化血红蛋白水平。不同的谱方法用于尿液样本的识别标记的疾病健康,糖尿病,nephropathic, diabetic-nephropathic科目。

1。介绍

糖尿病通常被视为一种疾病与葡萄糖dysmetabolism有关。特别是,1型糖尿病是一种慢性疾病相关的代谢碳水化合物,脂肪,蛋白质,由胰岛素缺乏引起的。它的结果标记和进步的胰腺分泌胰岛素,由于自身免疫性破坏β细胞。另一方面,2型糖尿病是由胰岛β细胞不能分泌足够的胰岛素来响应不同程度的营养过剩,缺乏运动,肥胖和胰岛素抵抗。如今,糖尿病是巨大的负担,因为它增加全球患病率和慢性并发症的发生影响了许多组织(视网膜病变、肾病、神经病变、心血管疾病)反映在直接和间接成本高1]。

这种观点可能被还原,考虑到之前的副作用机制在系统层面上,而且,考虑到高生物环境的复杂性,它必然反映了大量的不同病理通路,由葡萄糖dysmetabolism催化。在这种背景下,考虑到美拉德反应模式(2),蛋白质似乎乍一看葡萄糖分子的目标循环在糖尿病、高水平,只有一些论文给了矛盾的结果的反应性糖对DNA (3,4]。

蛋白质和糖之间的非酶的反应(主要是葡萄糖和果糖)导致糖化蛋白质,取决于数量的葡萄糖分子凝聚,会表现出不同的功能。这方面可以被视为一个基本原理激活的新疾病。作为一个例子,考虑人血清白蛋白(HSA)的角色作为运输蛋白,在其广泛的糖化,活动网站负责这个函数不会仍然可用,这种蛋白质的活动将会受损。同样的可以被认为是免疫球蛋白,在immunosystemic层面发挥着基础性的作用。这两个例子得到,因为我们在几年前,这些方面调查和相关数据(将在稍后讨论5,6]。这些一般考虑是一个很好的起点认识到糖尿病领域的蛋白质组学研究的重要性。本文获得的结果matrix-assisted激光解吸电离质谱(MALDI-MS)糖化蛋白的研究报告和讨论,目的是给描述的限制和技术的力量。

2。蛋白质组学质谱的研究

蛋白质组学古典的方法通常包括分离的生物基质中包含的不同的蛋白质,分离蛋白质的消化,消化产品的质谱分析。当然具体是质谱的方法,有效的结果感兴趣的蛋白质的结构鉴定(7]。对于这个目标,两个不同的路线可以遵循。第一个是化学方法,基于质子化了的分子种类的选择(胰蛋白酶消化产品)和片段通过碰撞现象的研究(MS / MS) [8]。第二种方法是基于精确的物理测量大量的前体离子或其碎片化产品(9]。获取蛋白质识别,这些数据用于与蛋白质数据库的交互。MS-Fit、MOWSE Prot-ID Expasy工具和肽搜索的数据库搜索程序,可以用来识别蛋白质被酶消化(8,10]。查询中肽的分子质量是匹配理论由peptide-mass值在网上消化的蛋白质数据库中的条目的具体实验步骤中使用的蛋白酶。在一个典型的搜索算法,经过选择的乳沟数据库,数据的标准搜索(物种,mass-matching宽容,近似上蛋白质的分子质量的价值,π值的蛋白质,最小数量的匹配,乳沟网站错过了酶消化和cystein类型修改)定义。考虑到实验得到的列表肽的值,搜索的输出给出了最有可能的候选人名单。得分最高的序列概率最高个别化感兴趣的蛋白质。可以增加搜索的选择性保持mass-matching容忍度低(< 3 ppm)和增加质量测量精度(±0.5 Da),要求更容易通过收购数据会见了延迟开采飞行时间质谱(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)。吉祥物和SEQUEST反而是最广泛使用的搜索算法来识别蛋白质的基础上MS / MS离子数据序列(10]。在这些搜索引擎,碎片离子观察到的模式匹配与碎片离子模式计算理论上从数据库条目。SEQUEST算法简化了MS / MS谱,确定了数据库中的氨基酸序列的测量质量选择肽离子,并预测预计分裂模式,为每一个序列。进行傅里叶变换光谱,和每个虚拟频谱匹配实验观察到MS / MS谱产生互相关的分数。

在我们的研究中,我们通常采用一种不同的方法,根据分子量的测定糖化蛋白及其与unglycated的比较。在一开始,我们针对性关注循环蛋白质容易获得,我们雇用MALDI-MS,由于它能够提供一个直接的信息分子的物种,即使在复杂的混合物。

3所示。研究在体外蛋白糖化

第一个工作基于此方法进行了90年代初,当时,MALDI-MS糖化蛋白质研究的有效性必须证明。出于这个原因,进行了一系列的初步调查在体外不同糖化蛋白质(11- - - - - -14]。典型的这种方法获得的结果在图1。培植了牛血清白蛋白(BSA) pseudophysiological条件(磷酸盐缓冲剂0.05,pH值7.5,37°C)与葡萄糖浓度(2米),观察到明显增加了平均分子量通过增加培养时间(0、7、14、21、28天),证明葡萄糖的发生凝结的蛋白质。它必须考虑,根据美拉德反应通路,这个质量增加葡萄糖缩合之间是一个平衡的结果ε属于蛋白质链的氨基酸赖氨酸组和活性物质的释放反应的中间步骤。

4所示。研究在活的有机体内糖化蛋白

一旦有信心实现结果的有效性MALDI-MS,我们的注意力集中在HSA和免疫球蛋白G(免疫球蛋白)的糖尿病患者。对于这个目标,三个不同的人口的主题(均匀在年龄和性别):8名健康受试者(平均年龄±标准差(SD) 57±9年),八个控制,非胰岛素依赖,糖尿病患者(平均年龄60±12年,意味着疾病持续时间13±9年),和十四个不好控制,非胰岛素依赖糖尿病患者(平均年龄63±7年,意味着疾病持续时间12±8年),被认为是。在最后两个情况下,大规模增加分子物种与HSA和免疫球蛋白的观察,这样的增加()很容易与最小数量的葡萄糖分子()浓缩蛋白(15,16]。考虑到葡萄糖分子缩合导致大量增加162哒。可以通过计算。强调代表了最小数量的葡萄糖分子:事实上,如图所示通过美拉德反应模式,浓缩葡萄糖分子可以接受一系列的脱水/氧化反应导致物种较低的分子量。在图2,获得的数据在HSA前人口相比获得的“经典”代谢控制参数为空腹血糖,糖化血红蛋白,furosine(表1)。在严重的情况下控制患者,大量的葡萄糖分子浓缩蛋白质从4到15。同样的方法应用于研究免疫球蛋白糖化,而且,在严重的情况下控制的糖尿病患者,大量的葡萄糖分子从在场(图7日至28日3)。

乍一看很明显的是,尽管常见的代谢控制参数的值是相当统一在每个类的主题,在吗通过质谱测量值,组内变异存在。这些结果可以用假设来解释两种不同的发生机制:第一个显示不同subject-depending蛋白酶活动在某些情况下会导致快速糖化蛋白质消化;第二个可能表明存在,对一些病人来说,酶系统能够扭转非酶的糖化反应。在这个框架,果糖胺3-kinase基因位于染色体17 q25.3和组织六个外显子,编码一个34 kDa蛋白质表达的每一个人体组织和糖尿病最大的表达式是敏感的器官,如肾脏、心脏和神经组织17]。这种酶参与的反向非酶的糖化磷酸化fructoselysine残留物,fructoselysine-3-phosphate (FL3P)为代价的ATP (18];这种情况会使fructos-amine连接不稳,导致自发分解FL3P赖氨酸,3-deoxyglucosone,无机磷酸盐(19]。很少有研究报道关于FN3K及其酶活性的遗传变异;Delpierre和同事报道之间的关联红细胞FN3K酶活性和一些用比利时族群FN3K基因的多态性(20.]。然后,c多态性。900 C/G (rs1056534) located in exon 6 and lower HbA1c levels in type 2 diabetes patients have been shown together with a tardive onset of the disease [21]。最近的研究已经确定了两个新的突变与2型糖尿病和女性性别;此外,附加在FN3K基因变异在这里添加新的有用的信息报告给FN3K在糖尿病的可能的作用22]。不幸的是,果糖胺3-kinase不是受试者在研究中,基因分型的,因此必须考虑前面的理由只有合理。

5。识别提高糖化最终产品(年龄)肽

糖化蛋白被认为是免疫系统的一个“无用”的物种,因此其酶消化被激活。它必须考虑这一过程级;事实上,糖化蛋白更难以消化,由于浓缩葡萄糖引起的立体效果,不允许酶作用于蛋白质链。此外,所释放出来的糖化肽消化(称为年龄肽)表现出高反应活性对其他循环或组织蛋白质,导致结构修改更严重比简单的葡萄糖。研究这方面的一系列调查进行了准确的质量测量得到的傅里叶变换质谱(英尺分)的酶消化产品(23]。之间的明显差异观察消化糖化和unglycated血清白蛋白的混合物,在前一种情况中,可能的糖化肽属于年龄肽阶层中被确认。作为一个例子的力量这个方法,这两种混合物的光谱图4,高度准确的质量值测定,肽原始HSA的消化和糖化HSA已确定(见图5)。

在进一步的研究中,MS / MS实验进行肽混合物通过HSA和glycated-HSA两种不同酶的作用[24]。这个调查可以建立最有特权糖化HSA的网站^235年K,^276年K,^378年K,^545年K,^525年k .这些实验数据是在良好的协议与部分溶剂可及表面值计算分子建模(图6)。同时,在这种情况下,得到肽图(图7),在协议与实验和理论数据。

6。调查血红蛋白糖化过程

考虑到高特异性研究获得的数据在活的有机体内糖化HSA和免疫球蛋白,进一步调查处理在活的有机体内糖化血红蛋白。糖化血红蛋白水平通常用于评估意味着糖化水平出现在主题。实际上,考虑到血红蛋白的半衰期是120天,测量糖化血红蛋白能提供有效信息“糖化压力”主题在蛋白质经历的生活。的氨基酸组链被认为是,的基础上在体外实验中,最被动的网站,因此测量糖化血红蛋白水平被认为是与糖化水平有关球蛋白。对于这个评价,色谱程序能够独立的糖化和unglycated球蛋白已经发展和目前用于测量的糖化水平被认为是什么球蛋白(糖化血红蛋白)。然而,它是强调色谱条件用于临床试验无法分开的两个球蛋白(和)。当球蛋白分数患有糖尿病的受试者被谱分析(25- - - - - -28),除了由于质子化了的信号和球蛋白(在15126年和15866年,分别地),确定进一步的山峰更高质量价值观,展示的糖化和glycoxidation的发生和球蛋白。糖化水平很容易计算的相对丰度的峰值对应于糖化和unglycated物种。因此,相反的是通常认为,球蛋白都糖化,因此糖化血红蛋白值有一定的含义不同于通常被认为是正确的。事实上,当糖化血红蛋白值测量的高效液相色谱方法绘制的糖化水平球蛋白通过MALDI二十健康受试者(平均年龄±SD: 58±5年,空腹血浆葡萄糖值:90±4毫克/分升;糖化血红蛋白值:5.5±0.5%)和三十非胰岛素依赖糖尿病患者(平均年龄±SD: 63±6年;意味着疾病持续时间±SD: 12±5;空腹血浆葡萄糖值:196±67 mg / dL;糖化血红蛋白值:8.8±1.7%),获得一条直线不通过原点(图8(一个)),证明不仅仅是由于糖化血红蛋白值球蛋白糖化。最好的线性关系(图8 (c))已经被策划获得糖化血红蛋白值的总水平,获得的MALDI,糖化和glycoxidated和球蛋白。山峰由于nonglycated和简单的糖化球蛋白和那些由于糖化/氧化物种是定义良好的。其中是一个球蛋白含有乙二醛一半()15921哒。然而,有一些明显的差异不同的病人。尽管糖化- - --globins在场,高数量的glyco-oxidated分子也可检测,包括物种球蛋白+ 5-hydroxymethylfuran (15225 Da)。这些结果与报道的数据一致Hempe和同事(29日),假设的存在高、低血红蛋白糖化表型。我们的研究结果表明,不同的对象有不同的倾向于氧化过程发生后球蛋白糖化。为了进一步探索这个概念,二十2型糖尿病患者有无慢性并发症的可能关系进行了研究评价MALDI / MS获得的信息和实际的临床状况28]。有趣的是,临床慢性并发症的存在与否影响线性回归直线的斜率。我们建议患者观察之间的差异和没有临床并发症也由于不同的个人倾向氧化(观察糖化)和/或不同的氧化动力学行为和环境因素有关。

7所示。研究脂蛋白Apo -ⅰ的糖化

脂蛋白Apo -ⅰ构成70%的高密度脂蛋白和载脂蛋白内容作为受体的转会从外围组织磷脂,它传输的排泄胆固醇在肝脏和其他组织和类固醇生成。它可能糖化在原则上会损害其功能,激活动脉粥样硬化血管疾病。动脉粥样硬化血管疾病是糖尿病的主要并发症,以及已知的动脉粥样硬化的风险因素,(如高脂蛋白血症、肥胖、高血压、高胰岛素血和炎症),低水平的高密度脂蛋白发挥重要作用。Apo -ⅰ的转译后的修改可能由于非酶的糖化过程被MALDI-MS调查和2 d-gel电泳(30.]。池控制样本、糖尿病和nephropathic受试者首先分析2 d-gel电泳,和一些有趣的结果,总结在图9获得的。三组之间的显著差异明显的3 d视图可视化领域的兴趣。可以很容易地观察到,而在健康受试者中几乎只有一个峰值出现在3 d图,在糖尿病和nephropathic病人的情况下,三种不同的山峰显然是检测在同一个地区。差异表达的酶消化点其次是谱分析显示统计的信心(高值从3.6×10⁻²⁴1×10⁻⁷),点1和2对应Apo -ⅰ和现货3 retinol-binding蛋白质(RBP),表明这些蛋白质的重要过度检查的病理情况。强调,在文献中关于有争议的角色RBP在胰岛素抵抗和糖尿病的发展。在研究人类肥胖RBP-4 [31日),结果表明:循环RBP-4水平相似的正常体重,超重,肥胖女性,而在脂肪组织,它与过剩4的表达呈正相关。在进一步研究[32]在应对短期RBP4浓度过量食物在正常体重,超重,肥胖男性,两组之间没有差异被发现,而且基线RBP4负相关,变化在正常体重者的胰岛素抵抗。

特别是,点2的酶消化其次是谱分析和评估数据显示,这种蛋白质对应于糖化Apo -ⅰ,出现在一个小得多的程度上还在正常的受试者。Aldente精深及工具被用来识别消化蛋白质分析,同时该算法GlycoMod糖化肽是用来确认修改。修改后的肽序列经postsource衰变(PSD)的方法(33]。尤其是网上检查软件,基于标签排序方法,用来从PSD碎片光谱获得肽序列。每个修改序列被分配的统计分数,表达价值,所提供的软件。糖化网站已分别被消化的分析碎片。在位置2的情况下,新mono - diglycated肽是证明(质量精度4至58 ppm),证明的发生在活的有机体内糖化过程,证实了MS / MS。这些数据表明,在糖尿病和nephropathic受试者血浆样本,糖化Apo -ⅰ存在于一个比较丰富的unglycated蛋白质。此外,考虑到等量的血浆样本,unglycated和糖化蛋白过表达在这些组与对照组相比。获得的数据表明,Apo -ⅰ的评价,糖化Apo -ⅰ,RBP可以被认为是一个有效的诊断工具来评估糖尿病患者的代谢状态和/或肾病。事实上,虽然糖化Apo -ⅰ水平可以与glyco-oxidation应力相关经验的病人在半衰期蛋白质,蛋白质的功能容量的变化由于糖化必然反映出不同的胆固醇运输效率。这方面可能会提供一个理论基础在考虑一些长期糖尿病并发症。观察强调,这一趋势对于终末期肾病患者,来自由不同机制与糖化Apo -ⅰ间隙的效率。这些结果可以解释macrovascular疾病的发生这两种类型的病人。RBP水平的增加的病人必须与两种不同的机制,典型的一种疾病。糖尿病,肥胖的人可能占RBP的过度表达,而在肾病患者的情况下,它可以与受损排泄管损坏。

8。在慢性肾脏疾病生物标志物评估

肾脏疾病是一个慢性糖尿病并发症计数的广泛的社会和医学订婚。它代表了所有西方国家的一个主要医疗问题(34]。蛋白尿是一个著名的预测糖尿病的肾脏疾病进展的标志(35,36),目前用于监测这些患者的肾功能。然而,一些对其敏感性和特异性(存在争议37,38]。然后,新分析方法的开发有效地监测肾功能无疑是广泛的兴趣,给医生新的生化信息可能的病理机制和/或开发。早期识别风险的病人发展肾并发症可能是重要的为了应用医学干预能够防止疾病的进一步发展(39),从而节约的生活质量和避免成本相关的终末期肾脏疾病的治疗,可以发生在这些病人。最近,饶等人识别进行了广泛的研究,可能的生物标志物的蛋白质组学方法,糖尿病肾病(40]。对于这个目标,收集尿液样本来自33个科目2型糖尿病患者微蛋白尿水平不同和从9健康对照组。分析方法是经典:尿蛋白受到二维微分为胶液电泳(消化),沾Coomassie蓝色。个别地方被剪切了凝胶,厌恶嫌弃,用胰蛋白酶消化。分析了胰蛋白酶的肽通过LC / MS / MS (quadrupole-time飞行(Q-TOF))。由Protein-Lynx全球服务器获得的数据进行了分析新创测序使用峰值算法结合OpenSea对齐算法。这种方法鉴定了195个蛋白质斑点代表62独特的蛋白质。他们属于不同的官能团(如细胞发育、细胞组织的新陈代谢,转导,和国防响应)。比较对照组和糖尿病患者的证据不同的几个蛋白的表达。特别是通过现货卷量化,七个蛋白上调增加蛋白尿和四个蛋白表达下调与它被发现。

最近,一种不同的方法,毛细管电泳(CE),已被证明是非常具体和有效的对这种调查。毛细管电泳与质谱(及其联用)允许特定尿肽生物标志物的鉴定的慢性肾脏疾病(CKD)。在最近的一项多中心研究[41),从230年609份尿液样本各种biopsy-proven半散装患者和379名对照分析了使用特定生物标志物及其联用建立CKD模式组成的273尿肽。这个模型被验证在被测试的280个样本产生敏感性97.8%,特异性85.5%。大部分的CKD生物标记肽胶原蛋白被发现的碎片,uromodulin,一些不同的血蛋白(40]。

一种不同的方法被用于同样的目的,基于分子识别的物种通过直接分析,也就是说,没有他们的胰蛋白酶消化(42]。尿液样本10 2型糖尿病患者,10例患者肾疾病,影响十糖尿病患者肾脏疾病影响,十健康对照组进行评估通过一个简单的样品处理和谱分析的低分子量肽概要文件。多变量分析建议的可能性考虑患者组之间的区别(图10)。特别是一些差异被发现在三种离子的相对丰度1912、1219和2049(见图11)。由于这些原因,进一步调查是由MALDI TOF / TOF来确定这些肽的序列,因此,以个别化的可能来源。通过这种方法,肽1912被发现源自uromodulin,其低表达在肾病的情况下可以与病理条件。离子在2049年和1219年起源于胶原alfa-1 (I)链前体和胶原蛋白alpha-5 (IV)链前体,分别,同样,在这种情况下,不同的表达式可以相关疾病进行调查。同时,这些数据似乎表明,尿液是一个有趣的生物流体调查肽概要和获取,因此,信息dysmetabolism激活特定的病态。

最近,我们比较的性能及其联用和MALDI-MS检测慢性肾病(43),基于一个群137份尿液样本(62例病例和75例对照)。建立了两个平台之间的数据相互比较的检测生物标记物。结果显示及其联用方法的性能优越的肽分辨率和疾病预测准确率。然而,数据也证明的能力MALDI-MS方法分离CKD患者控制,稍微降低精度,但显著降低了成本和时间。因此,可以预见到一个实际的方法,采用MALDI-MS作为廉价,快速、健壮的检测工具检测可能的慢性肾病。在第二个步骤中,高分辨率及其联用可用于对CKD患者只取得了积极MALDI-MS分析,降低成本和时间的计划。

9。结论

本文中报告的数据表明,MALDI-MS可以被认为是一个有效的分析工具来研究蛋白质的糖化过程发生在活的有机体内相关条件,这在高葡萄糖浓度的糖尿病。糖化蛋白显示一定是不同的功能,因此糖化水平可以给长期占糖尿病并发症。应用于生物流体时,方法允许评估存在的糖化或氧化压力和确定特定疾病的生物标记物。