文摘
背景。我们之前发现组基因的表达上调多囊卵巢通过使用微阵列。它建议,可能是一个有吸引力的候选人监管机构参与的病理生理学多囊卵巢综合征(PCOS)。在这项研究中,被调查的组蛋白表达和细胞定位在人类卵巢多囊和正常。方法。卵巢组织,六个正常卵巢多囊性卵巢和六个,收集在变性手术和外科治疗同意书上签了字。通过免疫组织化学方法观察组蛋白的细胞定位。组蛋白的表达水平被免疫印迹分析。结果。组蛋白主要表达在人类卵巢卵泡膜细胞和卵母细胞在PCOS卵巢组织和正常卵巢组织。多囊性卵巢的组蛋白表达水平三倍高于正常卵巢。结论。是在正常卵巢多囊卵巢多。结合本地化的鞘细胞,可能参与调节卵巢雄激素生物合成和在PCOS雄激素过多症的病理生理学。
1。介绍
多囊卵巢综合征是最常见的一种生殖内分泌紊乱,影响约5 - 10%的绝经前女性和女性患上无排卵性不孕症的占75%1,2]。多囊卵巢综合征的特点是雄激素过多症,慢性停止排卵,卵巢多囊[1]。它与循环游离睾酮水平升高有关,生产主要在卵巢(3,4]。患多囊卵巢综合征的女性,卵巢卵泡膜细胞被认为是过多的雄激素生物合成的主要来源之一,它是与几个steroidogenic酶的表达增强有关,如细胞色素P450c17 17α羟化酶和C17 20裂合酶的活动5,6]。除了P450c17,调节酶还包括细胞色素P450胆固醇侧链劈理(P450scc)编码的CYP11A基因(3]。尽管一些集体研究确定重要steroidogenic增加酶基因表达之间的相关性和增加雄激素生物合成在PCOS鞘细胞(7,8),准确的分子和细胞机制尚不清楚。
我们先前的研究评估了差异基因表达在人类正常和卵巢多囊使用互补脱氧核糖核酸微阵列技术,发现许多基因表达差异在PCOS [8]。集(病人“易位”)是一个改变基因,多囊性卵巢上调。它最初被确定为转移基因在急性未分化的白血病9]。的一组蛋白质,也称为TAF-1β(10- - - - - -12],I2PP2A [13],INHAT [14),属于一个家庭的多任务处理蛋白参与细胞凋亡,转录,核小体的组装,组蛋白绑定。我们不知道什么作用(s)设置在卵巢类固醇生成的规定,设置是否能使一个有吸引力的候选人参与PCOS的雄激素过多症。
在目前的研究中,我们首先研究了组蛋白的细胞定位在人类卵巢和卵巢多囊的不同的表达与人类相比正常成年女性的卵巢。它将为我们提供初步知识在卵巢雄激素生产的监管和一个基本在PCOS的雄激素过多症的病理生理学机制。
2。材料和方法
2.1。卵巢样品和道德
卵巢组织,正常成人多囊性卵巢,卵巢和样品收集在变性手术和外科治疗同意书上签了字。PCOS患者招募的修订标准的欧洲人类生殖及胚胎学会/ 2003年美国生殖医学协会:(I) oligomenorrhoea和/或停止排卵(8个或更少的月经周期在一年或月经周期长度超过35天);(2)临床和/或生化雄激素过多症的迹象;多囊性卵巢和(III)在超声波(存在12个或更多在每个卵巢卵泡测量2 - 9毫米直径和/或增加卵巢体积> 10毫升)和排斥其他目的(如先天性肾上腺增生,androgen-secreting肿瘤,和库兴氏综合征)。患者没有接受激素治疗或停止它至少3个月前操作。
控制是健康的女性,有规律的月经周期和没有家族史的多毛症。这些女人没有多毛症的证据,粉刺,或内分泌功能障碍。激素治疗前至少3个月被撤销操作。
PCOS组标本的年龄匹配的对照组。所有样本组织学检查和储存在液氮免疫印迹和免疫组织化学染色石蜡包埋。本研究机构伦理委员会批准的南京医科大学第一附属医院。
2.2。免疫组织化学
卵巢组织石蜡包埋切片(5μ米)。组蛋白的检测是由一个两步包含IHC过程和主要的多克隆抗体(Abcam剑桥科技园,剑桥,英国)被稀释1:400。免疫组织化学染色消极的控制同时被执行死刑,其中主要的抗体免疫球蛋白。
2.3。免疫印迹分析
从卵巢组织中提取蛋白质的浓度是衡量布拉德福德的方法。等量的蛋白质被加载和12% sds - page分离,然后electroblotted到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad大力神,CA)。膜是孵化与多克隆抗体集(1:1000年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)。与TBS三次洗涤后,细胞膜是孵化HRP-conjugated二级抗体然后孵化βABCAM -tublin(1: 2000年,剑桥科技园,剑桥,英国)。与TBS三次洗涤后,孵化与HRP-conjugated二级抗体(1:1000;北京中山生物技术、中国)和检查增强化学发光(Amersham生物科学,乌普萨拉,瑞典)。
2.4。统计分析
数据表示为均值±SEM从六个独立的两组实验。单向方差分析是用于统计比较。价值观决定是重要的。
3所示。结果
3.1。细胞定位组蛋白在人类卵巢
在我们的研究中,所有的PCOS患者,年龄从26日至31日,应用囊括月经周期异常(闭经或月经过少),卵巢多囊,雄激素过多症(多毛症和/或血清T水平> 2.43 nmol / L)。控制女性,年龄在27日至29日,健康状况都很好。确定组的细胞定位蛋白质在人类卵巢,免疫组织化学分析。(图所显示的结果1),主要表达在鞘细胞和卵母细胞在PCOS卵巢组织(数字1 (b)和1 (e))和正常卵巢组织(数字1 (c)和1 (f))。没有检测到信号负控制(数字1(一)和1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。多囊性卵巢组蛋白的表达
不同的组蛋白表达在正常卵巢多囊卵巢和被免疫印迹检测。蛋白质样本提取六卵巢的正常受试者和PCOS患者。微管蛋白作为内部控制。如图2多囊的卵巢中,组蛋白的表达在正常卵巢(三倍)。
(一)
(b)
4所示。讨论
卵巢卵泡膜细胞雄激素生物合成是由steroidogenic酶。众所周知,鞘细胞表达P450scc, 3β-hydroxysteroid脱氢酶(HSD3B2)和P450c17 17α羟化酶和C17 20裂合酶的活动。所有这些都是雄激素合成的关键酶。我们发现组蛋白主要表达在人类卵巢的卵泡膜细胞和卵母细胞组织(图1)。这是与之前的研究结果相一致,Zhang et al。15显示设置是表达膜细胞和卵母细胞的老鼠。由于膜细胞的主要功能是产生雄激素,鞘细胞中表达表明集合可能参与雄激素生物合成。
设置最初确定为转移基因在急性未分化的白血病9]。这是39 kDa磷蛋白质广泛表达于各种组织,特别是在steroidogenic细胞在中枢神经系统内,肾上腺和性腺(11,16]。转录调节因子,设置不仅产生函数绑定到转录辅活化因子CBP / p300 [12),但还可以直接作为转录因子P450c17 [16]。SET-mediated发起人hypoacetylation是可敬的前提条件coactivation PRMT1过量pS2基因的(17]。最近的证据表明,为调节至关重要的启动子活性CYP17 P450c17的生物活性。在人类NT2神经元前体细胞和MA-10细胞,设置绑定到老鼠P450c17启动子在399−418 /−及其基底转录激活从一只老鼠P450c17荧光素酶报告质粒15,18]。设置已被确认为一种蛋白质磷酸酶的有效抑制剂2 (I2PP2A)。组通过对催化亚基结合,抑制PP2A活性PP2Ac通过氨基末端域(I2NTF;aa 1 - 175)和羧基终端域(I2CTF;aa 176 - 277) (19]。可以促进17日20裂合酶活性P450c17通过抑制PP2A的去磷酸化作用在P450c17 NCI-H295A细胞(20.]。所有这些表明,在steroidogenic设置调节雄激素合成细胞通过调节P450c17和CYP17的转录和转译后的水平。在鼠标需要鸡蛋PP2A继续从减数分裂中期逮捕和成功的退出21),建议设置可能参与卵母细胞成熟。然而,组蛋白在人类卵巢的功能调节雄激素生产和卵母细胞发展应进一步研究。
PCOS患者体内的雄激素过多症是中央缺陷(22),增加相关的表达steroidogenic酶和雄激素生物合成的增加(23,24]。我们之前的研究表明,组蛋白是由微阵列分析不同多囊性卵巢中表达(8]。在这项研究中,发现组蛋白主要表达在人类卵巢组织的外壁细胞和卵母细胞免疫组织化学(图1)。和表达的多囊性卵巢组蛋白被发现三倍在正常卵巢免疫印迹(图2)。结合CYP17 / P450c17上设置的影响,设置可能参与调节雄激素生产膜细胞,和卵巢多囊升高组蛋白可以增加P450c17 CYP17和活动水平,导致部分雄激素在鞘细胞的增加产量。进一步的研究需要检查是否以及如何设置在鞘细胞过度导致PCOS的雄激素过多症。
总之,组蛋白主要表达在鞘细胞,这表明组蛋白可能参与调节雄激素生产卵泡膜细胞。在多囊蛋白表达的增加卵巢组织可能是一个潜在的机制在PCOS的雄激素过多症的病理生理学。
确认
这项工作是支持的项目从中国973项目(2012 2012 cb944703 cb944902)和中国国家科学基金会(81070465)。作者感谢王义芳给出博士,生殖生物学生殖医学的单位和部门,渥太华卫生研究所,加拿大,帮助他们修改英文摘要。