文摘
经皮vertebroplasty (PVP)是广泛应用于痛苦的治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的注入PMMA水泥、和争议PMMA骨质疏松骨组织损伤影响骨折修复永远不会停止。72老女兔子,每个年龄3.0 ~ 3.5 y,兔子被随机分配到两个组,每组36;PMMA水泥注入椎体在兔子通过模仿PVP,牺牲在1 h, 24 h, 3 d, 7 d, 4 w, 12 w。表达VEGF和胶原蛋白I型,组织反应,反应和修复的PMMA板和骨组织界面与rt - pcr和免疫印迹技术动态观察;通过免疫组织化学方法研究骨钙素的表达。与对照组相比,胶原蛋白的表达我增加1小时,24小时到3 d高。从4周注射PMMA后12周。VEGF的表达减少1小时和24小时,在3天显著增加,减少再次在7天,然后在4 - 12周显著增加。骨钙素的表达继续增加在4到12周。PMMA不会引起局部永久坏死,骨界面损伤修复周期可能会延长vertebroplasty。
1。介绍
经皮vertebroplasty (PVP),一个持续的发展过程,是目前广泛应用于痛苦的治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的注入有机玻璃(PMMA)水泥,这是公认的最在临床手术造成的影响立即止痛,生物力学功能重建,和低廉的价格,而PMMA也谴责相当好的骨头兼容性和组合1- - - - - -4]。然而,研究仍在进行开发更好的可注射骨增强材料和生物降解或生物活性骨“贴”[5,6]。大多数研究人员认为疼痛是通过机械支持和稳定提供的骨水泥。半固体的混合物的PMMA,单体聚合的丙烯酸水泥反应,放热反应导致细胞毒和突变毒性在根尖周的组织(7,8]。同时,自vertebroplasty首次用于治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的痛苦,争议的PMMA骨质疏松骨组织受损,影响骨折修复(没完没了9,10];术后生物影响和变化的椎骨迄今为止报道较少。调查成立于执行一项动物研究,观察生物变化对PMMA和兔子vertebroplasty后骨界面的形态学和分子生物学。评估内容包括血管内皮生长因子(VEGF)的表达和胶原蛋白I型骨界面的组织通过rt - pcr和免疫印迹,骨钙素的表达被免疫组织化学研究。
2。材料和方法
2.1。动物随机化
七十二老新西兰女兔子(中国昆明医学院提供的),每个从3.0到3.5岁,体重3至4.2公斤,被用于这项研究。所有的兔子都证明是由DXA对骨质疏松症(美国月球)。术前额和侧卧位x射线胶片表明所有这些兔子腰椎正常序列和骨骼架构。兔子被随机分配到两个组,每组36。所有组相同的手术治疗和评估,但牺牲在术后不同时间1 h, 24 h, 3 d, 7 d, 4 w, 12 w。所有动物接受全身麻醉用4%的戊巴比妥钠(30毫克/公斤)螺旋veinintravenous注入紧随其后。考虑消除生物差异引起的不同级别的椎骨,注入(粉末和液体混合在20 g: 5毫升)改性PMMA(天津合成材料研究所、中国)应用到随机选择的腰椎实验组。对照组仅接受手术,没有PMMA注入。
2.2。动物模型制备及植入材料
皮肤切口是在后面的中值水平椎L7(臀部)的;皮下组织和咬肌分为公开前一半的L4,我5L,6。指临床PVP手术(3,4),硬膜外针先进到椎体通过置钉或parapedicular方法与注入深度毫米。馅饼PMMA正在慢慢注入相应的椎体的剂量毫升通过硬膜外针连接到1毫升注射器。注入和提取进行同步。以上程序应用于2椎骨(L2,我4每个兔子的)。术后,肌内注射青霉素100万单位每天doneuntil第七天,和所有的兔子都是美联储和监控我们的大学实验动物中心。兔子没有死亡之前和之后的操作。
2.3。x射线检查
每组动物分别采取横向x射线胶片检查存在,和形态学变化的PMMA动物牺牲之前预定的时间。
2.4。样品制备
每组动物的牺牲在他们预定的时间;椎骨(L2,我4)和删除了PMMA解剖和切成块包含骨水泥和骨组织之间的接口,他们的一部分组织总RNA提取和组织学的其他人。
2.5。rt - pcr
组织的总RNA提取11,12)试剂盒方法(英杰公司公司)被用来提取RNA琼脂糖凝胶电泳,检测RNA的完整性。RNA被分装在商店−70°C (rt - pcr设备,Bio-Rad)。
实验中使用的引物序列如下:VEGF-L 5′广汽ATC TTC CAG GAG TAC CC-3′157个基点VEGF-R 5′tga GGT TTG ATC公司治理文化ATG 3′actin-L TGG CTC TAA CAG苑GCC标签295个基点。
2.6。免疫印迹
总蛋白提取是在冰上操作,不惜−70°C以下的指令bca - 100蛋白定量工具(上海Biocolor生物科学与技术公司)。
第一抗体18 h在4°C下孵化后稀释至1:100 (VEGF)和1:1000(胶原蛋白),随后经历了TBST rinshing 4×10分钟。第二抗体是在环境温度下1 h和TBST rinshing 4×15分钟。PVDF膜在ECL试剂孵化前5分钟放入生色胶卷暗盒。最后在黑暗的房间里进行x射线胶片的曝光和发展根据最优的固定时间。
2.7。免疫组织化学
免疫组织化学过程被描述之前报告(13),avitin-biotin-complex方法与ABC过氧化物酶染色设备。部分是孵化兔anti-rabbit骨钙素多克隆抗体;消极的控制四个不同嫁接上颌窦,在正常小鼠免疫球蛋白是用来代替主要抗体染色。
2.8。结果分析
rt - pcr结果计算:首先,样本Ct-intraparameter Ct =ΔCt计算ΔΔCt我们设定一个样本ΔCt(正常对照组)作为参考。计算方法是ΔCt(样本)−ΔCt(参考)。结果说明样品之间的数学关系是2−(−ΔΔCt)能力。
蛋白质相对量计算:将x射线胶片到凝胶图像处理系统(Tanon)检测强度和区域的目标乐队。相对数量=强度×区域。
2.9。统计处理
数据的形式代表平均值±标准偏差(X±S)和分析利用单向方差分析。的两组样本进行比较以及。统计分析都是通过SPSS 13.0。
3所示。结果
3.1。一般观察拆分后样品
骨小梁的PMMA水泥,紧密连接骨骼组织和分布。PMMA布满了大量的软组织和一些新的骨骼组织生于12 w。在控制,软组织覆盖和骨缺损约0.5厘米是可见的。的骨缺损体积保持不变充满了血肿和一些肉芽组织,但无新骨生成。
3.2。x射线的调查
所有注入水泥没有出现任何脱落,开裂,或放松。PMMA和骨骼之间的界限变得模糊与新骨生成子群12 w。
3.3。Histomorphological观察
与控制相比,样本紧密结合PMMA水泥。骨之间的界面组织和PMMA与炎症细胞和纤维组织渗透。炎性细胞浸润明显在24 h, 3 d发展到顶峰,但相对缓解7 d。软骨细胞被发现在集群和差异化的编织骨界面没有明显炎症细胞在4 w;巨大的板层骨形成和偶尔的造血的骨髓可以观察到没有任何炎症12 w(数字1,2,3)。
(一)
(b)
(一)
(b)
(一)
(b)
3.4。VEGF rt - pcr扩增和蛋白质表达
VEGF是放大目标群157个基点分子量,以肌动蛋白为intraparameter。这证实了目标乐队巧合的基因片段根据intraparameter文学。
3.5。VEGF rt - pcr扩增结果
VEGF mRNA表达较低()比控制在1 h和24 h,而在3 d表达高度增加。再次下降,低于控制(7 d)。然后,它经历了一个从4 w 12 w持续增加;这种差别十分明显比7 d和控制()(图4(一))。
(一)
(b)
3.6。检测VEGF蛋白的结果
VEGF蛋白表达增加一点1 h和24 h。这是增加很多3 d而减少7 d。之后的表达是透明地升高,高于控制()(图4 (b))。
3.7。胶原蛋白I型rt - pcr扩增和蛋白质表达
胶原蛋白I型mRNA表达增加从1 h。持续的高水平由术后24 h 3 d。尽管7 d稍微降临的时候,它保持一个比较高的表达式从4 w 12 w是显著高于控制()(图5(一个))。胶原蛋白类型的高蛋白质表达我在3 d中发现,7 d和4 w。表达下在12 w明显比4 w ()(图5 (b))。
(一)
(b)
3.8。免疫组织化学
与正常骨组织相比,1 h,后24 h, 3 d, OC表达式在两组没有显著增加()。在7天,对照组的OC表现略有增加,体系组无显著变化()。在4周,两组OC表达增加,但对照组比PMMA组(更重要)。OC表达式继续增加在实验组4到12周。在对照组(略有下降)(数据6(一)和6 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
几个固有优势PMMA包括整形外科医生熟悉,易于处理,良好的生物力学强度和刚度,和成本效益7- - - - - -9,14]。几个缺点,包括没有潜在生物改造或融入周围的骨头,骨头没有直接归并,过度固有的刚度、高聚合温度、单体和潜在毒性(2,3,7,10]。虽然良好的临床结果已报告在几个系列vertebroplasty和kyphoplasty程序(15- - - - - -21),目前还不清楚是否缓解疼痛的一些组件是次要的机械稳定性,化学毒性,或热坏死周围组织和神经末梢;此外,其他手术相关因素会影响炎症进展。关注有关热骨头坏死仍理论,到目前为止,还没有明显的证据支持这个17,22,23]。在狒狒椎增加的一项研究中,有一些坏死的骨头现在vertebroplasty和kyphoplasty椎骨。然而,尚不清楚,坏死是由甲基丙烯酸聚合过程(22]。
利伯曼等人确定粒子符合水泥和/或硫酸钡在人类血管空间椎骨获得手术切除和尸检病例(24,25]。我们的调查的组织学和界面之间的水泥和骨头,PMMA诱导炎症反应,术后1周后消退,在4周post-PVP完全消失了。显示一些组件的化学毒性,或热接口组织的坏死,关于热骨头坏死的担忧仍是暂时的伤害。早期研究表明,PMMA诱导成骨细胞坏死的毒性效应引起的过氧化羟基自由基释放。甲基丙烯酸单体的自由基诱发巨噬细胞释放花生四烯酸骨和水泥的界面(5- - - - - -7]。此外,当地组织产生更多的乳酸脱氢酶导致肉芽肿炎症加重组织损伤。最近通过改善复合,PMMA证明高安全的毒性效应降低[2]。在我们的调查中,我们发现,尽管PMMA水泥注入稳定或修复病理骨折椎增大后,痛苦的骨质疏松性压缩骨折椎持续治疗和修复过程(26]。
我们研究VEGF的结果所示1 h和24小时低于相应的控制(),而3 d的表达是高度增加;这是降低减少7 d ()。然后,它经历了一个持续的增加从4 w 12 w。24小时的下降可能归因于PMMA凝固放热反应和氧化反应单体的自由基。上述两个因素抑制cytoactivity破骨细胞,有助于降低VEGF表达(15,27]。第一个峰值在3 d结果从一个密集的炎症反应,并支持通过炎症细胞如巨噬细胞和成纤维细胞VEGF表达;VEGF表达减弱以及炎症在7 d的灭绝。伴随着减少氧自由基,修复的放热反应损伤,恢复细胞微环境,和成骨细胞的正常化增强,另一个高水平的VEGF表达出现了。骨组织修复完成后在12 w, VEGF表达发布主要由成骨细胞(27,28]。
与此同时,在我们的研究中,胶原蛋白I型1 h是多个放大,和持续的高水平由术后24 h 3 d。PMMA具有促进胶原蛋白的影响的信息。Viateau et al。29日]在填充骨缺损的绵羊的研究发现,膜的PMMA集中BMP,骨骼干细胞和其他奖励的成骨的组件与vasiformation和I型胶原蛋白表达。环球航空公司等。18]报道PMMA材料植入体内可以激活角膜细胞和胶原蛋白的形成。纤维母细胞能够表达胶原蛋白类型我信使rna (30.,31日]。的后代在7 d可能是炎症引起的回归。的高表达7 d 12 w软骨细胞已经改变成骨细胞。他染色显示板层骨术后4 w。胶原蛋白I型主要是由骨细胞,在我们的研究表示在一个高水平术后12 w是有别于传统时间(大大减少术后8 w)。一样VEGF和胶原蛋白I型,OC显示高表达在时间点和延迟与对照组相比。那时他染色显示完成骨化完成。然而,蛋白质表达的结果与文献相似。
在骨折愈合过程中,胶原蛋白类型我是标记代表骨形成和造型特征。峰值表达式之间发生骨折后3 w、5 w的状态从胞内骨化软骨细胞骨信息,vasiformation有关。从我们的研究结果,PMMA水泥有害骨小梁在PVP的某种程度上。主要影响骨质疏松性骨折修复时间延迟。修复机制的同时,正常骨折愈合,而4周左右的时间延迟。可见,PMMA在PVP注射局部骨组织的作用和细胞的影响,但这并没有引起不可逆的损害。
总之,接口由PVP注入造成的损害国内先进的PMMA骨水泥可以修复和矿化发生类似正常骨折愈合的过程。然而,VEGF的表达,胶原蛋白I型,OC延迟大约4周。骨水泥永久不会引起局部骨质坏死;界面损伤修复周期可能会延长vertebroplasty。
缩写
| PVP: | 经皮vertebroplasty |
| PMMA: | 有机玻璃 |
| VEGF: | 血管内皮生长因子。 |
利益冲突
作者报告没有利益冲突。作者仅负责内容和论文的写作。
作者的贡献
王力军帮派赵博士和也可以被视为第一作者。
确认
这部分工作是支持科学研究重庆政府的基础。