文摘

下丘脑是一个重要的神经回路的继电器潜在能量代谢需要能量不断适应变化的环境。的神经内分泌控制食物摄入和能量消耗有关,可能依赖于下丘脑可塑性。严重的中线粒体能量代谢紊乱,如那些发生在肥胖,因此可能与破坏下丘脑转录组的可塑性有关。在本文中,我们调查的影响两个良好的抗衰老的干预措施,限制热量和自愿轮运行,在两个不同的生理模式,也就是说,糖尿病(db / db)和非糖尿病的野生型(C57 /提单/ 6)动物调查下丘脑转录组的上下文敏感的反应。我们发现,定量和定性,热量限制和体育锻炼与不同的转录特征差别明显糖尿病和非糖尿病老鼠。这表明代谢稳态调节不同的挑战在糖尿病和非糖尿病动物下丘脑基因集。更大的了解遗传背景导致下丘脑响应机制铺平了道路的发展更微妙的疗法治疗代谢紊乱的发生在不同生理背景。

1。介绍

下丘脑中起着举足轻重的作用在调节中央控制体的能量代谢和更高的中枢神经功能调节下丘脑的生命这种能力作为中心与外围系统之间的桥梁使得它成为了一个重要的研究目标与年龄相关的代谢和认知下降(1- - - - - -3]。下丘脑神经元结构和功能的动态管理自我平衡的挑战,包括喂食,禁食,和体育活动4,5]。此外,体细胞的遗传动物模型和扰动能量代谢也表现出显著改变下丘脑可塑性(6]。的神经内分泌控制食物摄入和能量消耗有关,可能依赖于下丘脑突触可塑性。增强能量代谢的重要性,同时细胞或体细胞,在体内平衡稳定寿命期间,多个研究演示实验干预的能力,要么限制能量摄入(热量限制)或增加能量消耗(运动)来改善与年龄相关的病理生理学(7- - - - - -11]。严重的中线粒体能量代谢紊乱,如那些发生在肥胖明显破坏健康老化原因有多个,因此可能与下丘脑神经可塑性的影响。不适应的电路改变也可能导致有害的饥饿和减少能量消耗增加的背景下,过度肥胖。老鼠拥有同源细胞因子的灭活突变对瘦素受体,db/db老鼠、肥胖、胰岛素抵抗(12),并演示兴奋性增加开车到orexigenic神经肽Y-expressing下丘脑神经元(13]。瘦素也会导致下丘脑响应能力的发展和集成的食物摄取和代谢6),还促进形态可塑性在成年人的大脑下丘脑神经元(14]。各种分子转录组签名回复能量摄入和支出的变化已经特征(15- - - - - -18]。与瘦素在能量代谢的作用一致,几个leptin-responsive已确定目标基因在下丘脑(18,19]。挑战代谢体内平衡,如热量限制(CR (20.])和自愿轮运行[21,22)也与下丘脑基因转录的变化有关。同时减少能量摄入,通过CR,增加能量消耗,通过车轮运行,与神经内分泌变化有关,可能是伴随着动态改变下丘脑神经可塑性(4,23]。然而,一个全面的转录改变发生在糖尿病和非糖尿病的动物为了应对复杂的充满活力的挑战,延长寿命和健康跨度在多个物种,如铬或轮运行,尚未确定。这样的问题是很重要的考虑到多种激素水平变化,反馈响应和受体功能,发生在不同的生理环境,因为这些可能会扰乱的功效应用抗衰老的干预措施。为了评估全球基因表达模式的改变后精力充沛的挑战,我们比较下丘脑转录概况、跑步或CR后,在糖尿病情况下,缺少,瘦素受体的(们注入了db / db)相对于非糖尿病小鼠C57Bl / 6控制。因此,我们的研究目的是欣赏流行的健康上下文背景如何影响CR的应用治疗抗衰老的干预或运动。

2。材料和方法

2.1。畜牧业和活动监测

动物保健和实验过程遵循NIH的建议,批准的国家老龄研究所动物保健和使用委员会(293 - lns - 2010)。微阵列分析,男性瘦素受体突变(db / db,)小鼠饲养在C57Bl / 6背景,从杰克逊实验室购买。的同龄雄性C57Bl / 6小鼠(野生型,)被用作控制。验证循环条件用于检测瘦素mRNA在大脑中,海马组织()ob / ob老鼠和(野生型老鼠是获得和分析。动物是一个月的实验。老鼠从每个个体的基因型是被关在笼子里包含一个转轮配备自动化,计算机监控系统。转轮是连续可用的老鼠。每天轮旋转的数量为每个鼠标使用MedSci不断记录行为监控软件(哥伦布仪器,哥伦布,哦)。额外的群()C57Bl / 6雄性小鼠和()db / db小鼠被用于原位杂交实验,证实微阵列数据。在最初的两周的实验中,所有的老鼠随意,食物重量被实验者每日记录。随意喂养水平最初为控制和监控db / db动物,然后将供应百分之六十的个人的饮食热量限制食物摄入是用于生成百分之四十(40% CR)。这种程度的限制饲养选择是基于先前的实验(15,16,24]。动物园保持在一百一十二小时光/暗周期;所有分配给CR饮食喂养的老鼠每天一次发作的黑暗时期(18:00)。身体重量每周记录。

2.2。下丘脑组织准备

为原位杂交,老鼠与异氟烷麻醉,然后用4%多聚甲醛灌注在磷酸盐缓冲剂。大脑在4%多聚甲醛后缀逐步增加浓度的蔗糖,然后储存在切片前−80°C。Hemibrains分段在40μ米在冠状平面使用冷冻切片机(Michrom M450,费舍尔科学,匹兹堡,PA)。部分被收集在一个1:6系列和存储在4%多聚甲醛。微阵列分析和半定量RT PCR,老鼠与异氟烷麻醉如上所述,斩首,下丘脑解剖的大脑被冰。解剖下丘脑样本干冰冷冻和储存在−RNA提取前80°C。树干血液收集血清分析代谢和应激激素,脂质;酮体和储存在−80°C到使用。

2.3。循环代谢激素和脂质测量

测量空腹血糖水平、食品被撤的笼子里的老鼠随意饮食,每日分配的食物被扣押40% CR饮食的老鼠,晚上在葡萄糖测试之前17:00时(小时)。第二天早上,动物被暂时克制,血糖水平测量后尾巴尼克使用Therasense手持分析仪(阿拉米达,Therasense CA)。从树干血胆固醇和甘油三酯测定(euthanization后)使用罗氏Cobas法拉II机械化学分析仪根据制造商的规格。和光诊断试剂对这些分析都是购自kouichi(弗吉尼亚州里士满)。总胆固醇水平测定使用工具包(目录没有。439 - 17501年),甘油三酸酯水平(目录号461 - 08992)。胰岛素和瘦素浓度测定血清ELISA(晶体化学。公司,,IL)。这些化验进行根据制造商的指示。短暂,微量滴定板涂有鼠标antiinsulin或豚鼠antileptin抗体与洗水洗三次缓冲区(50毫米Tris-buffered盐水(TBS)包含渐变20)。 Five microliters of diluted standards and serum samples were added to wells in duplicate. Detection antibodies conjugated to the appropriate species were applied, and the plate was sealed and incubated for 2 hours while shaking. The wells were then washed and the enzyme solution was incubated for 30 minutes. After washing, wells were reacted with substrate solution (o-phenylenediamine). Once the color developed sufficiently (15 minutes), stop solution (1 N sulfuric acid) was added, and the plate was read at 490 nm on an automatic plate reader (Perkin Elmer HTS 7000 Plus Bio Assay Reader, Perkin Elmer, Waltham, MA).

2.4。循环测量皮质甾酮

皮质甾酮含量测定使用商用等(RIA)工具包(诊断产品公司,洛杉矶,CA)根据制造商的指示。血清与躯干分离血液是在14000转离心两分钟。血清样本存储在分析之前−80°C。和皮质甾酮标准样品在室温下解冻,添加到antibody-coated管一式两份。1.0毫升(我^125年-)皮质甾酮添加标记,每个管涡在孵化前在室温下了两个小时。管被套利交易和计算使用帕卡德眼镜蛇(5010)γ计数器。

2.5。Illumina公司寡核苷酸微阵列

RNA进行了隔离使用试剂盒RNeasy迷你包动物组织(试剂盒,Inc .,瓦伦西亚,CA)。简而言之,冰冻组织被切成小块,允许解冻在4°C RLT裂解缓冲(试剂盒)。组织部分中断使用Mini-Beadbeater-8和1.0毫米玻璃珠(BioSpec Inc .,巴特尔斯维尔)。组织样本然后离心机,上层清液转移到第二管和离心细胞碎片再次澄清。上层清液加入95%的乙醇混合,并添加到绑定列。列离心机,洗几次绑定RNA是筛选了使用水。RNA检查质量和数量使用安捷伦2100生物分析仪和RNA 6000 nano-chips。总RNA用于生成biotin-labeled cRNA使用Illumina公司TotalPrep RNA扩增工具包(Ambion;奥斯汀,得克萨斯州)。简单地说,0.5μ克总RNA首先转化为单链cDNA,逆转录酶使用oligo-dT底漆包含T7 RNA聚合酶启动子站点,然后复制到生产双链互补脱氧核糖核酸分子。双链cDNA在一夜之间使用在体外转录反应单链RNA (cRNA)被biotin-16-UTP整合生成和标记。总共0.75μ克biotin-labeled cRNA杂化在58°C为16小时Illumina公司Sentrix MouseRef-8表达式BeadChips (Illumina公司,圣地亚哥,CA)。数组被洗、阻塞和标记cRNA与streptavidin-Cy3被染色。数组进行扫描使用Illumina公司BeadStation 500 x基因分析系统扫描器和图像数据提取使用Illumina公司BeadStudio软件3.0版。

2.6。微阵列数据分析

微阵列数据分析使用戴安6.0,以基于SAS JMP7.0微阵列分析程序系统。生受到过滤和微阵列数据Z -归一化和测试的重大变化和前面描述的(25]。简单地说,最初的筛选鉴定基因Z比≥1.50,Z比来自观察到基因的平均值之间的差异Z分数,除以标准差的所有差异,特定的比较。基因然后精制通过计算错误发现率(罗斯福),控制了预期的比例错误拒绝假设,与罗斯福< 0.05,只包括那些基因。这些数据进一步分析使用一个设置为2×3方差分析设计与意义。方差分析设计相比,在基因型(db / db对C57Bl / 6)和环境条件(久坐不动的/随意和久坐不动的/热量限制和跑步随意)。这允许我们识别记录不同的强度在缺少正常和瘦素受体的老鼠们注入的各种条件。功能基因组途径分析,具体显著调节基因列表分析了利用聪明才智8.6版本。通过定义的参考基因集智慧知识库(基因)。包含在一个通道被定义为有直接或间接关系的途径。对于每个通路识别,将至少需要两个基因从输入数据集的概率值< 0.05。结果也被过滤的数据考虑分子和关系,物种=鼠标,神经系统和组织=。

2.7。原位杂交

代的riboprobes原位如前所述(执行杂交26]。探针序列如下:对于Pias2,底漆agtgttactgggctttgctg,左底漆tctcaaaggtgggcttagtg;Slc17a6、正确的引物tggcacatgtcatcctacag底漆ccctccctttacaagctctc离开了。选择目标基因的基础上意义来源于微阵列分析法,以及选择性表达浓缩在下丘脑艾伦大脑图集[审讯的基础上27]。瘦素引物序列如下:对底漆tgtccaagatggaccagactc,底漆actggtctgaggcagggagca离开了。动物组织原位杂交处理在单独运行,平衡包括从每个实验条件相同数量的动物。原位如前所述(进行杂交26]。光密度分析在扫描图像使用台风生成Phosphorimager(通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西)。地区的兴趣匹配部分是用户定义的ImageQuant(通用电气医疗集团)由一个实验者盲目实验组的具体条件。五国部分平均为每个动物来获得一个分数。为了验证我们的微阵列研究,测量基因表达改变整个下丘脑,我们取样所有下丘脑核原位杂交分析。抽样从外侧视前区吻侧(前囱+ 0.14毫米)下丘脑外侧区尾(前囱−2.80毫米)根据Paxinos和富兰克林的阿特拉斯28]。解剖取样是平衡跨组包括一节包含外侧视前区(前囱+ 0.14毫米−0.22毫米);一段跨越前下丘脑区域,视前内侧核、视交叉上核、室旁核、外侧下丘脑(前囱−0.34毫米,前囱−1.06毫米);一个部分包含室旁核、腹内侧下丘脑弓状核,dorsomedial下丘脑核,和外侧下丘脑(前囱−1.22毫米,前囱−1.70毫米);一个部分包含后下丘脑区,外侧下丘脑,dorsomedial下丘脑,下丘脑腹内侧,和弓状核(前囱−1.82毫米,前囱−2.30毫米);一个部分包含后下丘脑区,外侧下丘脑,弓状核(前囱−2.46毫米,前囱−2.80毫米)。

2.8。实时PCR半定量的

引物序列和预期产品尺寸见表S1补充材料网上doi: 10.1155 / 2012/732975。与多个基因转录变异(IGF1和NTRK3),生物学工作台(3.2版)是用于对齐序列,和引物序列生成基于共识。RNA样本质量评估通过凝胶电泳和光谱分析。1.0总RNA样本也接受μL DNase我(2 U /μL;Ambion,奥斯汀,得克萨斯州)删除任何基因组DNA。RNA样本(0.5μ使用上标3 g)被转换为cDNA逆转录酶(表达载体,卡尔斯巴德,CA) oligo-dT和随机五个一。样品还没有上标3对基因组DNA污染的潜力进行评估。互补脱氧核糖核酸样品(4.0μL)被添加到50μL使用铂PCR扩增PCR Supermix(表达载体,卡尔斯巴德,CA),与gene-specific引物(表S1)。每个引物PCR扩增的线性范围是确定试点实验(25 - 35周期)。循环条件一个5分钟的步骤在95°C,其次是适当的放大的循环次数,与退火58°C。对瘦素检测PCR产品验证与DdeI限制性内切酶消化在杰克逊实验室网站上所描述的http://jaxmice.jax.org/protocols)。PCR产品运行在1.2%琼脂糖凝胶含有0.5μg / mL溴化乙锭在100 V一小时。图片是在紫外线照射下使用BioRad ChemiDoc分子成像系统(BioRad大力神,CA)。带强度量化使用NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/),表示相对于带强度glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。

2.9。统计分析

原位杂交和半定量PCR数据比较使用双向学生的基因型测试(GraphPad v棱镜。5、拉霍亚CA)。内分泌数据分析使用单向方差分析和计划事后比较(久坐不动的C57Bl / 6小鼠随意饮食相比,所有其他群体;久坐不动的db / db老鼠在随意饮食相比db / db跑步者;久坐不动的db / db老鼠在随意饮食相比db / db老鼠在CR)。相同的事后计划比较的数据应用身体体重和食物摄入量重复测量方差分析使用SPSS版本18。是对所有分析,统计意义。

3所示。结果

3.1。体重和食物摄取改变后精力充沛的挑战

与之前的报道相一致,CR范式减少体重在C57Bl / 6 (WT)和db / db老鼠(图1(一);,)[29日,30.]。在db / db老鼠,但不是WT老鼠,自愿轮运行也减少身体体重增加(,)。对体重的影响发生在减毒食欲过盛的上下文db / db跑步者(,;图1 (b)),没有任何改变在WT跑步者的食物摄入量。

3.2。改变代谢激素,应激激素,和血脂水平以下运行或热量限制

CR后空腹血糖水平显著降低db / db老鼠(图2(一个);,)。在WT老鼠,CR循环胰岛素水平降低,db / db老鼠,运行和CR显著衰减高胰岛素血症(图2 (b);,)。的强劲趋势降低总胆固醇(图两基因型跑步者也明显2 (c);,)。显著升高血清甘油三酯db / db老鼠(WT)相比显著减毒后运行或CR(图2 (d);,)。此外,db / db老鼠证明持续瘦素水平升高,相对于WT老鼠(图2 (e);,)。与之前的研究结果相一致的执行Zucker鼠模型(31日),运行逆转皮质甾酮水平升高中观察到db / db老鼠(图2 (f);,)。

3.3。微分下丘脑基因表达模式db / db老鼠、WT老鼠相比,在随意,久坐不动的条件

建立一个基线比较下丘脑之间的显著差异表达的基因转录db / db和WT老鼠随意喂养(简化为“随意”)和久坐不动的(nonrunning)条件下,我们评估了全球下丘脑使用Illumina公司珠微阵列基因表达。244个基因表达之间的久坐不动的显著不同db / db和WT小鼠,其中大多数是调节(185个基因调节;图3(一个)、表S2)。在调节基因,转录监管机构是突出代表,例如,真核翻译起始因子3,亚基1 (Eif3s1),卷曲螺旋域包含94 (Ccdc94), DEAH (Asp-Glu-Ala-His)框多肽9 (Dhx9)。大幅下调成绩单(中db / dbWT)相比,一个强大的表示酶、膜蛋白,和mitochondrial-related基因转录是显而易见的,例如,ectonucleotide焦磷酸酶/磷酸二酯酶5 (Enpp5) HLA-B-associated记录5 (Bat5),移位酶线粒体外膜22 (Tomm22)。统计信号通路分析(独创性通路分析:异丙醇)的记录之间的差异表达基因db / db和WT老鼠随意,久坐不动的条件与主要与“神经系统的发展,”“神经系统疾病,”和“分子运输”(图3 (b))。与这些最高的监管相关的特定基因probability-scoring信号通路包括β淀粉样蛋白前体如蛋白2 (Aplp2),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 b (Cdkn1b),淀粉样前体蛋白(App), metabotropic谷氨酸受体类型7 (Grm7)。另外功能基因网络,创建使用IPA算法,从这个数据集包括通路与细胞间信号,”以及“组织和器官形态。”

来验证我们的下丘脑微阵列分析的多个方面,我们的特点db / db相关基因表达的差异原位杂交和半定量逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)。我们测量四个选择记录差异表达的表达db / db老鼠而WT。从我们的阵列数据两种蛋白质抑制剂激活STAT2 (Pias2)和溶质载体家庭17 (sodium-dependent无机磷酸盐转运蛋白)成员6 (Slc17a6)显著调节下丘脑db / db老鼠WT相比。原位这些基因的杂交证实了他们的表达增强作用db / db老鼠(图3 (c)和3 (d))。与rt - pcr、谷胱甘肽过氧化物酶的表达7 (Gpx7)升高,和移位酶的表达外线粒体膜22 (Tomm22)被发现了,这两个是一致的与芯片结果(表S2)。

3.4。下丘脑调节转录模式通过运行活动WT老鼠

自愿实验老鼠经常跑长途,一个可用的转轮。在这项研究中使用的WT老鼠跑公里/ 24小时。当比较基因的转录差异由运行在WT老鼠WT久坐不动的同行相比,我们发现大部分的显著改变基因表达下调(~58%;图4(一);表S3)在运行。这种深刻的增加活动强的表达转录参与神经元发育和分化(吸收FK506结合蛋白5,Fkbp5:(32];SH3-domain GRB2-like 1, Sh3gl1:(33];frizzled-related分泌蛋白1,Sfrp1:(34])和染色质重塑(72年空泡的蛋白分类,Vps72:(35])。运行活动,相比之下,抑郁下丘脑食欲和新陈代谢相关的转录表达(食欲素/促食素,Hcrt: [36];lipocalin 2, Lcn2 [37];瘦素、地蜡38])以及胰岛素受体信号(72年三方motif-containing Trim72 [39])。改变Sfrp1 Fkbp5和mRNA表达被证实通过rt - pcr(数字4 (b),4 (c))。PCR和原位杂交是用来检测在下丘脑瘦素mRNA(图4 (d))。久坐不动的老鼠的下丘脑瘦素mRNA表达检测使用原位杂交(图4 (d)),与先前的报道一致证明内生在下丘脑瘦素mRNA表达29日,30.]。我们比较下丘脑瘦素mRNA在下丘脑mRNA在白色脂肪组织(窟)。下丘脑瘦素mRNA表达低于窟和控制没有ob / ob下丘脑(图4 (d))。确认阵列数据我们发现,rt - pcr,事实上下丘脑瘦素mRNA减少了运行(图4 (d))。调查由微分信号通路填充运行和久坐不动的在WT老鼠的基因簇。一个强大的神经发育表型观察(图4 (b))。运行相关的众多基因的表达的影响“神经系统发育,“分子运输”和“细胞形态。”Genes implicated in nervous system development and function included leptin and the murine homolog of果蝇Slit1。普基因编码领域,3班,转录因子3 (Pou3f3),也代表这一类,突触前调制器chordin (Chrd [40])。5 -羟色胺受体1 b (Htr1b)、Sfrp1 NK2同源框1 (Nkx2-1)和孕激素受体(Pgr)也包括组件的“神经系统发育“通路由运行在WT老鼠。

3.5。下丘脑调节转录模式通过热量限制WT老鼠

在WT老鼠CR实现之后,521个基因在下丘脑相比显著改变随意美联储WT控制。相似的基因数量显著或表达下调(269上调,225下调;图5(一个)、表S4)。很多的调节转录参与调节神经传递(otoferlin, Otof [41]:Wiskott-Aldrich综合症蛋白相互作用蛋白家族1,Wipf1 [42];生成受体酪氨酸激酶3 Ntrk3 [43];钙/钙调蛋白激酶1 d, CamK1d [44])和分化YLP主题包含1 (Ylpm1 [45])。CR WT动物,然而,造成深刻的抑制多种energy-modulatory因素包括胰岛素样生长因子1 (Igf1),磷脂转运蛋白(Pltp)和神经元ceroid lipofuscinosis 6 (Cln6), CR后显著下调。Igf1的变化,Ntrk3, CamK1d通过rt - pcr(数据进一步验证5 (b),5 (c))。带强度的验证确认所表现出的差异基因芯片结果。

的功能通路显著改变后的C57Bl / 6小鼠CR包括“神经系统疾病”,“细胞死亡,”和“细胞生长和增殖”(图5 (b))。Ntrk3,腺苷酸环化酶激活多肽受体1 (Adcyap1r1), E2F转录因子1 (E2f1)和x射线在中国仓鼠细胞修复6 (Xrcc6)代表在“神经系统疾病”的途径。加强其多能角色在内分泌和神经健康状况,Igf1代表是跨多个通道,包括“神经系统发展”、“细胞生长和增殖”,“神经系统疾病”(图5 (b))。

3.6。下丘脑调节转录模式通过运行活动db / db老鼠

糖尿病db / db老鼠跑远小于WT同行(0.33±0.08公里/ 24小时)。符合这个推动自愿活动下降,大大减少下丘脑(WT)小鼠相比差异表达基因中运行db / db老鼠。240个基因满足我们的标准微分表达式后运行(比久坐不动的db / db老鼠)db / db老鼠的下丘脑。这些基因,大多数(~89%)调节(图6(一);表S5)。显著调节基因包括成绩单与神经元蛋白质改造涉及到溶酶体或泛素相关函数(N-acetylgalactosaminidaseα,娜迦族46]:HECT域和锚蛋白重复包含,Hace1 [47]),细胞生长和周期进展(neuregulin, Nrg1 [48]:热量重复包含5,Heatr5a [49])。理气成绩单中几个突出的控制器的神经元兴奋性和发展(甘氨酸受体α1,Glra1 [50]:T-box大脑基因1,Tbr1 [51)、受体表达稳定(排序nexin 1, Snx1 [52])和磷酸戊糖代谢(ribulose-5-phosphate-3-epimerase, Rpe [53])。那加人的变化,Tbr1和Nrg1进一步证实了rt - pcr(数字6(b),6(c))。带强度为每个这些基因进行比较db / db老鼠跑或久坐不动,带强度的差异是按照芯片结果。

功能基因通路分析基因的显著改变db / db老鼠跑后,发现四个主要功能类别,“神经系统的发展,”“小分子生物化学、“组织形态,”和“脂质代谢明显(图表示6 (b))。两个与“脂质代谢相关的基因”和“小分子生物化学、“腺苷磁带,sub-family D,成员2 (Abcd2)和Nrg1被运行的影响db / db老鼠。两个基因与“神经系统发育和功能”和“组织形态”,T-box大脑基因1 (Tbr1)和白介素6信号转换器(Il6st),也不同监管中运行db / db老鼠。

3.7。下丘脑调节转录模式通过热量限制db / db老鼠

定量,CR实现在下丘脑的功能影响基因转录更保守在代谢环境,也就是说,WTdb / db,比运行的影响。db / db老鼠表现出显著的变化在CR后488个基因,和大多数(成绩单)显著下调(图7(一)、表S6)。在抑制基因因素与跨膜受体(3驱动蛋白家族成员,Kif3a [54])和神经元离子通道活动(电压门控、I型α亚基,Scn1a [55];谷氨酸脱羧酶1,Gad1)。基因上调后CRdb / db老鼠包括成绩单与chemosensation相关的受体和配体和神经控制的能量调节(甲酰肽受体2,Fpr2 [56]:催产素,Oxt;pro-melanin-concentrating激素,Pmch [57])。Pmch的表情,Oxt、Scn1a Gad1进一步评估使用rt - pcr(数字7(b),7(c))。Pmch Oxt增加,GAD1和Scn1a减少在这些化验,按照微阵列数据。

显著信号通路招募了CR后填充db / db老鼠包括“神经系统发育”、“神经系统疾病,”和“细胞间信号”(图7(b))。Gad1 wingless-related集成网站7 (Wnt7a)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (Cdkn1)代表“神经系统发展”功能的网络。significantly-populated信号通路“神经系统疾病”由两个蛋白激酶,活化,α- 2催化亚基(Prkaa2)和磷酸腺苷磁带,亚D,成员2 (Abcd2)。

3.8。共同和不同的功能途径改变运行和C57Bl / 6和热量限制db / db老鼠

久坐不动的条件下,随意喂养,db / db不同于小鼠C57Bl / 6小鼠的方式主要是归因于转录upregulation(图8(a))。数值,有一个更大的重叠基因型相比基因转录后运行(图8(b)),相对于比较基因型CR(图8(c))。轮运行与更多的基因调节db / db相比之下,老鼠,CR的主要相关基因被抑制db / db老鼠(图8(d))。31截然不同,明显填充,途径是代表整个数据集。在这些途径中,只有两类包含基因显著监管所有实验操作。这两类“神经系统发展”和“组织形态”,这表明它们是高度保守的函数。

直接评估的能力两个实施抗衰老的范例(CR和运行)转录调节下丘脑不同基因背景(WT,db / db),我们创建了维恩图的特定转录组的影响。我们发现和WT之间db / db背景,似乎运行调节基因(302:图更为普遍9(一个)相比,表S7) CR(127:图9 (b)、表S8)。然而,尽管数值越大保护运行的影响与WT (CR效果相比)db / db,只有1.6%的这些基因在同一个方向两国监管鼠标背景(图9(一个)柱状图)。相比之下,实施WT和CR的范式db / db一般的老鼠,相当大比例的调节基因表达(42.5%)拥有相同的极性两老鼠基因型。把这个coregulated子集的基因(54我们调查的潜在的生物功能守恒CR-mediated转录组群(图9 (c))。我们发现这些CR影响下丘脑守恒WT和转录db / db老鼠与神经发展密切相关(“神经系统发育和功能”,“组织发展”)和细胞结构(“细胞运动,”“细胞组装和组织”)(图9 (c))。因此,抗衰老的CR的行为范式,与下丘脑的神经改造/重新布线,可以影响动物代谢不同背景的。相比之下,似乎运行转录的影响敏感动物的代谢背景。

4所示。讨论

缺乏瘦素受体信号在糖尿病db-db小鼠显著改变基因的表达与兴奋性突触传递(Slc17a6 [58])和神经发展(Pias2 [59下)随意,久坐不动的条件。我们的数据表明,挑战代谢稳态调节不同的下丘脑组基因在野生型和db / db老鼠。尽管不同的基因在野生型和招募后精力充沛的挑战db / db老鼠,有趣的是,转录后改变运行或CR聚集在功能通路与神经系统发育有关,这表明发育信号通路是重要的神经回路的形成和可塑性在成年人的下丘脑。

热量限制曾被证明改变下丘脑中的神经元形态(60),促进突触发生在选择神经元的数量23]。在我们的研究中,大量的基因扮演了一个重要的角色在调节突触可塑性和细胞骨架运动性差异表达在应对精力充沛的挑战(例如,Fkbp5 [32];Chrd [40];Hcrt [36];应用程序(61年])。虽然我们目前的研究主要集中在研究全球变化在下丘脑基因转录,我们观察到的许多重大改变的表达多个基因参与调节可塑性建议的可能性挑战体内平衡也可以跨多个其他大脑区域重组电路。下丘脑的效果可能会发展一段时间的适应后特别是热量限制,尽可能少的下丘脑已报告基因表达的变化在短时间的CR (62年]。到目前为止,没有其他研究异形下丘脑基因表达的上下文中运行,很难推测转录过程的时间适应和还需要进一步的研究来探讨不同时间的课程。我们的数据表明,精力充沛的挑战在整个下丘脑调节基因的转录,转录组的反应是依赖于遗传背景(即。,糖尿病和非糖尿病患者)。我们计划未来的研究将集中在描述基因反应能量的挑战发生在个人下丘脑核,因为这将进一步在不同的神经元数量如何应对充满活力的挑战。此外,我们还计划扩展我们的分析调查总体下丘脑蛋白质组变化应对充满活力的挑战。由于许多神经内分泌信号通路的高度保守的性质反映在我们的数据,如胰岛素/ igf - 1、糖皮质激素、雄激素信号,有可能是转录的快照变化在这些实验可能包括捕获机制的建立和维护一组代谢在其他物种,肥胖的预防和治疗的相关性。此外,获得更大的不同遗传背景的了解(如糖尿病和非糖尿病患者)可以改变下丘脑转录组反应积极挑战,可以为小说的发展铺平道路下丘脑功能障碍的疗法治疗。热量限制我们的数据进一步表明,治疗模式,或pharmacomimetics,可能更容易适用(运动模式相比)在不同患者不同的代谢背景。

作者的贡献

a . m . Stranahan和b·马丁同样对本文亦有贡献。

确认

本文得到了校内的国家老化研究所的研究项目,国家卫生研究院。作者要感谢Michela加拉格尔博士(约翰霍普金斯大学)使用的资源原位杂交实验。

补充材料