文摘

目标。本研究旨在探讨胰腺exendin-4对t-BHP-induced细胞凋亡的影响β细胞的作用机制。方法。小鼠MIN6胰腺β细胞治疗exendin-4叔丁基氢过氧化物的存在与否(t-BHP)。细胞生存被MTT染色法进行评估。凋亡细胞的比例是由赫斯特/ PI染色后荧光显微镜分析和流量仪测定膜联蛋白后V-FITC / PI染色。的活动caspase-3决心使用caspase-3活动设备。表达P-IRE1α,IRE1αC-Jun n端激酶(物)、P-JNK C-Jun, P-C-JUN被免疫印迹检测。结果。Exendin-4抑制t-BHP-induced被发现在胰腺细胞凋亡β肽的表达下调caspase-3活动。Exendin-4也抑制内质网跨膜蛋白IRE1, apoptosis-related信号分子物,c-Jun激活。结论。我们的研究表明,exendin-4最终减少t-BHP-inducedβ细胞凋亡。IRE1-JNK-c-Jun参与exendin-4-mediated调制信号β细胞凋亡。

1。介绍

2型糖尿病是由于胰岛素抵抗之间复杂的交互的外围组织和胰腺的胰岛素分泌受损β肽。有一个普遍的共识,后者从受损的结果β细胞功能和减少β电池质量。高的活动分子,如活性氧(ROS)和集群的活性氮物种(RNS),可能导致氧化损伤,从而导致组织损伤。细胞凋亡的经典途径包括细胞死亡受体通路(外在途径)和线粒体死亡通路(内在途径)。最近的研究表明,内质网(ER)是一种细胞器,可以感知各种压力和凋亡信号传输(1,2]。的一个特征β肽是一种高度发达,出现了大量的胰岛素分泌(3]。氧化和受损的蛋白质折叠异常会导致内质网压力(ERS)。

Glucagon-like肽1 (GLP-1)分泌glucose-dependent方式,涉及分子生物学胰岛素分泌、胰岛素生物合成,抑制胰高血糖素的分泌和胃排空,抑制食物摄取。GLP-1还能抑制β细胞凋亡和促进β动物和体外培养细胞的细胞增殖。慢性管理GLP-1也促进胰岛素合成,β细胞增殖,β细胞再生(4- - - - - -6]。监管的一个重要的轨迹GLP-1生物活性肽的氨基端通过dipeptidyl肽酶IV (DPP-4)介导的乳沟在位置2丙氨酸。活跃的GLP-1循环的半衰期只有大约2分钟,这限制了它的临床价值。Exendin-4 GLP-1受体激动剂,不是DPP-4劈裂。因此,它比GLP-1半衰期较长,会更适合作为治疗剂(7]。

目前,glp - 1在胰腺癌在人信号通路的作用β细胞尚未完全解释道。Yusta et al。8)表明,GLP-1受体信号直接调节ER应激反应,导致推广β细胞适应和生存。Ferdaoussi et al。9]发现exendin-4能抑制il - 1引发的细胞凋亡,而强调的重要性GLP-1模仿细胞因子诱导的物信号的新的有效的抑制剂。

叔丁基氢过氧化物(t-BHP)是一种有机脂氢过氧化物模拟,这是常用的作为氧化剂来评估机制涉及氧化应激在细胞和组织10]。在这项研究中,我们调查了t-BHP是否会导致人队。此外,我们研究了exendin-4是否能保护β从t-BHP-induced凋亡细胞。此外,我们探讨了exendin-4凋亡的分子机制,包括评估人队和物信号通路,在t-BHP-treatedβ细胞。

2。材料和方法

2.1。试剂

Exendin-4 t-BHP,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院)和胎牛血清(的边后卫)获得Gibco(美国纽约大岛)。主要抗体,包括绵羊P-IRE1兔多克隆抗体α和IRE-1α是购买的圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。兔多克隆抗体羊NH2-terminal激酶(物),p-JNK c-Jun, p-c-Jun, caspase-3购买,从细胞信号(美国贝弗利,MA)。物抑制剂,SP600125从英杰公司购买(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。赫斯特33342 /π,caspase-3活动分析工具,膜联蛋白V-FITC凋亡工具包买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。免疫印迹化学发光检测系统(LumiGLO系统)是购自KPL(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。所有试剂都是分析或细胞纯度文化品位。

2.2。细胞培养

胰MIN6β细胞线是一个礼物从瑞金医院内分泌学研究所,隶属于上海第二医科大学(上海,中国)。MIN6细胞在DMEM补充维持15%的边后卫,青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素,保持在37°C调湿空气中5%的股份有限公司2。细胞成长75%融合,通过每3天。

2.3。赫斯特33342 / PI染色

细胞与赫斯特33342年和propidium double-stained碘(PI)区分细胞凋亡和坏死细胞。细胞治疗t-BHP (25μ米)有或没有exendin-4表示时间(100海里),用PBS (pH值7.4)洗净,然后沾着赫斯特33342 (10μ和π(10 g / mL)μg / mL)在室温下为5分钟。一百个细胞被选在三个独立的时间和荧光显微镜下计数,并计算凋亡率。

2.4。膜联蛋白V /π化验

膜联蛋白V- - - - - -FITC绑定和PI染色进行根据制造商的协议,然后分析了流式细胞术(FACScan,正欲)。凋亡细胞被定义为π的人口负(表明一个完整的质膜)和膜联蛋白V-FITC积极。

2.5。Caspase-3活动分析

caspase-3试验是根据制造商的协议执行。短暂治疗细胞被洗一次冰冷的PBS和化验caspase-3活动使用比色测定。乳沟Ac-DEVD-pNA衬底的caspase-3释放机构,这是量化spectrophotometrically使用ELISA读者在405海里。光密度的变化成正比caspase-3活动。

2.6。免疫印迹分析

治疗细胞与冰冷的PBS冲洗然后用里帕孵化裂解缓冲包含50 mM Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,1% Triton-X 100 1毫米EDTA,氟化钠1毫米,1毫米Na3签证官4,0.1% SDS, 0.5% (w / v)钠脱氧胆酸盐,1毫米phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) 10μg / mL抑肽酶,1μg / mL亮抑酶肽,1μg / mL抑肽素20分钟。细胞溶解产物被离心机在12000 g×10分钟,并使用布拉德福德的蛋白浓度测定方法。细胞总蛋白(50μg)是由8%或12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜。膜是孵化与以下适当的初级抗体:P-IRE1α(1:1000),IRE-1α(1:1000)、物(1:1000),p-JNK (1: 1000), c-Jun (1: 1000), p-c-Jun (1: 1000), caspase-3 (1: 1000)。二次辣根peroxidase-conjugated与增强化学发光试剂进行抗体检测。乐队的量化密度是由光密度分析。

2.7。统计分析

SigmaStat 3.5软件进行分析的数据和显示的平均值±标准偏差(SD)至少有三个独立的实验。统计值之间的差异是由学生的决定t以及方差分析或图基的事后测试紧随其后。显著性水平是设定在 。

3所示。结果

3.1。Exendin-4抑制t-BHP-Inducedβ细胞凋亡

的治疗β肽与25μmol / L t-BHP最大凋亡反应后生成的1 h就是明证赫斯特的结果/ PI和膜联蛋白V-FITC /π化验(数据没有显示)。β细胞治疗25μmol / L t-BHP 1 h明显表现出染色,表明细胞凋亡(亮蓝色粒子)(图1(A) (b))。有趣的是,exendin-4治疗显著抑制凋亡亮蓝色粒子形成MIN6细胞(图1(一)(d))。一个膜联蛋白V-FITC /π量化分析表明t-BHP-induced MIN6细胞死亡是由细胞凋亡(图1(B) (B)),从t-BHP-induced exendin-4保护MIN6细胞凋亡(图1(B) (d))。exendin-4的抑制效果为77.6% ( ),而物抑制剂产生了72.5% ( )减少t-BHP诱导细胞凋亡的程度(图1(B) (e)),这表明物信号参与这个过程。


图1
Exendin-4抑制t-BHP-inducedβ细胞凋亡。MIN6细胞与exendin-4 preincubated(100海里)或SP600125 18 h(10海里)然后暴露于t-BHP (25μ米)1 h。细胞凋亡的速度是由赫斯特/ PI染色(A)和流式细胞术(B)。包含明亮的蓝色颗粒的细胞(apoptosis-positive细胞)可视化光学显微镜下(A)。(A)控制;(b) t-BHP孤独;(c) exendin-4(例4)独自一人;(d)练习4 + t-BHP;(e) SP600125 + t-BHP;(f) SP600125;(g)量化的凋亡细胞。值表示为均值±SD ( )。 与对照组相比, 与t-BHP孤单。
3.2。Exendin-4抑制t-BHP-Induced Caspase-3活动

如数据所示2(一个)和2 (b)25、曝光MIN6细胞μmol / L t-BHP 1 h导致近似图2.3倍2(一个)和7.5倍图2 (b)( )增加caspase-3凋亡被活动的标志。预处理的细胞与exendin-4图caspase-3活动水平降低到44.7%2(一个)和72.8%的图2 (b)低于观察t-BHP单独治疗组( )。这是类似的保护作用物抑制剂,SP600125。这些结果表明,exendin-4可以减弱t-BHP-induced凋亡死亡通过抑制caspase-3的激活β细胞和物信号。

(一)
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(b)
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图2
Exendin-4抑制caspase-3活动t-BHP-treated MIN6细胞。MIN6细胞与exendin-4 preincubated(100海里)或SP600125 18 h(10海里)然后暴露于t-BHP (25μ米)1 h。Caspase-3活动决心使用Caspase-3活动试验(a)和免疫印迹(b),如部分所述2。直方图显示蛋白质的量化数据。水平的活跃caspase-3蛋白质被规范化caspase-3水平和表达为相对褶皱变化相比,控制样品。值表示为均值±SD ( )。 相对于对照组; 与t-BHP组。
3.3。Exendin-4抑制t-BHP-Induced增加愤怒

IRE1是三跨膜蛋白。免疫印迹分析表明,t-BHP增加IRE1磷酸化的2.6倍( 相对于对照组(图)3)。预处理的细胞与exendin-4 t-BHP-induced愤怒磷酸化的增加减少了58.7% ( 相比单独t-BHP组。这是类似的保护作用物抑制剂,SP600125。这些结果表明,凋亡事件所需的人可能是由t-BHP物信号有关。


图3
IRE1 Exendin-4抑制t-BHP-induced增加。MIN6细胞与exendin-4 preincubated(100海里)或SP600125 18 h(10海里)然后暴露于t-BHP (25μ米)1 h。代表免疫印迹图像显示phospho-IRE和总愤怒的表达水平。直方图显示蛋白质的量化数据。水平的磷酸化蛋白质被规范化水平的总蛋白和表示为相对褶皱变化相比,控制样品。值对应于均值±SD ( )。 与对照组相比, 与t-BHP孤单。
3.4。Exendin-4抑制t-BHP-Induced通过物细胞凋亡信号通路

众所周知,蛋白质的积累腔的ER发起一个压力反应称为展开蛋白质反应(UPR) /内质网过载反应(采油)。通路激活之后人之一是SAPK /物途径。进一步的实验表明,t-BHP增加物磷酸化的1.9倍( )(图4(一))和c-Jun磷酸化的1.7倍( )(图4 (b))。预处理的细胞与exendin-4 t-BHP-induced物磷酸化的增加减少了50.4% ( )(图4(一)),减少了t-BHP-induced c-Jun增加84.9% ( )(图4 (b))。这些结果表明,exendin-4变弱t-BHP-induced凋亡被调制JNK-c-JUN信号β细胞。

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(b)
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图4
Exendin-4抑制t-BHP-induced aptosis通过物信号通路。MIN6细胞与exendin-4 preincubated(100海里)或SP600125 18 h(10海里)然后暴露于t-BHP (25μ米)1 h。代表免疫印迹图像显示phospho-JNK和总物蛋白的表达水平(一个);phospho-c-JUN和总c-JUN (b)。直方图显示蛋白质的量化数据。水平的磷酸化蛋白质被规范化水平的总蛋白和表示为相对褶皱变化相比,控制样品。值对应于均值±SD ( )。 与对照组相比, 与t-BHP孤单。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查了在t-BHP-induced exendin-4细胞凋亡的影响。我们证明exendin-4保护胰腺β通过IRE1-JNK-caspase-3信号细胞t-BHP-induced凋亡的死亡,这表明可能参与细胞凋亡的ER应激。

2型糖尿病与胰岛素分泌逐渐丧失,在逐步减少β电池质量。胰岛素抵抗产生持续增加对胰岛素的需求,随着时间的推移,β细胞无法维持增强胰岛素合成和分泌的水平。胰腺β细胞对人非常敏感。ER有几个重要的功能,包括转译后的修改、折叠、组装新合成分泌的蛋白质,它还充当细胞钙商店。人队有利于维护细胞的正常功能和生存;然而,长时间的人可以诱导细胞凋亡。因此,β细胞凋亡引起的慢性人队是很重要的在2型糖尿病11,12]。在先前的研究中,我们表明,MIN6细胞生存能力,t-BHP处理时,减少剂量依赖性的方式。我们还发现,连续接触t-BHP MIN6细胞诱导氧化损伤(13]。目前的研究表明,t-BHP治疗导致死亡的激活效应还存在,如caspase-3,导致核分裂和细胞凋亡(数据1和2)。此外,t-BHP可能引发细胞凋亡β通过人细胞信号通路(图3)。

IRE1是三跨膜蛋白。x - box的一小片段结合蛋白1 (XBP1) mRNA的活性形式是拼接IRE1 XBP1的活动形式。这是支持的观察压力效应引起的愤怒是介导的角色不迟于PEK-related内质网真核起始因子2α激酶(活跃)和激活转录因子6 (ATF6) [14]。我们相信,愤怒是最后的活化分子的压力反应。然而,在回应人,IRE1α已经发现招募适配器蛋白质,TNF receptor-associated因子2 (TRAF2), ER膜。的IRE1α/ TRAF2复杂然后再激活细胞凋亡信号调节激酶1 (ASK1),导致下游ASK1活化和增殖蛋白激酶家族(MAPKs)级联,导致细胞死亡(15]。

物激酶(物)被广泛的特点。物激活发生磷酸化的氨基酸残基。一旦激活,物转移从细胞质到细胞核,进而诱发的磷酸化其目标转录因子c-Jun [16]。ER stress-mediated凋亡通路最终激活线粒体死亡通路,导致caspase-3激活。因此,线粒体死亡通路在合成过程中发挥作用和放大通路(17]。在目前的研究中,我们观察到物抑制剂,SP600125,可以抑制caspase-3的活动(图2);t-BHP物磷酸化增加了1.9倍( )(图4(一))和c-Jun磷酸化的1.7倍( )(图4 (b)),这表明物信号通路参与氧化损害的细胞凋亡途径。

Exendin-4可以抑制胰岛β细胞凋亡诱导的氧化损伤(18]。Pandey, Rizvi10)发现,当INS-1细胞孵化与il - 1的存在与否,exendin-4 GLP-1充当一个潜在的抑制剂的物保护细胞信号通路的激活药物诱导细胞凋亡。因此,glp - 1在该受体受体激动剂有潜在的重要应用治疗糖尿病。在我们目前的研究中,我们还发现,exendin-4抑制t-BHP-inducedβ细胞凋亡77.6% ( )(图1(B) (d))。预处理的细胞与exendin-4 t-BHP-induced物磷酸化的增加减少了50.4% ( )(图4(一)),减少了t-BHP-induced c-JUN增加84.9% ( )(图4 (b))。这些影响是所观察到的类似物抑制剂预处理后,SP600125,表明exendin-4变弱t-BHP-induced凋亡被调制JNK-c-JUN信号β细胞。

高水平的人导致胰腺的细胞凋亡β细胞(19]。exendin-4 GLP-1受体激动剂,保护胰岛β细胞通过减少人的水平(20.]。Exendin-4保护β细胞与游离脂肪酸通过ER伴侣毕普的感应和凋亡蛋白JunB,调解β细胞生存lipotoxic条件下(21]。我们表明,一定程度的氧化损伤产生明显的人,ER跨膜蛋白的胞浆内域,IRE1α,经历self-dimerization phosphorylation-induced激活。IRE1激活可以促进细胞凋亡,exendin-4可以抑制IRE1的激活α减少人的反应,从而保护胰腺β细胞。

近年来,GLP-1已经阐明的保护机制。角等。22显示,监管的βGLP-1取决于细胞数量和功能的营地/蛋白激酶中介IGF-1R诱导表达和活动的增加IGF-2 / IGF-1R自分泌循环。科林格等。23]证明了营地/蛋白激酶/分子和MAPK / ERK1/2通路可以分析控制β细胞增殖,而Aikin et al。24]表明,PI3K / AKT抑制物通路小岛,这个相声代表一个重要的凋亡PI3K / AKT激活的结果。Widenmaier et al。25)发现GLP-1抑制p38 MAPK和物通过Akt-mediated磷酸化状态的变化的细胞凋亡信号调节激酶1 INS-1人类胰岛细胞,导致其活性的抑制。因此,各种各样的相互作用似乎参与GLP-1胰腺的保护β细胞对ER应激,如排骨、毕普,GRP78, XBP-1, ASK1 p-elf2αAP1,在别人,仍有待调查。

5。结论

目前的研究表明,对t-BHP-mediated exendin-4有保护作用β细胞凋亡的抑制ER应激。我们已经表明,IRE1-JNK-c-Jun-caspase-3通路。然而,这项研究只关注ER应激反应的一个方面。未来的研究将致力于识别额外的下游事件持续期间监管ER应激。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

W.-J。陈,L.-X。王的贡献同样这项工作和分享第一作者。

确认

这项工作是创新基金的赠款支持福建省,中国(没有。2009 - cx - 4),中国福建省自然科学基金(没有。2010 j01162),福建医科大学的教授基金(JS09012)和福建省的教育部基金(JA08107)。