文摘

生长激素缺乏症与骨折风险增加虽然还不清楚这是由于破坏骨质量或一个小骨的大小。我们研究了骨宏观结构之间的关系,微体系结构和机械性能GH-deficient (GHD)小鼠模型进行GH治疗开始在早期(青春期前的)或(postpubertal)时间点。Microcomputed断层扫描图像的股骨和L4椎椎小梁得到量化的宏观结构和微体系结构,并使用有限元分析力学性能测定。GHD的动物骨头宏观结构是25 - 43%小而GH-sufficient (gh)控制()。GHD动物减少骨体积比20%和19% (BV /电视)和小梁厚度(Tb.Th),分别。整个GHD小鼠骨骼力学性能降低股骨和脊椎职责。(67%和45%)比gh控件()。早期和晚期GH治疗部分恢复骨骼宏观结构(15至32%小于GH控制)和整个骨骼力学性能(24 - 43%大于GHD动物)虽然仍持续净赤字比正常小鼠(27 - 52%)。重要的是,早期治疗与GH导致复苏BV /电视和结核病。顺便还能改善小梁的力学性能。因此,结果表明,GH治疗应该开始早,而且测量微体系结构应该考虑在GHD的管理。

1。介绍

生长激素(GH)中扮演一个重要的角色在骨的生长,以及缺乏GH在开发过程中导致延迟骨龄和骨矿物质密度降低(1]。GH缺乏在儿童时期被认为是导致骨质疏松症的骨折风险和风险增加在以后的生活中与GH治疗可能减轻这种风险(2,3]。然而,证据支持这个是有争议的,有人建议,GH缺乏应该不再被列为导致骨质疏松症的儿童(4]。

高患病率的骨折已经观察到在成人与垂体机能减退包括GH缺乏发生在儿童期和成年期(5- - - - - -7),这些骨折率增加主要归因于缺乏GH (5,6]。儿童、青少年、成人与儿童孤立GH缺乏骨折风险增加(6,8),而另一项研究发现低骨折患病率在同样的人口7]。GH治疗已被证明有保护作用,减少断裂频率(虽然这背后的机制不清楚8,9]。

研究已经证明,与GH缺乏骨矿物质密度降低,GH治疗规范化BMD (10- - - - - -12]。这些研究主要依靠二维密度指标,是影响骨大小(13]。当使用大小修正或体积密度测量时,大多数研究表明,GH缺乏导致正常或接近正常水平BMD (12,14,15),而一些报告低于正常价值(16]。

参数量化小梁微体系结构已被证明与强烈的骨骼强度(17]。Transiliac骨活检显示没有histomorphometric GH-deficient男人的骨小梁之间的差异和控制(18),和GH治疗相同的人口没有改变小梁结构(19,20.]。在中等GH-deficient老鼠,小梁的微体系结构明显损害少数薄骨小梁和减少连接密度(21]。在一项研究评估改变小梁微体系结构在增长在活的有机体内microcomputed断层扫描(μCT),我们表明,GH-deficient老鼠破坏椎小梁微体系结构。治疗开始青春期前时期获救的骨小梁数量而不是结构,而治疗青春期后没有检测效果。GH-deficient老鼠有一个瘦骨小梁GH-sufficient老鼠相比,数量的增加和GH治疗导致的骨小梁数量进一步增加的趋势(22]。扩大在这工作,在这项研究中,我们试图确定这种改变在骨微体系结构力学性能的影响以及整合措施的骨骼使用高分辨率的宏观结构在体外μCT。

有些研究人员研究了GH在骨强度的影响。生长激素是显示增加骨强度在年轻和老GH-sufficient老鼠,这增加,几乎完全被归因于一个较大的骨骼大小(23,24]。在骨质疏松症大鼠模型,GH治疗被证明逆骨强度的损失通过增加极限应力和杨氏模量到正常水平25]。GH-deficient小鼠和大鼠皮质骨强度受损归因于皮质直径的减少,而在老鼠的损失强度是GH缺乏的程度成正比21,26]。

微体系结构目前还不清楚作用在骨骼强度与GH缺乏,尤其是以前的工作表明,增加骨折的风险可能是由于小骨头的大小。本研究的目的是了解骨小梁和皮质骨的作用力学性能及其与微体系结构和宏观结构GH-deficient小鼠模型。我们之前在活的有机体内研究集中于颞微体系结构的变化与GH治疗第四腰椎。在这里我们使用高分辨率在体外μCT成像技术在多个骨骼网站地址的假设GH-deficient老鼠破坏小梁微体系结构除了小骨头的大小,导致力学性能降低。我们测试的假设开始GH治疗青春期前导致复苏陪microarchitectural变化的力学性能与青春期后开始治疗。

2。方法

2.1。实验设计

Ghrhr纯合子的“小”(点燃/点燃)与C57Bl / 6小鼠背景受损GH合成和释放虽然注射外源性GH可以刺激经济增长27]。杂合的(点燃/ +)小鼠正常GH合成和释放,与野生型C57Bl / 6小鼠。育种对纯合子的男性和杂合的女性从杰克逊实验室购买(美国缅因州酒吧港口)。这种繁殖安排作为女性纯合子小鼠泌乳和受损的人,因此,可能会失去他们的第一个垃圾(28]。孩子断奶在21天老分配给5个实验组,每组:GH-sufficient (点燃/ +)控制,GH-deficient (点燃/点燃)控制,早期治疗(点燃/点燃),晚期治疗(点燃/点燃),盐水注射控制(点燃/点燃)。这只老鼠模型的一个限制是需要大量的时间繁殖动物内部(> 2年),导致使用的必要性两性实验获得足够的样本大小。所有实验小组由五男五女老鼠,除了注射生理盐水的对照组,这是由三男三女老鼠。所有的动物都被安置在组相同性别的和允许的随意访问标准啮齿动物食物和水。

早期治疗和晚期治疗组25收到每日皮下注射μ克老鼠重组生长激素(a . f . Parlow博士,国家激素和肽项目)。使用每天注射试图模仿GH的生理释放,这发生在脉动的方式释放GH峰值发生在睡眠中最大的(29日]。剂量(25μ每只老鼠每天g)被选中,因为它是在广泛的剂量刺激增长在小鼠和大鼠23,24,30.]。尽管重组人类GH常用于治疗GH缺乏在动物实验中,抗体生产可以限制这种治疗的功效31日]。

生长激素是由Kristensen准备详细et al。22]。早期治疗组每日皮下注射(sc)的25μg GH的年龄21天至60天,而治疗组末收到sc注射25μg GH从年龄35天到60天。21天,岁的青春期小鼠尚未开始,大约35天的年龄对应的青春期(32]。每日sc注射代替连续定量输液泵由于体积小老鼠的研究开始。GH-deficient老鼠仍低于最低体重建议泵注入到45天时间点。生理盐水注入控制老鼠收到每日sc注射生理盐水从年龄21天到60天来确定每天注射的压力会影响骨微体系结构或骨的力学性能。综述了所有程序和批准的卡尔加里大学的健康科学动物保健委员会和实验符合批准。动物照顾按照加拿大动物保护协会的指导方针。

2.2。成像

在年龄60天,小鼠安乐死的有限公司₂吸入,第四腰椎(L4)和左股骨解剖自由和所有软组织切除。组织存储在−30°C saline-soaked纱布,直到准备使用。高分辨率μCT图像(μCT35 Scanco医疗AG)整个L4的脊椎和股骨获得的积分时间800毫秒,55千伏峰值和x射线设置,145μa L4椎骨进行扫描产生的各向同性体素的大小为3.5μm, 14数据随后被扔进垃圾箱μ(图像处理语言(IPL) v5.08b Scanco医疗AG)。腿节被扫描的各向同性体素的大小10μm。所有图片都是高斯过滤(椎:σ= 1.0,支持= 1;股骨:σ= 1.2,支持= 2),和一个固定的阈值22.0%的最大灰度值应用于提取矿化组织。骨头的位置,这样的长轴椎体和股骨与轴(IPL v5.08b Scanco医疗AG)。

2.3。骨几何和小梁的微体系结构

2.3.1。椎

椎体高度,计算含椎体骨片的数量清点,乘以切片厚度。横截面积(CSA)是通过计算区域内手绘轮廓的椎体片位于身体的中段。小梁微体系结构量化,小梁椎体的区域是由手绘轮廓提取每四片小梁地区生长板和半自动的变形算法应用于其间的片。骨microarchitectural参数计算:骨体积比(BV /电视),小梁数目(Tb.N),小梁厚度(Tb.Th),小梁分离(Tb.Sp)结构模型指数(SMI),连接密度(Conn.D) (IPL, v5.08b Scanco医疗AG)。骨小梁组织矿物质密度(TMD)计算了正常化矿物含量(如由x射线衰减)的骨小梁体积。

2.3.2。股骨干

计算完整的股骨长度,包含骨片的数量是总结和乘以片厚度。股骨分析(完整的股骨长度除外)都是在股骨骨干,这是一个地区组成主要是皮质骨。这与主要由骨小梁的脊椎。这两个区域被选中,这样两个皮质骨和骨小梁属性可以被评估。

剩下的股骨分析股骨提取要求的一部分。为了分析类似区域的骨头,轴的长度选择基于样本的长宽比。因此,轴的长度()是为每个模型,是基于一个独特的长宽比6.0乘以轴直径。轴直径计算的部分股骨长度等于整个骨长度的一半。因此,最后股骨模型是由提取一段长度的轴,中心轴中点被定义为53%的从近端股骨长度来衡量33]。皮质厚度平均(Ct.Th)股骨模型通过直接计算方法(27)(IPL, v5.08b Scanco医疗AG)。

2.4。有限元分析

有限元(FE)方法是一种计算方法用于模型材料的力学行为,可以确定骨的力学性能(34,35]。在这项研究中,μCT图像作为模型的基础上,每个立体像素在图像转化为一个元素在网使用的体素转换方法36,37]。

2.4.1。椎

两个有限元分析在每个椎:单轴压缩整个骨,以及完整的刚度矩阵的计算子卷的椎体骨小梁(34]。

脊椎整体骨
齐次线性有限元模型提取的矿化阶段的垂直对齐的整个脊椎图像被创建。Plano-parallel加载表面所生成的数字插入圆柱结束描述到椎侧(图1(c))。结束描述的直径选择环绕整个终板。顶部结束描述被分配一个0.42毫米的厚度,而底部结束描述0.35毫米厚。椎过程是修剪,这样他们并没有超出椎侧。体素的转换方法是用于将图像中的每个立体像素转换成一个六面体的元素在有限元模型中。19 GPa的杨氏模量和泊松比为0.3被分配到骨(38),结束描述被分配材料特性相当于骨水泥(PMMA):杨氏模量= 2.5的绩点,泊松比= 0.3 (39]。低的节点在底部表面结束描述是受限的但是自由移动的方向和的方向。的顶部节点表面上结束描述中自由移动和方向和单轴位移()相当于应变是应用于1%方向。
模型解决了使用自定义有限元软件(饿v4.0)在桌面电脑(Mac OS X版本10.5.6;2×2.8 GHz的英特尔四核至强)。从整个脊椎模型生成的网格平均包含260万个节点和210万个元素。模型的输出是反应部队()需要诱导1%应变。轴向刚度()计算 在哪里椎体的横截面积,杨氏模量是明显的水平,椎体高度。

脊椎小梁子卷
一个立方子卷的骨小梁(130×130×130像素点)从图像中提取的各向同性体素的大小3.5μm(图1(b)),矿化骨被确认为前面描述的。体素的转换方法是应用,三个单轴应变压缩和三个单轴剪切应变测试进行。模型解决了使用IPL (v5.11 / FE-V01.15 Scanco医疗AG)。小梁子卷的网格生成图像平均包含572335个节点和471255个元素。正交的主坐标系统的刚度矩阵计算(34),和明显的杨氏模量的主方向。

2.4.2。股骨干

一个齐次线性有限元分析进行确定股骨骨干的抗弯刚度。有限元计算结果与梁理论的使用,因为机械性能计算从梁理论高度依赖于样品的长宽比33),这个参数是所有模型保持不变。因此,本文选取轴长度为每个模型基于一个长宽比为6.0,如前面描述的那样(部分2.3。2)。体素的转换方法是用于股骨干的图像转换成有限元模型。19 GPa的杨氏模量和泊松比为0.3被分配给所有骨骼元素(38]。模型加载在纯弯曲的角0.01弧度,这个负载应用股骨髁部朝下,这是一个立场一致,用于机械测试(图1(a))。模型解决了使用自定义有限元软件(饿v4.0)在桌面电脑(Mac OS X版本10.5.6;2×2.8 GHz的英特尔四核至强)。有限元分析的网格生成导致平均530万个节点和480万个元素完整股骨模型。抗弯刚度()基于计算力矩()需要弯曲模型的角度0.01弧度()和股骨的长度()

2.5。统计数据

统计学意义的参数测试的方差分析(方差分析)。主题之间的意义在哪里,事后图基的测试是用于确定组织意味着之间的区别。所有统计测试进行与PASW统计17.0版本(美国芝加哥SPSS公司)。被认为具有统计显著性差异所有的测试。

3所示。结果

GH-deficient之间没有明显差异和生理盐水注入控制老鼠的任何参数,支持假设任何压力因为每天注射没有检测到对骨的影响大小、微体系结构或机械性能。

3.1。TMD和骨骼宏观结构

所有组织(TMD)和骨矿物密度宏观结构表中列出的结果1,宏观结构的结果显示在图中2。没有检测到TMD的任何组之间的差异。GH-deficient老鼠有一个小得多的椎体高度、椎体CSA、股骨长度、股骨皮质厚度,比GH-sufficient小鼠股CSA(小于gh, 25%到43%)。生长激素治疗与增加在这些维度大于GH-deficient老鼠的发病年龄不管治疗(GHD大于10%到23%,)。然而,所有的这些形态参数保持在两个治疗组相比,GH-sufficient小老鼠(小于gh, 15%到32%),因此只GH治疗导致骨宏观结构的部分救援。唯一的形态参数,显示一个早期治疗效果是股骨长度,一个大大延长观察骨长度与早期GH治疗晚期治疗相比(3%比晚了,)。股髓CSA GH-deficient明显较小,早期治疗,晚期治疗小鼠相比GH-sufficient老鼠(小于gh 29至39%,)。髓有增加的趋势与GH治疗CSA是重要的晚期治疗组(11 GHD大于16%,)。

3.2。椎微体系结构

所有椎微体系结构结果显示在表中2,一个立方体显示椎体骨小梁的动物与BV /电视在每组中值图2。的骨小梁体积比明显小GH-deficient L4椎骨比GH-sufficient椎骨(20%小于gh,)。生长激素治疗与增加骨体积比(BV /电视)在早期和晚期治疗小鼠(GHD大于14 - 25%);然而,这种增长是重要的早期治疗和GH-deficient老鼠之间的(),早期治疗和GH-sufficient老鼠之间没有显著差异。之间没有明显差异在BV /电视后期治疗和GH-sufficient或GH-deficient老鼠,表明部分恢复。这些趋势观察重度,更多的棒状结构GH-deficient老鼠相比,GH足够的老鼠(68%大于GH,)。复苏的早期观察重度治疗组与缺乏GH-sufficient老鼠的显著差异,但重度明显小于GH-deficient老鼠(GHD小于32%,)。,部分复苏明显后期治疗组之间无显著差异存在这个组和GH-sufficient或GH缺乏组。

GH-deficient,早期治疗,晚期治疗组明显比GH足够薄骨小梁组织(小于GH 8到19%,)。早期治疗导致了一些复苏的结核病。Th这个参数明显较大的早期治疗小鼠比GH-deficient老鼠(GHD大于14%,)。

结核病。N,结核病。Sp, Conn.D没有发现差异的任何组。

3.3。机械性能

机械性能的结果显示在表中3。GH-deficient,早期治疗,晚期治疗动物脊椎轴向刚度都显著低于GH-sufficient动物(27 - 45%小于gh,)。然而,GH治疗导致部分复苏这个参数作为早期和晚期治疗小鼠均有较大的轴向刚度比GH-deficient老鼠(24 - 33%大于GHD,)。

类似于椎骨,股骨生长板抗弯刚度也显著大于GH-deficient GH-sufficient组相比,早期治疗,晚期治疗组(52 - 67%小于gh,)。早期和晚期治疗导致部分恢复(42 43%大于GHD,)。

明显的杨氏模量,反映了椎体骨小梁机械性能,是小得多的GH-deficient GH-sufficient老鼠相比(37%小于gh,)。这个参数有一个复苏早期生长激素治疗导致显著差异从GH-deficient老鼠(GHD大于56%,),没有发现区别GH-sufficient小鼠的骨小梁机械性能似乎已经获救。后期治疗可能也导致部分复苏小梁骨的力学性能,但显然不如早期治疗由于缺少发现区别GH-deficient或GH-sufficient组。

4所示。讨论

这项研究提供了新颖的见解皮质之间的关系和骨小梁宏观结构,微体系结构,力学在GH-deficient模型。恶化的结果表明,GH缺乏骨大小、微体系结构,机械性能,GH治疗部分恢复骨骼的大小,无论治疗开始时(早期或晚期)。早期治疗完全恢复椎小梁状微体系结构的一些重要方面,部分复苏中观察到其他方面。此外,晚期治疗导致的不完全恢复小梁微体系结构。宏观结构和microarchitectural变化在两个骨骼与骨骼力学性能(L4椎骨和股骨干)的网站。发现虽然早期和晚期GH治疗导致力学性能的部分恢复,其余的赤字可能会用妥协来解释宏观结构,而不是微体系结构,因为它表明,至少在早期治疗组,小梁的力学性能是完全恢复。

其他人已经表明,GH缺乏的结果在一个小骨头的大小,这是与这一研究观察到的结果一致。GH治疗并没有导致恢复正常骨的大小,和类似的趋势也发生在人类研究GH-deficient孩子们明显比正常短六年的治疗后(10]。作为应对GHD GH治疗儿童和动物取决于GH剂量(24,40),有可能是剂量的小鼠在这项研究并不足以导致全面赶超增长。虽然这个剂量符合剂量显示诱导骨和肌肉生长GH-sufficient和缺乏啮齿动物(23,24,30.),大多数这些研究使用剂量比例体重。因此随着动物的成长和增加体重,GH管理增加的数量。此外,它已被证明,使用固定剂量,随时间增长反应减弱(41]。在这项研究中,一个恒定的剂量是独立于身体质量管理,这可能限制了GH治疗的反应。

因为产后(1到23天的年龄)是最快速增长阶段长骨头在鼠标42),GH治疗很可能会更有效地恢复正常骨长度如果管理在这个阶段。然而,有现实的挑战与治疗小鼠断奶的年龄前21天。幼崽的小尺寸防止输液泵植入,和潜在的拒绝小狗的母亲禁止每天手动注射。因此,它是不可能把这些老鼠在断奶之前。然而,持续治疗过去60天端点也可能导致一个更完整的骨骼方面的恢复,GH治疗的持续时间会影响响应GH治疗(11]。

股骨的macrostructural结果表明,早期治疗小鼠相比,在骨骼发育的一个更成熟的阶段,后期治疗小鼠在研究端点。正常C57Bl / 6小鼠骨骼生长需要快速骨膜扩张直到年龄28天,当扩张放缓(43]。骨内膜的扩张在56天的年龄达到高峰,之后下降,显示的净吸收骨内膜骨后56天前和净附着这一点(43]。髓CSA是大后期治疗组,治疗组早期皮质厚度增加的趋势。这表明早期治疗组很可能在骨内膜的附着在晚期治疗组仍在骨内膜的吸收在60天的年龄阶段,表明早期治疗组在皮质骨的更高级阶段的发展。

GH-deficient老鼠表现出严重恶化的小梁微体系结构,而小鼠治疗青春期前表现出复苏的许多方面。这是符合我们之前的这些老鼠的纵向研究基于低分辨率在活的有机体内成像。在这项研究中,我们发现了一个显著更多的骨小梁在GH-deficient,早期治疗,晚期治疗动物GH-sufficient动物相比,有进一步增加的趋势与GH治疗(22]。虽然不显著,本文提供的数据表明,有一个趋势的骨小梁数量增加的所有GH-deficient组、治疗组有显著增加。结合小梁厚度的增加与治疗,这些结果表明,小鼠接受GH治疗规范化骨体积比通过增加骨小梁的数量和厚度。

一个有趣的结果是,尽管没有恢复骨骼大小GH-treated老鼠,微体系结构的某些方面确实是获救。因此,降低整个骨的力学性能可以归因于小骨头,而不是赤字在骨微体系结构。如果这种动物模型反映了临床情况,这些结果表明,评估的有效性GH治疗必须超越测量骨大小和密度和应包括GH microarchitectural变化的影响。与新兴技术(例如,高分辨率的外围定量计算机断层扫描),这种临床评估方法可能在不久的将来变得可行。

没有发现组织矿物质密度差异的群体,这是符合大多数的人类研究测量体积或程度的BMD GHD但不同于动物模型减少BMC和BMD观察(44),包括我们最近在活的有机体内研究[22]。这种差异可能是由于不同的图像分辨率影响部分体积效应和TMD的估计。考虑的局限性TMD测量中使用的多色x射线源μCT,它可能是必要的在未来使用同步加速器μCT。无论如何,如果有真正的GH治疗TMD的效果,效果可能小。TMD的理由包括评估在本研究证实,使用均匀组织弹性模量的有限元分析是一种合理的方法。

缺乏生长激素导致股骨抗弯刚度和脊椎轴向刚度,减少和部分恢复这两个参数与GH治疗明显。这些参数是依赖于骨大小影响,因此减少骨骼大小与GH GH-deficient动物和部分尺寸恢复治疗。因为骨小梁的结构在力学行为过程中发挥作用,脊椎的力学结果不仅仅是大小的函数,但骨小梁的结构。孤立的骨小梁的有限元结果子卷表明GH-deficient动物的骨小梁结构明显较弱,和早期的GH治疗恢复了小梁的机械性能。因此,这进一步支持了这种观点,即赤字脊椎轴向刚度在早期治疗动物很可能引起的小骨头的大小,而不是削弱微体系结构。尽管早期治疗不完全恢复骨骼的大小,导致净赤字在整个骨骼力学性能,小梁的恢复机械性能可能有价值的长期减少骨折风险。后期治疗小鼠,观察类似的模式;然而,小梁的力学性能并没有完全获救。这些结果证实支持先前的发现是很重要的GH治疗早期开始。

有限制在这项研究中,值得一提。首先,有限元分析没有将组织弹性模量的变化,因此只评估的贡献大小和结构力学性能。然而,这将是很难证明将组织矿物质密度由于缺乏发现组间显著差异。第二,在小老鼠的骨头,这是具有挑战性的提取小梁子卷与至少五个骨小梁Harrigan等建议。45为连续介质假设。这是由于小尺寸和形状不规则的椎体鼠标和可能的理由考虑未来更大的动物模型(如鼠)。最后,应该注意的是,这些发现在这项研究中使用鼠标模型并不直接适用于人类患者,并需要进一步的研究来探索GH治疗骨骼健康的时机的重要性。这项研究将特别有趣的追求新的临床使用3 d技术,如高分辨率外围定量计算机断层扫描对病人群体评估人类骨微体系结构(而不是只骨矿物质密度测定仪。

总之,GH缺乏导致减少骨宏观结构,小梁微体系结构恶化,减少骨骼力学性能比GH-sufficient控制。sc GH治疗未能完全恢复骨骼大小虽然小梁早期治疗组的力学性能完全恢复,尽管净减少整个骨骼强度。因此,GH治疗骨骼健康的好处可能会低估了临床评估仅仅依靠骨大小和密度(即的措施。测定仪,因为恢复小梁微体系结构可能不被发现。