文摘

老鼠(r)和继发性甲状旁腺功能亢进定义之间的关系进行了研究维生素D代谢产物和rPTH水平衡量三种不同的老鼠elisa。控制和肾功能衰竭(RF)老鼠在一个正常的饮食,虽然两组低钙(ca)或维生素d缺乏症(- d)的饮食。射频感应手术。轻微的射频老鼠正常钙和25 (OH) D但减少1,25 (OH)2D水平( 在rPTH)增加2.5倍( )。严重的射频老鼠和那些ca或- d饮食降低了钙( )和25 (OH) D水平( ),rPTH增加了2 (ca饮食; ),4 (- d饮食; )和20倍(射频; ),1,25 (OH)2D高(ca饮食: )或低(RF - d的饮食: )。25 (OH) D和1,25 (OH)2D是积极的和消极的ca和- D饮食有关,分别。rPTH分子形式表现如预期在射频和ca的饮食,但不是- d饮食预计多C-rPTH片段时少。这可能与本研究的短期课程与之前的研究相比。

1。介绍

循环甲状旁腺素分子的行为形式的开发过程中继发性甲状旁腺功能亢进(船期)有关船期的原因。在实验的钙和维生素d缺乏的狗,电离钙保持不变,直到1,25 (OH)2D初始增量后开始下降。这种行为是由于25 (OH) D水平低于20 nmol / L (1]。此外,随着“外劳的发展,基底、刺激和增加nonsuppressible完好无损(I)甲状旁腺素多羧基末端(C)甲状旁腺素的水平,对甲状旁腺素分泌对甲状旁腺素(1 - 84)1]。当这些狗是补充维生素D,钙电离和25 (OH) D规范化迅速而1,25 (OH)2D最初到达supraphysiological值随时间而逐渐退化正常(2]。虽然I-PTH规范化之前缺乏维生素D值,C-PTH仍高,患病率上升C-PTH / I-PTH比率,表明适应增加甲状旁腺组织质量通过oversecretion C-PTH片段(2]。后者发现进一步持续低剂量1,25 (OH)2D治疗在正常的狗,没有钙离子浓度增加,导致减少I-PTH但不是C-PTH分泌,提高C-PTH / I-PTH比率的钙浓度(3]。的严格监管C-PTH碎片建议可能的生物效应最终证明体内的这些片段(4- - - - - -6和体外7]。C-PTH碎片产生生物效应,相反的甲状旁腺素(1 - 84)或甲状旁腺素(猴)甲状旁腺素/ PTHrP I型受体通过作用于不同的受体(4- - - - - -7]。循环甲状旁腺素分子的进化形式在船期因肾功能衰竭(RF)是不同的,主要是因为C-PTH碎片通过肾脏(8- - - - - -10]。低血钙症通常发展时,肾小球滤过率(GFR)低于30 ml / min / 1.73米2相对于低1,25 (OH)2D和高磷酸盐水平(10]。的I -和C-PTH水平在第二阶段已经迅速和明显疾病(肾小球滤过率(GFR) ml / min / 1.73米2比I-PTH值)与C-PTH迅速恶化为肾小球滤过率(GFR)的减少(10]。严重患者射频船期清单C-PTH / I-PTH比率低于患者轻微的船期,表明高甲状旁腺素(1 - 84)生产相对于C-PTH碎片在严重的船期8]。25 (OH) D水平也降低肾小球滤过率(GFR)下降(11- - - - - -15但所涉及的机构尚不清楚。老鼠(r)甲状旁腺素elisa Scantibodies实验室开发的公司被用来研究rPTH分子形式之间的关系,25 (OH) D, 1,25 (OH)2D的浓度,在船期归因于低钙饮食饮食(ca),维生素D缺乏饮食饮食(- D),或射频。有一些细微的差别,结果表明类似的循环甲状旁腺素分子的行为形式在不同的物种。

2。材料和方法

2.1。实验方法
2.1.1。产品

特殊饮食都是购自哈伦Teklad (WI麦迪逊,美国)。所有hPTH和rPTH肽来源于BACHEM(托兰斯、钙、美国),一些常规目录和其他新合成的这个项目。

2.1.2。生物化学

电离(Ca钙2 +Ca)是用数量来表示2 +特殊电极(拜耳诊断快速实验室模型348年,多伦多,加拿大)。总钙、磷酸、白蛋白、肌酐和碱性磷酸酶测定比色方法适应multianalyzer评估。对于其他测量,样品在室温下保持最多30分钟,并在2小时内转移和离心机在4°C,整除和存储在−80°C到化验。血清是用于所有化验。25 (OH) D研究IDS . n:行情)等。(美国AZ泉山)。1,25 (OH)2D评估酶联immune-sorbent试验(ELISA) ALPCO诊断(美国NH Salem)。rPTH研究的3种不同的elisa Scantibodies实验室Inc .(桑提人、钙、美国)。的特点三rPTH elisa一直在前面描述的(16]。

2.1.3。高效液相色谱分析

每组血清池从所有的动物用于高效液相色谱分析的循环rPTH分子形式。每个池的首次提取血清水域Sep-Pak + C-18墨盒,所描述的贝内特et al。(17]。一C-18筒采用为每个3毫升的血清。筒与5毫升的样本筛选了800毫升/ L 1 g / L三氟乙酸乙腈。乙腈与氮、洗出液的蒸发和残余体积是冻干重组在0.5毫升的1 g / L triofluoroacetic酸的高效液相色谱分析。每个0.5毫升样品加载在水域C18μBondapak分析列( 毫米(证件)和筛选了不连续的线性渐变的1 g / L三氟乙酸乙腈。梯度,从19岁到15分钟,33.5%在45分钟从33.5到35.2%,交货1.0毫升/分钟的安捷伦1100系列溶剂输送系统。1.0毫升分数被蒸发,冻干重组与7 g / L BSA 1毫升水;足够的卷被测量在每个rPTH化验。控制实验与rPTH校准器(1 - 84)添加到hypoparathyroid鼠血清确保甲状旁腺素降解不发生在各种程序。一个免疫反应性的峰值与rPTH coeluting(1 - 84)检测到的3 rPTH化验。免疫反应性的rPTH恢复通过所有这些rPTH化验过程比80%,高效液相色谱法,基于比较原始的池rPTH值的总和rPTH免疫反应性在所有高效液相色谱分数。

2.1.4。实验动物

男性Sprague-Dawley老鼠从查尔斯河加拿大购买76到100克(加拿大St-Constant QC)和维护在笼子里根据加拿大动物保护协会的指导方针。三组(1控制和2肾功能衰竭(RF)组)保持在一个正常的钙和维生素D的饮食就交付给我们的中心。两组被美联储低钙(钙0.3%磷0.1%)维生素D-sufficient或维生素d缺乏足够的钙磷钙(0.5%和0.3%)的饮食。所有组收到各自的饮食为33天。射频是在全身麻醉下诱导5/6肾切除术2连续过程,2/3的左肾切除第一天,紧随其后的是全切除6天后。最终,这些老鼠被分成2组根据血清肌酐值低于或高于150μmol / L。他们牺牲了33天的饮食或33天后在第二次手术。在所有情况下,他们牺牲在全身麻醉下通过腹部腔静脉放血。

2.1.5节讨论。统计分析

结果意味着±SD。组之间的差异被克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析分析,其次是邓恩的多重比较检验值的分布不是高斯或通过方差分析,其次是Dunnett测试高斯分布时的多重比较。ca饮食和2 - d饮食大鼠和RF组比较未配对t检验有或没有韦尔奇修正。标准方法被用于各种生化参数之间的线性回归。高效液相色谱资料进行评估planimetrically起源8.5软件(OriginLab公司,北安普顿,妈,美国)。高效液相色谱的概要文件被修正到100%恢复和池的平均值表示pmol / L。

3所示。结果

图1演示了rPTH分析抗原表位之间的关系,发现循环rPTH分子形式。整个(W) rPTH测定2 - 7日抗原决定基,与rPTH反应(1 - 84)和N-rPTH posttranslationaly修改形式的rPTH(1 - 84)循环rPTH高效液相色谱配置文件。总(T) rPTH化验22-34抗原决定基,与rPTH反应(1 - 84),N-rPTH,和非- (1 - 84)rPTH或大型羧基末端(C)与部分保存N-structure碎片,原型是rPTH (7 - 84)。C-rPTH测定的抗原决定基,而且征召与rPTH反应(1 - 84),N-rPTH,非rPTH(1 - 84),但主要是小C-rPTH片段缺失一个代表大多数循环rPTH N-structure。这些碎片的C-rPTH试验有一个更大的亲和力比其它循环甲状旁腺素分子形式。


图1
关系rPTH化验检测抗原表位和循环rPTH分子形式。N-PTH =伴rPTH,转译后的修改形式的rPTH(1 - 84)丝氨酸17。非(1 - 84)大型C-rPTH碎片部分保存N-structure而小小姐C-rPTH碎片结构(18)。

控制相比,老鼠ca饮食(表1和2)降低了总钙浓度( ),碱性磷酸酶活动增加倍( )、低25 (OH) D ( ),但升高1,25 (OH)2D水平( ),更增加C-rPTH ( 比W-rPTH) ( )。C-rPTH / W-rPTH和C-rPTH / T-rPTH比率往往上升没有意义。之间的正相关是观察到25 (OH) D, 1, 25 (OH)2D水平( 饮食(图)在ca2(一个))。老鼠的饮食(表- d1和2)低电离和总钙值( )、低25 (OH) D ( )和1,25 (OH)2D ( ),2 - 3重rPTH海拔( ),并显著增加C-rPTH / T-rPTH比( )。25 (OH) D和1,25 (OH)2D水平较低( )和rPTH水平高( )比老鼠ca饮食。之间的负相关是指出25 (OH) D, 1, 25 (OH)2D水平( 饮食(图)- d2 (b))。有温和的射频(表的老鼠1和2)保持normocalcemic血清肌酐上升三倍,维护正常25 (OH) D低1,25 (OH)2D水平( ),并提出2 - 3重W-rPTH更高( )和C-rPTH ( )的水平。他们的T / W-rPTH明显减少( )。最后,老鼠与严重的射频(表1和2)体重较低( ),低电离钙( 血清肌酐(增加),一个8倍 ),减少碱性磷酸酶活性( ),减少25 (OH) D ( )和1,25 (OH)2D水平( ),和35-fold海拔20 - W ( )、T ( )和C-rPTH ( )减少T-rPTH / W-rPTH比( )和一个高度C-rPTH / T-rPTH比率( )。25 (OH) D水平较低( )和rPTH水平( )高得多的比有温和的射频的老鼠。电离钙之间的负相关是明显,25 (OH) D和肌酐水平( ),磷酸之间的正相关关系,C-rPTH水平和肌酐浓度( )(图3)。之间的正相关关系被发现电离钙和25 (OH) D水平( 25 (OH) D之间)和负相关性和磷酸盐或W C-rPTH水平( )(图3)。

表1
进化生化参数的各种饮食和部分切除。
表2
进化rPTH rPTH比率和不同的饮食和部分切除。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
25 (OH) D和1之间的关系,25 (OH)2D水平calcium-deficient饮食的老鼠(a)和维生素D缺乏饮食(b)。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图3
肌酸酐之间的关系或25 (OH) D和钙,磷酸盐,老鼠rPTH水平中等(●)或严重肾功能衰竭(▲)。

图4和表3总结的结果高压液相色谱(HPLC)剖面分析的各种组织。大鼠正常钙饮食,像其他组,披露4种rPTH分子形式的循环:rPTH(1 - 84)(46个地区42),N-rPTH(地区38 42),转译后的修改形式的rPTH(1 - 84),非(1 - 84)rPTH碎片(地区25-32)或大型C-PTH碎片部分保存N-structure,和C-rPTH碎片(地区8 - 20)缺乏一种N-structure。rPTH(1 - 84)确认了所有3 rPTH化验,N-rPTH也是如此。N-rPTH往往被C-rPTH over-evaluated试验与使用rPTH(39 - 84)标准,更多的是免疫反应性的基于摩尔比rPTH(1 - 84)标准。非甲状旁腺素(1 - 84)碎片主要是由T-rPTH检测试验,并由C-rPTH独家小C-rPTH片段分析。W-rPTH化验,rPTH(1 - 84)代表超过90%的免疫反应性饮食组,但只有66%的射频老鼠相对于N-rPTH积累。T-rPTH试验,所有组较低% rPTH比控制(1 - 84)。这是归因于更多非(1 - 84)rPTH碎片在ca和- d饮食和更多N-rPTH射频。最后,C-rPTH化验,rPTH(1 - 84)代表46和39%的控制和ca rPTH饮食大鼠52%,- d饮食的老鼠。这些百分比下降到29 27%,中度和重度射频老鼠,分别与N-rPTH积累在温和的射频和C-rPTH碎片严重的射频。 In each case, C-rPTH fragments explained 34 to 57% of non-rPTH(1-84) immunoreactivity with the highest % in RF rats.

表3
rPTH高效液相色谱分析资料每个rPTH试验获得的。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图4
高效液相色谱法的循环rPTH分子形式分析了整个(-),总(- - -),和Carboxyl-rPTH(”””)检测在正常大鼠钙饮食(a)、(b)的防肾结石低钙饮食,维生素d缺乏饮食(c),中等(d)或严重肾功能衰竭(e)。一个高效液相色谱概要文件获得的池中所有大鼠血清给定组。

4所示。讨论

本研究中使用的3 rPTH化验证明与rPTH反应分子形式类似于那些在人类中发现(18- - - - - -21和狗3]。因此,rPTH (1 - 84), N-rPTH,非- (1 - 84)rPTH C-rPTH碎片被发现在老鼠高效液相色谱配置文件。区别hPTH高效液相色谱资料可能包括更多rPTH(1 - 84)和少C-rPTH碎片的老鼠相比,人类基底状态(20.]。

这些化验测试调查的行为循环rPTH分子形式船期由ca饮食,饮食- d,射频感应5/6肾切除术。ca的饮食,我们观察到总钙含量下降,碱性磷酸酶活性增加,低25 (OH) D高1,25 (OH)2D浓度,W -和C-rPTH水平升高。之间的正相关是25 (OH) D, 1, 25 (OH)2D水平。rPTH比率保持不变。减少肠道吸收的钙由于非常低钙供应,即使1,25 (OH)2D浓度增强,最好解释了低钙血症(22,23]。高碱性磷酸酶活性的原因主要是由于有缺陷的矿化速率的升高1,25 (OH)2D浓度(24,25]。25 (OH) D浓度的减少可能是由于循环水平加剧,25 (OH)225 (OH) D D提高营业额成活性代谢物(26,27]。C-rPTH水平上涨超过T -和W-rPTH水平。更多的非(1 - 84)rPTH被T-rPTH化验发现,和C-rPTH碎片C-rPTH测定高效液相色谱法简介,一个令人惊讶的观察作为一个大比例的rPTH(1 - 84)预期28]。一个增强rPTH周转率(1 - 84)非(1 - 84)rPTH C-rPTH碎片似乎是负责任的和可能归因于升高1,25 (OH)2D浓度(3,29日]。尽管提高1,25 (OH)2D水平rPTH浓度增加,但低于- D饮食的老鼠。这可能是由于部分抑制作用calreticulin 1日,25 (OH)2D结合受体的甲状旁腺的低钙血症和船期30.,31日]。

稍微不同的情况在老鼠上维护- d饮食33天。钙水平下降与普通磷酸盐浓度,正常的碱性磷酸酶活性,低25 (OH) D和1,25 (OH)2D浓度、rPTH水平升高和高C / T-rPTH比率。之间的负相关是观察到25 (OH) D, 1, 25 (OH)2D水平。血钙过少是最好的解释为减少肠道吸收的钙引起的低1、25 (OH)2D (32,33)与非常低的底物浓度(1]。后者可能是由于缺乏维生素D供应(1]。rPTH水平升高,因为低钙血症和低1,25 (OH)2D,这两个刺激rPTH生产通过不同的机制(34- - - - - -36]。C / T-rPTH玫瑰因为C-rPTH大于T-rPTH增量可能由于分解代谢分泌rPTH (1 - 84) C-rPTH碎片。这不同于我们的狗模型的D缺乏%甲状旁腺素(1 - 84)增加1,28),但后者的研究是两年的时间。稍长一些的研究可能提供了一个calcemic离解ca和- d之间的饮食。在3周后狗的ca - d饮食,C-PTH碎片也升高(28)。

在温和的射频,3重观察血清肌酐增加正常的钙水平,正常25 (OH) D和低1,25 (OH)2D的浓度,增加了W -和C-rPTH水平,降低T / W-rPTH比率。三分之二的rPTH海拔被rPTH解释(1 - 84)和三分之一N-rPTH W-rPTH化验。% C-rPTH碎片不是C-rPTH增强的分析,但这可能与关联的N-PTH不对使用rPTH(39 - 84)标准。低1,25 (OH)2D水平与射频(37)导致肠钙吸收减少,(32,33),同时增加rPTH磷酸(1 - 84)水平导致正常水平(38]。W-rPTH增加超过T-rPTH以来,T / W-rPTH比率下降主要与更多N-rPTH W-rPTH分析探测到。在更严重的射频,老鼠受损的增长体重较低(39- - - - - -41]。血清肌酐增加了8倍,低钙血症出现磷酸与正常水平,和碱性磷酸酶活性降低,25 (OH) D, 1、25 (OH)2D的水平,和W——T-rPTH增强30 - 20倍,分别与C-rPTH 35-fold以上。T / W-rPTH比率降低,C / T-rPTH比例增加。血钙过少是最好的解释又低肠钙吸收归因于低1,25 (OH)2D (32,33]。磷酸盐水平仍然是正常的因为rPTH增强,和射频仍不显著足以损害肾磷酸盐排泄(38),但磷水平升高超过适度的射频。碱性磷酸酶活性的下降反映了这些老鼠的更低体重与其他组相比,和受损的增长与先进的射频39- - - - - -41]。25 (OH) D水平低不能与高1,25 (OH)2在这些老鼠D水平。减少肠道吸收维生素D (42]中的相关部分低体重和饮食状况和减少25 (OH) D生产与肝脏细胞色素P450减少rPTH水平很高(43可能是负责任的。在老鼠和温和的射频,W-rPTH海拔三分之二相关rPTH(1 - 84)和N-PTH三分之一。观察积累C-rPTH片段与更先进的射频,像人类的9]。减少T / W-rPTH比用相同的机制来解释在温和的射频,而C / T-rPTH比率的增加归因于C-rPTH碎片的积累。

总之,我们的结果表明,rPTH化验特点类似hPTH化验都是有用的工具来识别rPTH分子形式与人类相似。定量差异可能存在与人类的关系更rPTH(1 - 84)和少C-rPTH碎片的老鼠。模型的船期由于ca饮食,饮食- D,或严重的射频,我们看见低25 (OH) D水平。如果维生素D - D饮食供应下降和上升25 (OH) D引起的营业额高1,25 (OH)2D水平低钙饮食解释25 (OH) D水平,他们无法解释低射频25 (OH) D水平。减少肠道吸收的维生素D (4225 (OH) D)和减少肝合成相关的直接影响严重的船期在肝脏细胞色素P450水平(43]可能牵涉其中。需要更多的研究来调查这些机制。

rPTH分子形式的行为源自rPTH比率是预期严重射频C-rPTH较小片段的积累和提高C / T-rPTH比率。这被认为有助于甲状旁腺素抗性观察肾功能衰竭实验(4 - 7)。同样,增加小C-rPTH碎片ca饮食预计即使C / T和C / W-rPTH比率没有显著增加,与高水平的1,25 (OH) 2 d将影响甲状旁腺素的降解(1 - 84)成了碎片在甲状旁腺(3、29)。唯一原因不明的情况依然C-rPTH碎片的增加与增加C - d饮食/ T-rPTH比当一个预期更多rPTH(1 - 84)在狗模型(1)老鼠实验的短期课程可能参与这些差异因为ca - d饮食在狗类似的剖面观察3周(28)。rPTH分子形式的整体研究演示了一个行为类似于其他物种与短时间的轻微差异研究。

公开声明

这项工作成为可能通过拨款Scantibodies实验室公司主要调查员,皮埃尔似幻。t·坎特Scantibodies实验室inc .)和美国总统是Hornyak杨和z是同一家公司的员工。l .卢梭没有披露。

确认

作者谢谢侬Livernois打字这手稿和奥维德•达席尔瓦编辑它。