文摘

内皮功能障碍会增加心血管疾病的风险在慢性肾脏疾病(CKD)。本研究主要探讨VDR激活是否会影响在CKD内皮功能。5/6进行肾切除手术(NX)大鼠实验性慢性肾功能不全治疗有或没有paricalcitol, VDR活化剂。胸主动脉环预约与去甲肾上腺素和乙酰胆碱处理或硝普酸钠。尿毒症显著影响主动脉放松(%在NX老鼠和在虚假的% 30米乙酰胆碱)。——提高endothelial-dependent放松%,%,%在NX老鼠对待paricalcitol为0.021,0.042和0.083克/公斤两周,分别在paricalcitol 0.042克/公斤并不影响血压和心率。甲状旁腺素抑制人没有改善内皮功能自cinacalcet抑制甲状旁腺素不影响endothelial-dependent血管舒张。N-omega-nitro-L-arginine甲酯完全废除paricalcitol改善内皮功能的影响。这些结果说明VDR激活在CKD改善内皮功能。

1。介绍

慢性肾脏疾病(CKD)患者经验高死亡率从心血管疾病(简历)1,2]。内皮dysfunction-characterized中断的微妙的平衡在血管舒张、氧化应激、炎症、血栓形成和纤维蛋白溶解由endothelium-has维护与增加心血管疾病(CVD)的风险(3- - - - - -6]。内皮功能障碍通常在CKD,可能之前其他心血管并发症(7]。肾血管内皮功能的变化不仅影响肾脏疾病的进展,而且系统性明显内皮功能障碍导致CKD心血管并发症的严重程度。CKD患者通常有高血压8和/或糖尿病9),两个传统的心血管危险因素与内皮功能障碍有关。此外,可能其他肾具体机制可能在CKD导致内皮功能障碍。在早期慢性肾病的第一血清参数改变是降低血清1,25-dihydroxyvitamin水平(10),这就提出了一个问题:是否缺乏VDR的激活可能是肾特定CKD的内皮功能障碍的危险因素。此外,临床前研究表明,VDR可能参与调节平滑肌细胞增殖和分化,肾素-血管紧张素系统、炎症、血栓形成和纤维蛋白溶解;其中许多因素参与内皮功能(11,12]。

维生素D₃在皮肤上,但是需要激活活性激素,1,25-dihydroxyvitamin D₃(125 (OH)₂D₃骨化三醇)为其适当的功能。骨化三醇通过核受体结合发挥其功能,维生素D受体(VDR)。骨化三醇及其类似物如paricalcitol (19-nor-125 (OH)₂D₂),激活维生素D受体(VDR)通常用于管理甲状旁腺功能亢进继发于慢性肾病(13]。大量临床观察表明,VDR激活疗法与CKD患者获益的效力顺序:paricalcitol骨化三醇没有VDR激活疗法,独立于甲状旁腺激素(素和钙含量;的生存受益VDR激活代理很可能与降低心血管类死亡率(14- - - - - -18]。行动的机制(s)的心血管和生存利益VDR CKD的激活剂仍不清楚。

VDR已被确定在30多个不同的人体组织包括血管,和新出现的证据表明,VDR可能发挥作用在调节心血管功能19]。激活VDR的维生素D和维生素D类似物(VDR受体激动剂或催化剂,VDRAs)已被证明调节炎症、血栓形成,和vasolidation与内皮功能障碍相关的一些重要风险因素(20.]。然而,它没有被很好地研究在CKD VDRAs如何影响血管内皮功能。5/6进行肾切除手术(NX)尿毒症鼠模型研究肾功能不全是一个有用的模型,被广泛用于评估VDRAs调节血清钙和甲状旁腺素。除了甲状旁腺素升高,5/6尿毒症大鼠内皮功能障碍[发展21),左心室肥大(22),和蛋白尿23]。在这项研究中,我们使用paricalcitol探讨VDR激活是否减轻了有害的尿毒症对内皮功能的影响在5/6 NX老鼠。我们的研究结果表明,内皮功能明显尿毒症妥协而paricalcitol改善内皮功能在尿毒症老鼠剂量依赖性的方式独立于血清甲状旁腺素水平和血压。

2。方法

2.1。材料

Paricalcitol (19-nor-1,25-dihydroxyvitamin D₂,19-nor-125 (OH)₂D₂)和cinacalcet (N - [1 - (R) - ()- (1-naphthyl)乙基]3 - [3 - (trifluoromethyl)苯基]1-aminopropane盐酸)是由雅培公司提供。其他试剂均为分析纯。

2.2。小计进行肾切除手术的老鼠

调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订),雅培公司内部批准的所有实验动物保健和使用委员会。男,Sprague-Dawley老鼠从查尔斯河。切除大鼠进行权衡200克与一个标准的两步外科消融过程(24]。老鼠维持8640年Teklad饮食含有1.13%钙和磷的0.94%。肌酐水平升高证实尿毒症5/6进行肾切除手术的老鼠。

2.3。血管功能的研究

研究了老鼠的尿毒症手术后6周。paricalcitol研究,5/6进行肾切除手术老鼠收到车辆(EtOH 5% / 95%丙二醇;0.4毫升/公斤;i.p)或paricalcitol(剂量显示)3 x /工作在一段12天(6总剂量),和血液被画在天0(24小时前第一个剂量的治疗)和13的最后剂量治疗后(24小时),和肌酐的化验,包子,甲状旁腺素、总钙(Ca)和/或电离Ca (iCa),和磷(π)。cinacalcet研究,尿毒症的老鼠接受车辆(穿孔锥,1.65毫升/公斤;订单)或cinacalcet(30毫克/公斤;订单。)每天13天,血液被画在天0和13(2小时postdose)进行测试。未经处理的,与虚假的老鼠作为控制。在一些研究中,治疗尿毒症的老鼠相比,vehicle-treated尿毒症的老鼠对车辆的影响进行调查。老鼠与戊巴比妥钠麻醉(100毫克/公斤)。 Thoracic aortas were excised, cut into sections and an aortic ring suspended in 10 mL tissue baths under 0.5 grams of resting tension in a modified Krebs solution containing (in mmol/L) 120 NaCl, 20 NaHCO₃,4.7氯化钾,2.5 CaCl 11葡萄糖₂1.5 MgSO₄和1.2 KH₂阿宝₄平衡5%股份有限公司₂-95%啊₂(pH值7.4)。张力记录与草FT03等距传感器(Astro-Med、西Warwich RI)连接到一个草7 d测谎仪和一个Ponemah数据采集系统(Data-Sciences国际、圣保罗、锰)。主动脉被添加苯肾上腺素致敏(PE、3米)和10分钟的间隔之间的褪色。主动脉与PE(预约3米),endothelium-dependent血管舒张药乙酰胆碱(ACh)在对数增量(1 nM-30补充道米)每隔3 - 5分钟,让时间的影响ACh高原。60分钟的冲刷后,主动脉与PE(预约3米),随后处理endothelial-independent血管舒张药硝普酸钠(SNP;1 nM-1米)每隔3 - 5分钟,让时间影响高原。在另一项研究中,虚假和5/6 NX老鼠处理车辆或paricalcitol 0.16克/公斤和主动脉环preincubated 100M L-NAME (N-omega-nitro-L-arginine甲酯)1小时前增加PE引起收缩。由于有限的可用性组织沐浴室,独立不同的治疗方法给不同组的尿毒症的老鼠为了妥善准备放松研究主动脉环。

2.4。测量血清甲状旁腺素和矿物质水平

使用大鼠血清甲状旁腺素测定完整的甲状旁腺素酶联免疫试剂盒获得ALPCO / Immutopics, Inc .(温德姆,NH)。血清钙、π,肌酐,包使用雅培Aeroset浓度测定。血iCa决定使用一个i-STAT临床分析仪,便携式+墨盒。

2.5。测量血压

在另一项研究中,男性Sprague-Dawley 5/6进行肾切除手术的老鼠4周后切除手术植入发射器。短暂、动物和3%异氟烷麻醉,和灵活的导管连接到TA11PA-C40无线电发射机(数据科学、圣保罗、MN)插入到腹主动脉肾动脉下方,推荐的程序数据科学国际(25]。发射机是固定在腹部肌肉和仍在腹腔的持续时间的实验。手术后,老鼠被安置在单独的笼子里放置了一个RPC-1 radiotelemetry接收机(数据科学、圣保罗、锰)。老鼠收到食物和水随意。血流动力学数据收集和总结。老鼠被允许恢复前2周时间均出现剂量。大鼠肾切除术是治疗6周后车辆(EtOH 5% / 95%丙二醇;0.4毫升/公斤;i.p)或paricalcitol 0.042克/公斤,3 x /周14天。虚假的老鼠接受车辆被用作控制。一群老鼠被车辆(i.p。,3 x /周)+卡托普利(10毫克/公斤,订单。,via drinking water, daily for 8 days, then switched to 30 mg/kg for another 6 days. The 30 mg/kg enalapril treatment did not further reduce blood pressure).

2.6。数据分析

血清化学数据,组均值±SEM。虚假的差异和尿毒症的老鼠用单向方差分析对不同的治疗方法进行了评估Dunnett事后测试。配对t检验是用来评估基线差异0(治疗前)和天13(治疗后)或显示。血管功能,疼或者SNP-induced放松方式计算的%的放松PE-induced precontraction。血管功能的差异确定使用双向方差分析,其次是Bonferonni事后测试。

3所示。结果

3.1。尿毒症和Paricalcitol治疗对内皮功能的影响和血液化学

我们检查了尿毒症的影响以及paricalcitol治疗acetylcholine-induced endothelial-dependent放松主动脉环的骗局和5/6 NX老鼠。如图1(一)乙酰胆碱最大主动脉放松反应,虚假的老鼠96.2±5.3% EC₅₀137海里。放松在尿毒症5/6 NX vehicle-treated显著降低大鼠(50.3±7.0%,. 01,EC₅₀211海里)。vehicle-treated之间没有差别的放松反应和治疗尿毒症的老鼠(数据未显示)。改变对乙酰胆碱的反应在5/6 NX鼠表明内皮功能受损。如图1 (b)产生的血管松弛SNP (endothelial-independent血管舒张药)之间没有明显不同的骗局和5/6 NX老鼠,表明主动脉血管平滑肌松弛剂反应是完整和功能。

图1(一)还表明,治疗2周paricalcitol产生剂量依赖性的改善acetylcholine-induced endothelial-dependent放松。0.083治疗克/公斤paricalcitol增加乙酰胆碱最大放松反应90.5±3.8% (EC . 05)₅₀在75纳米。0.042治疗克/公斤paricalcitol改变了电子商务₅₀121海里,增加了最大放松反应乙酰胆碱77.5±6.9% (. 05)。在较小的程度上,治疗0.021克/公斤paricalcitol增加乙酰胆碱最大放松反应58.2±6.0% EC₅₀在105纳米。图1 (b)表明paricalcitol没有显著影响SNP-induced endothelial-independent放松。

如数据所示2(一个)和2 (b)血清肌酐和包子水平显著升高在5/6进行肾切除手术(NX)大鼠与虚假的老鼠相比,指示一个统一的疾病状态。Paricalcitol三个测试剂量对肌酸酐或包没有显著的影响(0)和天图2 (c)表明,正如所料,paricalcitol有效剂量依赖性地抑制血清甲状旁腺素(减少41.6±7.2%,41.6±7.4%和48.2±8.3%,报0.021,0.042和0.083克/公斤,职责)。血清总钙(Ca),磷(π)和电离Ca (iCa)水平没有显著不同的NX老鼠和虚假的5/6。Paricalcitol明显增加血清Ca和iCa在0.042和0.083克/公斤(数字2 (d)和2 (e))。Paricalcitol三个剂量对π水平(图没有影响2 (f))。

3.2。Paricalcitol治疗并不影响血压和心率在5/6进行肾切除手术的老鼠

调查是否通过降低血压paricalcitol改善内皮功能,我们对这些动物的血压和心率。血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂卡托普利被用作控制。平均动脉压(MAP)、收缩压(SP)和舒张压(DP)升高5/6 NX老鼠(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。在心率没有显著差异(图3 (d))。卡托普利表现出温和的和稳定的影响降低平均动脉压、收缩压和舒张压,但没有对心率的影响。作为比较,paricalcitol为0.042克/公斤没有显著影响血压和心率(图3)。符合图的研究2肌酐,paricalcitol没有显著影响,面包,和血清π的水平,同时它也有效地抑制甲状旁腺素和显著增加血清总钙(数据没有显示)。卡托普利并未表现出显著影响肌酸酐,包子,甲状旁腺素、血清钙、或π水平(数据未显示)。这些结果说明paricalcitol为0.042克/公斤并不影响血压,表明paricalcitol 0.042的效果克/公斤改善内皮功能独立于血压控制。

3.3。甲状旁腺素抑制人没有改善内皮功能

探讨血清甲状旁腺素抑制由paricalcitol是否可能导致尿毒症的老鼠改善内皮功能,我们采用一种间接的方式和测试cinacalcet calcimimetic已知抑制甲状旁腺素通过与钙敏感受体独立于VDR交互。与其他两项研究(数据一致2和3)、血清肌酐和包子水平升高在5/6 NX老鼠与虚假的老鼠相比,它没有显著影响cinacalcet治疗30毫克/公斤13天(数据没有显示)。Cinacalcet 30毫克/公斤13天的治疗后导致血清甲状旁腺素下降(减少66.8%与治疗前,图4(一))和血清总钙(减少了23%,图4 (b))。Cinacalcet显著升高血清磷18%(相对于治疗前;数据未显示)。图4 (c)显示最大主动脉放松反应为cinacalcet-treated组乙酰胆碱41.8±4.2% EC₅₀202海里,没有明显不同于尿毒症5/6 NX vehicle-treated组。如图4 (d),而没有显著差异SNP-induced endothelial-independent放松之间的虚假和尿毒症的老鼠,cinacalcet表现出适度的影响减少产生的血管松弛SNP。这些结果表明,甲状旁腺素抑制并不是与内皮功能改善尿毒症的老鼠和paricalcitol改善内皮功能的影响可能是独立于甲状旁腺素的抑制。

3.4。L-NAME废除Paricalcitol改善内皮功能的影响。

进一步研究如何VDR激活改善内皮功能,我们测试了L-NAME的效果。在这个研究中,最大主动脉放松反应乙酰胆碱在虚假的老鼠74.5±3.6% EC₅₀157海里。放松在尿毒症5/6 NX vehicle-treated显著降低大鼠(31.4±4.7% EC₅₀358海里)。如图5(一个)paricalcitol (0.16克/公斤,i.p。,3x/weeks for two weeks) increased the maximal relaxation response to acetylcholine to52.3±9.6% (EC . 05)₅₀在368纳米。添加L-NAME享年100岁米在主动脉环试验完全废除paricalcitol改善内皮功能的影响。在这项研究中,血清甲状旁腺素水平显著降低,而血清钙水平不是由paricalcitol改变(数字5 (b)和5 (c))。

4所示。讨论

先前已经表明,在自发性高血压大鼠(月)内皮功能受损,口服维生素d3(维生素D₃)治疗显著提高endothelium-dependent血管松弛和乙酰胆碱引起的超极化26]。黄等。27)也表明骨化三醇敏锐地减少endothelium-dependent收缩在自发性高血压大鼠的主动脉。Karavalakis et al。28)报道,在5/6进行肾切除手术的特殊饮食喂养的大鼠诱发严重的高磷血症,paricalcitol为0.2克/公斤减少血管收缩,但增加大型动脉钙化。作为对比,我们的结果表明,paricalcitol改善内皮功能在5/6 NX鼠与正常血清磷水平。

更重要的是,我们的数据表明,paricalcitol并不影响血压的尿毒症的老鼠在治疗期间,表明paricalcitol改善内皮功能的影响独立于血压控制。我们的观察是一致的这一发现由Bodyak et al。29日]paricalcitol减毒的发展达尔食盐过敏大鼠左心室异常(不同的实验模型的5/6进行肾切除手术尿毒症老鼠)对血压无显著影响。Karavalakis et al。28)也报道称,在5/6进行肾切除手术的特殊饮食喂养的大鼠诱发严重的高磷血症,paricalcitol为0.2克/公斤并不影响血压。在一项研究中报道Mizobuchi et al。23),5/6进行肾切除手术尿毒症老鼠开发重要的高血压,也不是受paricalcitol (0.8克/公斤)经过4个月的治疗期间,而卡托普利有效降低血压。然而,值得一提的是,在弗伦德里希等人的研究。30.],系统性血压,增加在所有组肾消融(与虚假的老鼠),显著低于大鼠治疗paricalcitol在0.1或0.3克/公斤。此时不知道为什么结果从不同的实验室在一个适当的类似尿毒症大鼠模型。高血压内皮功能障碍[密切相关8]。许多药物,改善内皮功能也控制高血压,很难描绘这些药物对这两个参数的影响。像慢性肾病患者,5/6 NX老鼠有严重高血压和内皮功能障碍。观察从这项研究意味着可以改善内皮功能在CKD独立于血压控制。

在这项研究中,由于短期治疗(2周),paricalcitol没有显示影响血清肌酐和面包。弗伦德里希等人的研究。30.)报道,血浆肌酐水平,升高与肾消融所有组,两周后开始下降paricalcitol(0.1和0.3克/千克)在5/6进行肾切除手术治疗尿毒症的老鼠,最终达到的水平与虚假的老鼠和明显低于在参与5/6 NX老鼠。此前它已被证明23),在经过4个月的治疗期肾切除术后,血清肌酐的增加并不paricalcitol (0.8克/公斤)组比未处理组,虽然差异没有统计学意义。

高甲状旁腺素已被证明参与各种心血管疾病包括异常血管舒张(31日]。之前它也表明,在原发性甲状旁腺功能亢进患者甲状旁腺切除术显著提高内皮血管扩张性函数(32]。目前的研究表明,甲状旁腺素抑制不是与内皮功能的改善尿毒症鼠cinacalcet以来,calcimimetic,改善内皮功能不显示显著的影响虽然有效地抑制甲状旁腺素。这些数据感兴趣的符合临床观察的生存受益VDR激活血液透析患者的治疗观察不同血清甲状旁腺素的水平(14,15]。

我们注意到的不一致的影响paricalcitol主动脉放松从研究在数据研究明显1和5。Paricalcitol 0.083在图克/公斤1研究几乎内皮功能正常化虚假的水平,而paricalcitol为0.16在图克/公斤5研究只是部分改善内皮功能。几种可能存在差异。Paricalcitol骨化三醇的高剂量可能会降低当地的活动或通过CYP24 Paricalcitol归纳。Paricalcitol高剂量也可以增加血管钙化,从而导致减少主动脉放松。或者,它可能是不一致的结果paricalcitol对血清钙的影响在不同批次的5/6进行肾切除手术尿毒症的老鼠。感兴趣的注意,血清钙含量的变化可能会影响血管内皮功能。所需的钙是一氧化氮合酶的活性,因此,增加细胞外和细胞内钙浓度可能刺激一氧化氮(NO)生产。血清钙的增加也可能改变细胞内钙水平,导致的内皮calcium-sensitive钾离子通道(K(+)频道)和血管放松。Jolma et al。33)报道,高钙饮食增强抵抗动脉放松在5/6 NX老鼠可能由K(+)通道。这种效应是独立的肾功能损害的程度和血压,但与改进的钙代谢有关,因为血浆甲状旁腺素水平和磷减少,血清钙增加。在0.021 - -0.16的剂量范围使用在这项研究中,克/公斤paricalcitol有时提高血清钙;影响不同研究研究和变异的原因还不是很清楚。例如,努南et al。34在0.083和0.167)表明,paricalcitol克/公斤提高血清钙水平而Wu-Wong et al。35)报道,paricalcitol为0.17克/公斤不影响血清钙水平。如数据所示1和2,paricalcitol 0.083克/公斤提高血清钙和内皮功能完全规范化的虚假的水平。作为比较,paricalcitol为0.167克/公斤(图5)没有提高血清钙,只是部分内皮功能正常化。符合这个概念,因为血清钙显著低于cinacalcet研究(图4),我们不能排除这样一种可能性,即缺乏cinacalcet对内皮功能的影响可能是由于cinacalcet治疗后血清钙水平下降。

博尔赫斯et al。26)表明,在月鼠模型中,维生素d3改善内皮功能可能由endothelium-derived超极化因子,但不是一氧化氮。然而,越来越多的证据表明,系统性不缺乏内皮功能障碍的主要原因是慢性肾病(36]。在血液透析患者,临床研究帕骚et al。37)报道,尿毒症患者的内皮功能障碍由endothelium-dependent血管舒张,以应对增加乙酰胆碱的剂量主要归因于没有活动下降。Yamamizu et al。38)也报告说的减少没有生产的关键因素与内皮功能障碍在5/6 NX老鼠。我们的数据支持的角色没有在CKD L-NAME完全废除paricalcitol改善内皮功能的影响在尿毒症的老鼠。结果表明paricalcitol治疗恢复系统性不活动5/6尿毒症的老鼠。一氧化氮生成减少,旁边的积累不对称dimethylarginine (ADMA,内源性一氧化氮抑制剂)也是导致内皮功能障碍。我们做了一个搜索,但没有找到任何发表在VDR激活和ADMA工作。虽然超出了本研究的范围,初步数据从使用DNA微阵列技术分析主动脉在5/6 NX老鼠基因表达分析表明,尿毒症相关基因的异常表达参与增加氧化应激和paricalcitol治疗规范化这些基因(39]。很少有人了解VDR和氧化应激。我们希望这项研究的观察会刺激其他人做进一步调查对VDR在调节NOS的角色,ADMA,和其他因素参与氧化应激。

总之,VDR paricalcitol显著改善内皮功能激活的5/6 NX尿毒症的老鼠。更重要的是,paricalcitol的影响独立于血压控制和血清甲状旁腺素的水平。虽然随机临床研究需要确定的心血管和生存利益VDR激活疗法在CKD患者中,数据从当前的研究提供了一个重要的新的见解,VDR在尿毒症激活改善内皮功能,这可能是一个负责心血管获益的机制与这些药物在慢性肾病有关。