文摘
背景。Denosumab,人类单克隆抗体与受体激活核factor-kappa B的配体(RANKL)是一种新型开出抗再吸收剂用于骨质疏松症患者的骨或转移性骨癌。Denosumab-related骨坏死的下巴(DRONJ)最近报道的患者使用denosumab。然而,DRONJ机制并不完全理解。适当的DRONJ致病机制尚未建立。因此,我们研究了老鼠DRONJ的发病机理。方法。Anti-mouse RANKL单克隆抗体,美法仑进行创建DRONJ-like损伤的小鼠模型女C57BL / 6 j小鼠。我们检查了DRONJ-like损伤和免疫功能的发展。结果。我们表明,管理anti-mouse RANKL单克隆抗体和美法仑DRONJ-like病变重现人类疾病的主要临床表现,包括开放的牙槽的特征和暴露坏死的骨头。DRONJ-like分析使用鼠标模型的损伤,据透露,anti-mouse RANKL单克隆抗体,美法仑抑制自身免疫调节器(问卷调查)表达胸腺和不平衡T细胞数量。结论。这项研究表明证据的immunity-based DRONJ-like疾病的机制。这项工作可能有助于更好的理解人类DRONJ的发病机理。
1。介绍
Antiresorptive药物目前正在用于治疗骨骼脆弱,如骨质疏松症。发现的受体激活核factor-kappa B(排名)及其配体,RANKL通路,导致治疗骨质疏松症的新代理的发展(1]。Denosumab是人类单克隆抗体的RANKL和抑制破骨细胞的结合RANK-binding网站开发(2]。Denosumab-related骨坏死的下巴(DRONJ)患者一直在报道denosumab [3]。DRONJ非常严重,但目前没有推荐的治疗方法。重要的是要澄清的发病机制DRONJ为了开发一个有效的治疗和预防方法。因此我们推测,RANKL异常信号负责DRONJ的发展。据报道,RANKL也是一个至关重要的细胞因子形成胸腺等免疫组织和淋巴结4]。目前的研究之间的联系DRONJ开发和使用小鼠免疫功能验证。
2。方法
2.1。动物
本研究采用C57BL / 6 j小鼠(4周大的女性;制药实验室,日本札幌)。所有动物实验进行下一个制度批准协议的使用动物研究北海道大学(第15号- 0015)。老鼠在动物设施控制温度和湿度,并在12小时光/暗周期。随意提供食物和过滤水。
2.2。DRONJ-Like损伤的小鼠模型
Denosumab是人类单克隆抗体对RANKL和没有老鼠亲和力;因此,我们使用了一个anti-mouse RANKL单克隆抗体(anti-RANKL;东方酵母有限公司,日本东京)在小鼠诱导DRONJ-like病变。DRONJ-like损伤小鼠(n= 7),1.0毫克/公斤anti-RANKL和7.0毫克/公斤的美法仑(Mel;葛兰素史克、东京、日本)通过尾静脉注射静脉注射一周一次。控制老鼠(n= 7)收到1.0毫克/公斤的控制鼠腹腔内注射免疫球蛋白单克隆抗体(日本东京和光纯化学公司,富士胶片kouichi)一周一次。注射后一个星期,上颌第一磨牙提取在全身麻醉下使用戊巴比妥(饲公司(日本东京)。4周后牙齿提取,使用二氧化碳,老鼠收获有限公司2(图1(一))。
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2.3。Microcomputed断层扫描(μCT)
上颌骨标本扫描使用μCT (LaTheta lct - 200;日立Aloka医疗、有限公司、日本东京)24μ米50 kV立体像素分辨率的能级。
2.4。组织学分析
后μCT扫描,上颌骨脱钙10%乙二胺四乙酸(EDTA) PBS (pH值7.4)。上颌骨和胸腺是嵌入在石蜡在乙醇脱水后。样本切成8µ米部分和苏木精和伊红染色进行())。
2.5。免疫组织化学
Deparaffinized部分胸腺洗,内源性过氧化物酶活动就熄了在甲醇浸泡在3%过氧化氢。部分被孵化与antiautoimmune调节器(问卷调查)抗体(1:200稀释,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h。同形像控制抗体(Sigma-Aldrich)在相同的条件下使用。SuperPicTure聚合物检测设备(美国酶/表达载体,卡尔斯巴德,CA)是用于酶免疫组织化学染色按照制造商的协议。
2.6。末端转移酶(TdT)介导的dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定
TUNEL分析工具包(HRP-DAB) (Abcam,剑桥,英国)是用于检测凋亡细胞胸腺根据制造商的指示。为每个组,阳性细胞的数量在随机选择大功率领域在皮质和髓质地区使用光学显微镜计数。
2.7。流式细胞术
胸腺细胞、外周血单核细胞(PBMCs)和脾细胞被流式细胞术分析。胸腺细胞和PBMCs沾异硫氰酸荧光素(FITC)共轭anti-CD4(美国BioLegend,圣地亚哥,CA)和藻红蛋白(PE)共轭anti-CD8抗体(BioLegend)。脾细胞是沾FITC-conjugated anti-CD4和allophycocyanin (APC)共轭anti-CD25 (BioLegend),固定的,并使用FOXP3 permeabilized修复/烫缓冲区设置(BioLegend)和沾PerCP-Cy5.5-conjugated anti-FOXP3 (BioLegend)根据制造商的协议。样本运行章使用流式细胞仪(BD生物科学PharMingen,富兰克林湖,新泽西,美国)。
2.8。统计分析
结果表示为±SD的手段。整体比较用方差分析,统计差异组由Bonferroni的测试。数据值< 0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。在老鼠身上Anti-RANKL / Mel管理提高DRONJ-Like病变
初步实验研究了一个政府是否anti-RANKL和梅尔·DRONJ引起的。结果显示,所有老鼠single-administrated anti-RANKL梅尔并没有开发DRONJ-like病变,如未能与正常粘膜伤口愈合或骨形成(附录表和附录数据1- - - - - -3)。临床发现拔牙网站显示的上皮完全关闭100% 7(7)控制老鼠的免疫球蛋白单克隆抗体注射小鼠(免疫球蛋白)(图1 (b))。相比之下,anti-RANKL和梅尔·管理老鼠(anti-RANKL / Mel), 42.9%(3 7)的小鼠暴露骨上皮(图上没有完全关闭1 (c)。的μCT扫描在拔牙网站证实,免疫球蛋白在套接字充满了新骨。anti-RANKL /梅尔,有一个未被吸收的牙槽嵴和一个套接字(图内没有骨生成1 (c))。此外,组织学检查显示,免疫球蛋白提取网站的上皮覆盖,没有暴露的骨头(图1 (b))。另一方面,典型的发现颚骨坏死的,如破损的口腔粘膜组织,缺乏结缔组织层,和空的缺陷,确定了提取现场anti-RANKL /梅尔(图1 (c))。颚骨坏死的面积与空裂陷在免疫球蛋白为1.9±3.9平方毫米,显著高于anti-RANKL /梅尔在anti-RANKL /梅尔(23.9±10.5平方毫米 )(图1 (d))。此外,空裂陷计数明显高于( )anti-RANKL / Mel相比,免疫球蛋白(分别为76.5±11.9和4.0±4.0)(图1 (e))。
3.2。Anti-RANKL / Mel诱导的免疫抑制和免疫耐受的障碍
调查anti-RANKL组合管理和梅尔·如何影响免疫功能,研究了胸腺(关键免疫器官)形态、组织学和免疫。免疫球蛋白的胸腺宽直径是8.2±0.8毫米,而胸腺宽度anti-RANKL / Mel直径为5.3±0.5毫米(数字2(一)a - c c)2(a2 (c))。胸腺宽直径的减少也简约梅尔单接种小鼠和anti-RANKL单管理的老鼠。梅尔单接种小鼠胸腺宽度为5.8±0.2毫米( ),而anti-RANKL单接种小鼠胸腺宽度为6.7±0.6毫米( ),这两个明显萎缩而免疫球蛋白(附录图4)。确定发生在胸腺萎缩,胸腺皮质和髓质领域的测量部分。这导致减少皮质从58.7±23.2平方毫米到20.8±12.4平方毫米的大小大约30% ( )(图2 (d))。另一方面,在髓质,减少从11.4±3.7平方毫米到2.4±1.0平方毫米( )(图2 (d))。anti-RANKL /梅尔,髓质明显减少,并证明anti-RANKL管理/梅尔对髓质有更多的影响。TUNEL染色胸腺组织来确定执行anti-RANKL / Mel影响胸腺的功能。Anti-RANKL / Mel 79.6±12.3 TUNEL阳性细胞的髓质。这是243.0±74.9相比显著降低细胞免疫球蛋白( )(数据3 (b)和3 (c))。此外,有83.7±15.6 TUNEL阳性细胞在大脑皮层anti-RANKL /梅尔。这是134.8±25.5相比显著降低细胞免疫球蛋白( )(数据3 (b)和3 (c))。
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为了检查治疗对免疫的影响,从胸腺T细胞分离,外周血和脾脏拔牙后4周。流式细胞仪进行使用胸腺细胞和PBMCs, CD4和CD8细胞的表达是量化。CD4 + CD8 T细胞阳性的比例(CD4 SP)胸腺显著减少anti-RANKL /梅尔与免疫球蛋白g相比,3.6±0.2%的免疫球蛋白g和1.9±0.6% anti-RANKL /梅尔( )(数据4(一)和4 (d))。的百分比CD4-CD8 + SP T细胞(CD8 SP)没有明显不同于0.4±0.1%免疫球蛋白g和0.5±0.1% anti-RANKL /梅尔(数据4(一)和4 (d))。的百分比CD4 + CD8 +双阳性T细胞(CD4CD8 DP)没有显著不同的免疫球蛋白g和93.8±95.7±0.3% anti-RANKL /梅尔(数据为1.7%4(一)和4 (d))。另一方面,在外周血CD4 SP的比例没有明显不同于19.9±2.6%免疫球蛋白g和20.3±9.4% anti-RANKL /梅尔(数据4 (b)和4 (e))。CD8 SP的比例没有明显不同于12.2±2.4%的免疫球蛋白g和11.1±6.5% anti-RANKL /梅尔(数据4 (b)和4 (e))。然而,CD4CD8 DP的百分比显著增加anti-RANKL /梅尔与免疫球蛋白g相比,0.2±0.1%的免疫球蛋白g和4.3±3.0% anti-RANKL /梅尔( )(数据4 (b)和4 (e))。我们检查了CD4 + CD25 + Foxp3 +调节性T细胞(Treg)脾脏。Treg细胞的百分比为7.4±2.4%相比,免疫球蛋白在anti-RANKL / Mel 2.8±0.5%。这表明Treg显著降低在anti-RANKL /梅尔( )(数据4 (c)和4 (f))。
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4所示。讨论
动物模型是解决DRONJ疾病发病机理的关键工具。因此,几个DRONJ小鼠模型已报告。这些文件已经被管理设计了诱导DRONJ大剂量的除了anti-RANKL anti-RANKL或结合其他药物。250年威廉姆斯等人管理μ克anti-RANKL八次总共2毫克的4周期间的开始药物治疗和牺牲5]。鉴于denosumab剂量治疗骨骼病变或固体肿瘤骨转移引起的多发性骨髓瘤在人类身上是120毫克,假设25克的重量在这个实验中,使用的小鼠的用量anti-RANKL管理这个实验的老鼠与剂量约30至40倍人的剂量。Hayano等人也注射环磷酰胺(CY)、烷化剂,除了anti-RANKL开发ONJ-like病变(6]。的总剂量anti-RANKL管理在这项研究中大约是0.4毫克,大约6到8倍人的剂量。有趣的是,DRONJ-like病变没有出现在一个单一的CY anti-RANKL或一个行政管理。这些结果表明,CY DRONJ的发展中扮演着关键角色。在这项研究中,而不是CY,我们使用梅尔,这是相同的烷化剂,但有更多的免疫抑制效果。单一anti-RANKL和单一管理梅尔并没有导致DRONJ-like病变小鼠,但联合政府造成的anti-RANKL和梅尔·DRONJ-like病变老鼠。此外,在初步研究中,我们比较了管理水平的anti-RANKL(0.1毫克/公斤,0.5毫克/公斤和1.0毫克/公斤)在一个常数剂量的梅尔(7毫克/公斤)。我们发现DRONJ-like病变的发生率增加浓度的方式在anti-RANKL(数据没有显示)。管理协议的研究是一个重要的分析模型为澄清DRONJ因为DRONJ-like病变的发病机制是减少了剂量接近anti-RANKL管理,用于人类。
我们认为降低免疫功能和运动身体的免疫细胞anti-RANKL /梅尔是搜索。有趣的是,胸腺的大小被证实是萎缩性anti-RANKL /梅尔(图所示2)。胸腺也萎缩性anti-RANKL单接种小鼠和梅尔·单管理的老鼠。然而,当两人相比,胸腺萎缩是更加明显在梅尔单一管理老鼠(附录图4)。有趣的是,这是发现胸腺萎缩的浓度的方式anti-RANKL恒定浓度的梅尔(附录图4)。这些发现表明,标志着anti-RANKL胸腺萎缩发生/梅尔梅尔myelosuppression诱导的结果。此外,anti-RANKL可能协同作用。胸腺是免疫系统的初级淋巴器官,作为T细胞的发育组织功能。在大脑皮层,最早的T细胞表达CD4和CD8,和被归类为CD4-CD8-DN T细胞细胞(DN) [7]。CD4CD8 DN导致TCR的重排β基因在胸腺皮质和区分CD4CD8 DP T细胞(DP细胞)。DP细胞位于皮层,皮层胸腺上皮细胞的作用(cTEC)中T细胞反应迟钝的主要组织相容性复合体MHC(积极的选择)8]。DP的细胞保持积极的选择迁移到髓质,但包含许多autoreactive T细胞对自体的细胞的反应很强烈。因此,autoantigen-reactive T细胞被淘汰(负选择)行动的髓质胸腺髓质上皮细胞(mTECs)。T细胞发生了消极的选择获得中央宽容自体抗原(9]。中断胸腺髓质内的中央宽容导致自身免疫性疾病因为autoreactive胸腺T细胞不清除。重要的是反应强烈结合自体抗原T细胞在胸腺消除。建立T细胞自我耐受性mTEC通过亚耳河和起着关键作用的表达对负公差选择(10- - - - - -12]。涂画或损失或功能性突变在人类已经报道导致自身免疫性疾病的发展,如自身免疫性polyendocrinopathy-candidiasis外胚层的营养不良和polyglandular综合征1型(13,14]。还报道说,失去亚耳河导致系统性自身免疫性表现类似人类[15]。有趣的是,亚耳河被激活在mTEC秩信号,CD40和排名已经被证明在代mTEC扮演重要角色(16]。一些研究调查了细胞RANKL的来源和CD40 L与不成熟的T细胞相声和胸腺髓质形成(17]。没有等级表达导致的频率明显减少亚耳河在胎儿和成人胸腺(18]。缺缺秩和等级/ RANKL双也爆发导致自身免疫介导的19]。此外,据报道,转基因小鼠的胸腺扩大亚耳河(20.]。因此,anti-RANKL管理可能会导致减少的表达涂画和胸腺萎缩。
事实上,在anti-RANKL /梅尔,胸腺萎缩(图2)。这是证明的胸腺anti-RANKL /梅尔,只有轻微的涂画或阳性细胞的表达。这涂画或阳性细胞数量的减少可能是由于anti-RANKL阻塞管理等级/ RANKL信号不成熟的T细胞和mTEC之间。问卷调查的功能是杀死autoreactive T细胞的凋亡。因此,我们研究如何在胸腺细胞发生细胞凋亡的数量改变。许多TUNEL阳性细胞免疫球蛋白被确定,而TUNEL阳性细胞显著减少在anti-RANKL /梅尔。这可能表明涂画的缺乏并不能消除autoreactive T细胞。接下来,外周血T细胞的分布是检查,和CD4CD8 DP确认的外周血anti-RANKL /梅尔。由于CD4CD8 DP没有检测到免疫球蛋白,CD4CD8 DP外周血中似乎autoantigen-reactive T细胞,应该消除负选择涂画的髓质。在之前的报告中,外围CD4CD8 DP报道扮演一个角色在一些自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病。 For example, CD4CD8 DP has been reported to be found at high levels in the peripheral blood of individuals with multiple sclerosis, which is an autoimmune disease [21]。CD4CD8 DP的外围增加严重类风湿性关节炎(22]。CD4CD8 DP在这些疾病的存在表明他们的参与他们的发展。另一方面,Treg细胞抑制免疫反应和负责抑制过度的免疫反应,导致自身免疫,炎症和过敏性疾病,从而起到了一定的作用,在外围组织的免疫耐受。缺乏涂画或鼠标模型是伴随着缺陷胸腺细胞的发展。互动mTEC表达涂画或胸腺被报道为关键的成熟和随后的稳定Treg细胞的表型和抑制的活动(23,24]。在这项研究中,Treg细胞的数量的脾脏anti-RANKL /梅尔与免疫球蛋白g相比明显减少。我们推测这Treg细胞数量的减少是由于涂画或积极的胸腺细胞的减少。我们推测,Treg细胞在脾脏的减少意味着破坏周边的宽容。这些发现表明,DRONJ的发展可能是由于外周免疫耐受的破坏,因为减少的表达胸腺的问卷调查。
5。结论
我们创建了一个小鼠疾病模型非常类似于人类DRONJ。我们的研究结果表明,免疫反应的一个失衡是DRONJ的发病机理。虽然DRONJ可能的病理生理学复杂,受多种因素的影响,中断在胸腺T细胞的发展起着直接在DRONJ病因的作用。我们所知,这是第一个实验研究说明免疫异常的T细胞的人口也涉及DRONJ的致病机制。在人类中,免疫动力学的人发展DRONJ应该调查,但发展DRONJ可能增加的风险在牙齿中提取免疫功能异常的存在。本研究将允许治疗策略的发展和治疗人类DRONJ代理。
数据可用性
在这项研究中使用的数据是可用的。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
YN导致数据采集、分析和解释,并起草了手稿;TK导致数据采集、分析和解释,起草了手稿,和极度修订后的手稿;毫米,TS、DI和DY导致数据采集和极度修订后的手稿;是导致数据分析和批判性的修订后的手稿;YY了概念、设计、起草了手稿,和极度修订后的手稿;和YK导致了概念和批判性的修订手稿。所有作者最终批准和同意负责所有方面的工作。
确认
作者透露收到以下金融支持研究,作者,和/或出版这篇文章的:支持的这项工作是科研补助金(KAKENHI格兰特JP20K10219号、JP19K18280 JP16K11670)的日本社会。
补充材料
附录表:总结临床和组织学发现老鼠的免疫球蛋白g管理、anti-RANKL / Mel管理和单梅尔管理。附录图1:拔牙后4周,小鼠接受anti-RANKL在恒梅尔的剂量。附录图2:坏死骨免疫球蛋白行政区域,anti-RANKL / Mel管理和单一梅尔管理。附录图3:免疫球蛋白的空的坏死骨缺损区域管理、anti-RANKL / Mel管理和单梅尔管理。附录图4:宽长度胸腺的免疫球蛋白g管理、anti-RANKL / Mel管理和单梅尔管理。(补充材料)