文摘

客观的。探讨DNA甲基化通过焦磷酸测序及其对白细胞介素6的upregulation信使rna的影响患者的复发性口疮的口腔炎(RAS)与补血的缺乏和特异反应性。材料和方法。这个横断面研究哈桑博士Sadikin医院,万隆,从1 2019年卫生研究伦理委员会批准意大利Padjadjaran(道德作品990号/ UN6.KEP / EC / 2018)。此外,受试者RAS溃疡史的至少每年两次特异反应性和饮食不平衡没有intraoral疱疹复发或任何系统性疾病的历史。本研究进行了RAS患者和21个健康受试者,23日和抽样进行了连续。血液样本收集的所有主题,然后,DNA和RNA的提取外周血单核细胞(PBMCs)。因此,bisulfite-modified DNA是用来证实白细胞介素6基因启动子的甲基化状态通过焦磷酸测序方法。白细胞介素6启动子的甲基化水平被反向transcriptase-polymerase连锁反应技术评估。RAS和对照组的基因表达分析2^−ΔΔC_T方法。使用Mann-Whitney统计分析U白细胞介素6测试进行评估信使rna和DNA甲基化水平值< 0.05被认为是具有统计学意义。结果。白细胞介素6 mRNA水平大约1.88倍的RAS的病人,还有一个重要的关系的表达白细胞介素6基因和RAS的风险增加 。据报道,四个中的6个地点磷酸胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)白细胞介素6岛启动子甲基化程度较低,和另外两个网站在RAS患者更大的甲基化与控制相比,但没有统计学意义。结论。这项研究显示,RAS患者白细胞介素6的upregulation mRNA水平相比,控制。DNA甲基化在目前的研究是在站点566 - 658年,而白细胞介素6子的位置是在站点1 - 1684。因此,它需要进行一些研究白细胞介素6子群岛的其他CpG网站确定DNA甲基化的状态。

1。介绍

复发性口疮的口腔炎(RAS)是一种常见的口腔溃疡由全球牙科专业人士,发现和RAS的患病率之间的不同人群。此外,RAS的患病率55%和35.6%被发现在牙科诊所的2010 - 2012和2014 - 2015年,分别为(1,2]。其他研究中进行了18岁的青少年在巴西发现的人口为24.9% (3),约10.84% RAS也发现在土耳其(4),据报道14%女性哈立德国王大学牙科学生沙特阿拉伯(5据报道,29.38%的大学生在北京中医药大学(6]。拉被认为是一种病因不明的多因子的过程,各种触发因素和免疫干扰相结合,包括基因(7,8)、维生素b12、叶酸和铁缺乏症(9,10)和过敏情况,如特异反应性(11,12]疼痛或不舒服的感觉,它出现在口腔总是抱怨有拉一个人,和这个条件让研究人员感兴趣的发现RAS的发病机制及其终极目标,找到适当的小说疗法(13]。

拉是一种慢性口腔炎症性疾病与炎症机制,其中一个重要的调节器可能诱发并确定类型的免疫反应是白介素6(白细胞介素6)[14]。免疫系统和异常细胞因子级联事件被认为是关键的RAS溃疡(15,16]。免疫学上的先前的研究资料的RAS患者表现出显著差异分布的血清细胞因子水平,主要是白细胞介素- 6(白细胞介素6),被称为最有效的促炎细胞因子在RAS发现约16%的和0%的控制(),这是显示在RAS组显著高于控制(17]。

特异反应性是遗传素质开发环境引发的过敏症状抗原(过敏原),会使一个潜在的异常2型炎症过程(18,19]。特异反应性是3月有过敏性疾病,从轻微到严重的症状。家族史的个体特异反应性高的趋势经历上述条件,如过敏性鼻炎、过敏性皮肤炎,甚至支气管哮喘(20.]。特异反应性免疫反应的特点是分泌的il - 4, IL-5, IL-13。然而,白细胞介素6已经被证明可以促进CD4 + T细胞的分化成Th2细胞产生il - 4。先前的研究发现,白细胞介素6水平特别高与健康对照组相比,哮喘受试者(21]。一些研究表明,更高的多态性之间的关联在白细胞介素6−174 G / C (rs 1800795)和支气管哮喘过敏性患者的观察(22]。Gharagozlou等人也进行了研究,发现-174 G等位基因明显更频繁的位置在过敏性患者比健康对照组白细胞介素6 (23]。基于来自许多研究的证据,在特异反应性白细胞介素6的一个主要炎症介质也RAS复发中起着重要作用。初步研究还显示显著差异在白细胞介素6日志级别过敏性和RAS组与对照组相比24]。

白细胞介素6基因编码一个细胞因子在炎症和功能的成熟B细胞(25]。产生的蛋白质主要是网站的急性和慢性炎症,它分泌出的血清(26]。白细胞介素6基因的遗传变异的作用(rs1800795)检查在RAS (27- - - - - -29日]。RAS是已知的遗传背景,特异反应性和两种疾病也会受到环境因素的影响由于一些生活方式因素,如消费的食物与营养不平衡(30.- - - - - -32]。

表观遗传学被公认为最重要的一个机制在调节基因功能和表达对不同细胞类型(33]。营养和其他生物活性食品组件潜在的调节基因的表达,如叶酸和维生素b12。叶酸是一种携带和化学激活单一碳代谢代数余子式的嘌呤核苷酸的生物合成和thymidylate remethylation同型半胱氨酸的蛋氨酸,代谢网络称为folate-mediated一个碳代谢。反过来,蛋氨酸可以adenosylated形成S-adenosylmethionine(山姆),这是一个辅被用物几个细胞甲基化反应。嘌呤和thymidylate所需DNA合成,需要和山姆基因组甲基化(34]。

DNA甲基化是一种表观遗传因素密切相关,营养素和微量元素。营养不良的人通常也有微量营养素缺乏,包括补血药(35]。一个受损的DNA甲基化状态可以通过适当的饮食干预来解决36]。RAS治疗,常用的是复合维生素补充,和大多数人不熟悉叶酸、铁、维生素b - 12的RAS疗法。本研究研究首次确定DNA甲基化中扮演着重要的角色在白细胞介素6基因的表达个人史的RAS特异反应性和补血的缺陷(图1)。

2。材料和方法

2.1。患者和健康对照研究

哈桑博士的横断面研究Sadikin医院,从1 2019年的万隆卫生研究伦理委员会的批准后意大利Padjadjaran(道德作品990号/ UN6.KEP / EC / 2018)。目标人群是受试者在RAS,特异反应性和补血的不足。入选标准包括受试者在18岁和40年经历RAS每年两次的复发。在RAS在活跃阶段,历史的特异反应性(过敏性皮肤炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎),以及饮食不均衡和补血的缺陷(铁、维生素B12、叶酸),是基于实验室检查的结果(ELISA叶酸和维生素B12用Rayto®,铁蛋白,和总CLIA IgE用XPT材料®)。排除标准intraoral疱疹复发,胃肠道功能紊乱、血、系统性疾病。最小样本量为每组20岁,来自一个未配对数值分析设计。招聘进行了基于主题包含和排除标准连续而不刺眼。

知情同意是入学前,受试者被要求填写一些问卷形式对RAS的历史,特异反应性,和饮食习惯的食物频率问卷形式。一个口试,和两种形式记录,即。口腔黏膜,齿纹形式和形式。

这个话题准备5毫升血液样本的静脉穿刺方法的临床病理学助理。完整的血细胞计数和血清学(IgE anti-HSV 1 IgM和免疫球蛋白,叶酸,维生素b - 12和铁蛋白)进行。任何学科积极anti-HSV1结果排除在外。

2.2。RNA隔离

总RNA提取外周血单核细胞(PBMCs)根据Zymo研究®Quick-RNATM MiniPrep +设备指令目录R1058数量。总RNA的纯度和浓度估计的使用热科学Nanodrop 2000®在260 - 280海里,RNA的纯度是评估。通过凝胶电泳显示的总RNA的个体样本1%的琼脂糖凝胶38]。下一步在获得RNA是执行反向transcriptase-polymerase连锁反应(RT PCR)过程(39]。

2.3。RT PCR过程

RT PCR过程使用的材料是10µl Sybr敏感性,向前底漆白细胞介素6基因(5′GCT TCT棉酚CCA GCT TGA CC-3′)和白细胞介素6基因反向引物(5′gcc柠檬酸广汽ATC太极拳AGT CC-3′),底漆向前基因参考(GADPH) (5′CCC CAC ACA猫GCA CTT ACC-3′)和反向引物GADPH(5′有条件现金援助AGT CCC gg GCT TTG ATT-3′), 0.8µl, 0.1µ0.2 l逆转录酶µ6.1 l ribosafe抑制剂,ul H₂o .所有材料都是根据样品检验的数量增加(40]。所有材料放入到埃普多夫管处于冻结状态。混合物是放置在一个18岁µl PCR管,然后增加了2 ul RNA模板的方式最终成交20 ul。下一步是将PCR管插入转子问®RT基因PCR机2.5小时,包括几个阶段,即互补脱氧核糖核酸合成、逆转录酶失活,变性、退火。举办周期:42°C, 5分钟,持有2:95°C 2分钟,骑车95°C,持续10秒,30秒内温度60°C, 40倍。

2.4。RT PCR数据分析

结果和数据提出了循环阈值(C_T),然后分析相对量化方法使用2^−ΔΔC_T公式(Livak) [41]。δC_T(ΔC_T)拉组被定义为的减法C_T白细胞介素6和C_T基因参考(GADPH)。δC_T(ΔC_T对照组)也使用相同的计算公式。δδC_T(ΔΔC_T)被定义为两国Δ的减法C_T,从ΔΔ基因表达来实现C_T样(41,42]。

2.5。制备DNA和Bisulfite-Treated基因组DNA样本

从白细胞中提取DNA的协议(外周血单核细胞(PBMC)需要工具,如离心机、各种大小的水洗澡,微量吸液管(10、200和1000µl)、集中器和1.5毫升超小型电子管,以及材料包括红细胞溶解溶液1 x,醋酸铵5 M,细胞溶菌作用的解决方案,核糖核酸酶4毫克/毫升,异丙醇,70%乙醇,TE缓冲pH值8。300年所需的DNA的准备µl血液(全血),900µl 1 x红细胞溶解溶液添加到埃普多夫管然后摇晃几次。解决方案是储存在室温下至少10分钟。10分钟后,解决方案是放入离心机与13000 - 16000 RPM 20秒钟的速度获得白细胞颗粒(PBMC)。上层清液被移除,然后重复,直到没有更多的血红细胞,然后由涡混合直到均匀大约20秒,和300 L细胞溶菌作用的解决方案是添加,直到均匀通过吸管溶解细胞。核糖核酸酶1.5µl 5毫克/毫升的浓度增加了管和孵化37°C水浴至少15分钟。

下一步是添加蛋白质溶液沉淀(沉淀蛋白质),也就是说,5µl醋酸铵溶液,然后漩涡,直到解决方案看起来像牛奶,然后离心3分钟。包含DNA的上层清液转移到一个新的埃普多夫管装满600µl异丙醇,这是混合几次直到DNA看起来像一根白线。使离心1分钟后,DNA会看起来像一个白色的沉淀物。浮在表面的移除,然后,大约600µl 70%的冷酒。管是翻了几次洗DNA。同样,DNA颗粒离心5分钟后得到。酒精被丢弃,管不得干了把它组织,直到酒精蒸发。50的颗粒被溶解µl TE缓冲pH值8。使用Zymo EZ bisulfite-converted协议进行了DNA Methylation-Gold工具包®目录D5005 [43,44]。

2.6。PCR过程

获取DNA后准备下一步是进行PCR过程,与材料的形式Pyromark PCR大师混合12.5µ2.5 l, Coralload集中µl,向前引物(5′gg手枪AAT TTA GTT标签AGT TTA TTT GT-3′) 1µl,反向引物(5′CTC有条件现金援助CTC有条件现金援助ATA AAT CTT AAT条t - 3′) 1µl(生物素),问的解决方案5µl Q方案5µl, ddH2O 1µl,亚硫酸氢和DNAµl (43]。

2.7。焦磷酸测序

材料用于处理每个样品板上(1)链霉亲和素琼脂糖3μl,绑定缓冲37μ15 l, PCR产物μl, Miliq 25μl。板2焦磷酸测序包含40 ul退火缓冲区,它已被添加到测序引物的方式最终主要集中的每个孔是0.3毫米。之前进入Pyromark Q96ID,板块首先在真空处理工作站,单链DNA双链DNA转化为,主序列的顺序确定。真空工作站的板2的结果存储在PyroMark Q96ID进一步处理的CpG的焦磷酸测序过程分析甲基化百分比。

白细胞介素6基因启动子的甲基化状态确认使用焦磷酸测序方法。bisulfite-modified DNA使用正向和反向放大通过PCR引物,使PCR产品转化为单链DNA作为模板适用于焦磷酸测序。所有样本加热到95°C 5分钟然后放大45 95°C的周期45秒,54°C 45秒,72°C 45秒,紧随其后的是最后在72°C扩展了5分钟。污染和缺乏PCR产品质量检查在2%琼脂糖凝胶染色溴化乙锭。净化后PCR产品上使用琼脂糖珠PyroMark真空制备工作站(试剂盒),焦磷酸测序是根据制造商的规格与测序引物(5′ata AGA TTT AGA TTG TGG GTG条t - 3)使用PyroMark Q96MD(试剂盒)系统。甲基化平均指数(MI)计算所有观察到的CpG甲基化的平均百分比的网站(43]。

2.8。统计分析

使用SPSS软件统计分析进行了版本21.0(美国SPSS,芝加哥,IL)。此外,正态分布测试使用Kolmogorov-Smirnov测试执行Lielliefors修正。提出了DNA甲基化的定量数据值和最小最大。获得的基因表达数据进行评估使用相对量化的2^−ΔΔC_T方法(41]。同样,白细胞介素6信使rna和DNA甲基化之间的差异RAS和对照组之间使用Mann-Whitney进行评估U测试。一个值< 0.05被认为是一个重要的区别。

3所示。结果

3.1。学科特点

人口由81年的主题。37被排除在外,由于活性1型单纯疱疹病毒感染的结果。有23 RAS科目(10人,13个女性,年龄范围19-38岁,平均年龄23岁,5±4,2年),和对照组由21 non-RAS科目比例性别和年龄相匹配(6人,15位女性,年龄范围20-37岁,平均年龄22岁,7±3,8年)。没有显著差异之间的年龄RAS病人和控制 。因此,据报道,补血的是两组之间的显著差异水平维生素b - 12的水平 基于Mann-Whitney测试和过敏性疾病被发现只有在RAS组 (表1)。饮食召回是由食物频率问卷(FFQ [45),导致多数(91.3%)的受试者每天吃鸡蛋和牛奶,而其中的一些(8.69%)的习惯吃新鲜蔬菜和水果)。

3.2。逆转录酶聚合酶链反应对白细胞介素6基因

RT PCR的结果和数据作为循环阈值(C_T)和(图2)C_T的无限循环中荧光水平达到指定的数量(阈值)。这种方法(2^−ΔΔC_T(公式)41)立即使用C_T信息,最终的结果是规范化为目标基因的表达的改变(白细胞介素6)在目标样本(RAS)相比,显示参考样本(控制)参考基因(GADPH)。白细胞介素6基因的信使rna表达水平是1.88倍改变了拉组中,有大量的白细胞介素6基因的表达之间的联系和RAS的风险升高 (表2)。

3.3。甲基化状态和mRNA的表达

六CpG网站的白细胞介素6基因在RAS和对照组进行评估(图3),DNA甲基化在RAS组的概率等于对照组(表3)。白细胞介素6基因启动子区域的焦磷酸测序结果在一个RAS病人(图3 (g))。

4所示。讨论

目前的研究是第一个将DNA甲基化在白细胞介素6的表情,补血的因素,在RAS特异反应性主题。此外,据报道,女性受试者经历更多的RAS,虽然基于性别,但两组之间没有统计学意义 。之前的研究表明,女性比男性(经验更频繁地拉2,46]。女性倾向于寻求医疗照顾他们的疾病或不适状况和压力高于男性46]。在RAS组平均年龄没有明显不同于对照组 。研究对象的年龄范围是选定的流行病学信息显示最常见的RAS在20岁(47]。富有成效的年龄往往身体和情绪上的压力,虽然是增加血清皮质醇水平密切相关(48]。

一个统计上的显著差异观察血清维生素b12水平。此外,报告的血清水平约78%的RAS科目与水平高于正常(hypercobalamin)和对照组经历高水平约95% (hypercobalamin)。这表明维生素B12缺乏功能和定性,受损的吸收有关的组织和其效果。此外,补充或含维生素b - 12的食物,如肝脏、红肉、鸡蛋、贝类、或奶制品,可能导致hypercobalamine [49]。然而,据报道在RAS受试者根据食物频率问卷,鸡蛋和牛奶几乎每天消耗时,它可以影响hypercobalamin条件的出现,但需要进一步调查确定的确切原因和意识到更严重的疾病。

铁蛋白水平两组之间没有差别。这是一致的研究结果由包等,他们也没有显示出显著差异的减少铁蛋白和叶酸水平在RAS和对照组(50]。此外,叶酸水平正常的两组,差异不显著。这些结果都是一样的在先前的研究中,据报道少数患者缺乏叶酸与胃肠道功能紊乱如胃炎、消化性溃疡,阑尾切除术,药物,HbE特征,没有系统性疾病,或压力(51]。

的IgE水平两组没有显著差异,可能是因为RAS科目没有复发过敏性疾病的发作在研究过程中,或在特异反应性疗法,以这样一种方式,它影响了血清IgE水平下降。有更多的历史比其他过敏性疾病过敏性皮肤炎。IgE考试成绩不高。只有6个RAS主题显示IgE > 200国际单位/毫升。因此,数量可分为异位性只是十RAS组,和其他学科需要进一步调查。此外,RAS的IgE水平增加患者根据一些相关的先前的研究报道RAS科目的过敏史。另一个因素是肥大细胞的数量增加周围组织病变(51,52]。相关性分析的结果与白细胞介素6 IgE RAS集团统计上显著的结果 类似于之前的研究,表明白细胞介素6水平增加支气管哮喘组白细胞介素6因为可以增加肥大细胞增殖(52,53]。

许多炎症介质,包括il - 1, - 2, IL-17,和地震调查在RAS (17,54,55]。本研究主要探讨白细胞介素6的促炎介质起着关键作用在RAS和补血的缺乏和特异反应性。血清水平取决于白细胞介素6基因的表达,及其基因表达受表观遗传因素的影响。的表观遗传因素之一,可能与补血的缺乏和DNA甲基化特异反应性。胞核嘧啶甲基化的CpG二核苷酸是一种重要的监管机构在人类基因组中基因的表达。

分析DNA甲基化在RAS学科的研究,特别是连接与促炎基因的表达,并没有被执行。然而,陆等人进行的一项研究显示的作用的表观遗传机制之一的upregulation LncRNA(长非编码RNA)癌症易感性基因2 (CASC2)、白细胞介素6、地震- RAS (56]。这项研究显示,在四个CpG甲基化网站发起人白细胞介素6的比例较低的拉比在对照组。其他两个CpG网站显示百分比高于控制,但没有统计学意义。DNA甲基化是一个甲基,共价添加(ch3)基地C(胞嘧啶)5′-CpG-3′二核苷酸。CpG一词是由一个磷酸基C连接结合基地鸟嘌呤(G)的DNA序列(57]。添加甲基是由DNA甲基转移酶酶基因在监管元素,如启动子,可以进一步抑制基因功能(沉默)或触发基因表达(提高)58]。

随后,据报道,在白细胞介素6基因启动子DNA甲基化被认为增加白细胞介素6的表达。缺乏维生素b - 12和铁蛋白的影响揭示营养DNA甲基化的作用。先前的研究表明,一些食物组件能改变DNA甲基化的状态,如维生素B作为代谢的辅酶”一个碳,”methyl-contributing营养物质,微量元素,可以修改一个碳代谢,和食品生物活性的化合物,可以修改DNA甲基转移酶的活性(59]。“一个碳代谢生化反应的是一个相互联系的网络;“一个碳”单位获得methyl-contributing营养然后生化和分子转移到DNA合成(60]。维生素b - 12缺乏会导致半胱氨酸以及“methylfolate陷阱。“这可以限制可用性的同型半胱氨酸甲基remethylation和DNA甲基化59]。维生素b - 12缺乏相关有统计学意义hypomethylation根据Piyathilake等所做的研究。61年]。可以影响DNA甲基化不足的维生素b - 12和铁蛋白或特应性条件。然而,hypomethylation或甲基化没有统计证明。一些基因表达可以抑制或增强因为hypomethylation或条件的5′UTR区域甲基化DNA模板。这项研究显示,白细胞介素6的表达明显高于与补血的缺乏和atopy-related RAS主题,但其高表达与DNA甲基化。这可能发生,因为其他的一些独特的小分子核糖核酸等表观遗传因素(microrna)概要文件。进一步研究其他白细胞介素6基因表达的表观遗传机制在铁、叶酸,维生素b - 12缺乏,atopy-related RAS。

目前的研究表明,白细胞介素6 mRNA的upregulation与RAS,补血的缺乏,特异反应性。upregulation表明白细胞介素6基因沉默可能是未来的新型治疗RAS,尤其是在补血的缺乏和特异反应性患者。白细胞介素6 DNA甲基化的CpG岛启动子在目前的研究是在566 - 658年的网站基于所使用的引物。因此,它需要进行进一步检查在网站1 - 565或659 - 1684年在中央人民政府启动子白细胞介素6的位置在RAS证实DNA甲基化的状态。同时,另外一个策略是需要降低白细胞介素6表达通过抑制转录与另一个非编码RNA或组蛋白修饰等表观遗传模式。

随后,它是进一步发现,白细胞介素6可能是一个新颖的RAS治疗的目标,特别是补血的缺陷和特异反应性有关。需要叫直接anti-IL6代理或抑制白细胞介素6基因表达通过纳米设备,如人性化IgG1重组单克隆抗体_k子类使用DNA重组技术生产。此外,环境因素会影响DNA甲基化变化和白细胞介素6 upregulation应该减少预防作为主要RAS。

5。结论

目前的研究表明,白细胞介素6表达RAS主要受维生素b - 12缺乏的影响。相信维生素b - 12缺乏的影响在白细胞介素6表达DNA甲基化密切相关。然而,白细胞介素6的upregulation mRNA水平明显高于在RAS的病人。此外,建议白细胞介素6是一个重要的促炎在RAS,这也可能是受其他表观遗传机制的影响。我们意识到这项研究有一些局限性在招聘。因此,这些连接DNA甲基化的未来研究提出CpG岛启动子白细胞介素6与白细胞介素6网站1 - 565和非编码RNA表达在RAS共病与特异反应性是绝对必要的。

数据可用性

所有的数据用于支持本研究的发现是包括在手稿中。

的利益冲突

这个手稿的作者宣称他们没有利益冲突。

确认

作者要感谢基金提供的学术领导授予的意大利Padjadjaran,格兰特没有。2476 / UN6.C / LT / 2018。他们也感谢医学遗传研究中心意大利Padjadjaran医学院和分子遗传学实验室意大利Padjadjaran。