文摘

目的。高的免疫机制顶骨质流失,迄今为止,尚未阐明。我们假设从细胞因子的微间隙导致upregulation细菌产品健康高细胞,导致破骨细胞的形成,最终,在骨吸收。材料和方法。我们用rt - pcr和ELISA试验介质osteoclastogenesis在老鼠和人类巨噬细胞(r和hMO);骨髓基质细胞衍生(r和hBMCs);和人牙龈成纤维细胞(hGF)——由有限合伙人或无刺激。陷阱积极多核的细胞吸收能力进行了评估。结果。我们表明,il - 1α,il - 1β,il - 6表达的所有细胞类型检查,和TNF -α在胶质瘤调节。分泌的il - 1α和il - 1β蛋白质在hMO刺激有限合伙人,il - 6蛋白分泌是高度刺激hBMCs和hGF。有限合伙人和RANKL刺激巨噬细胞形成osteoclast-like陷阱阳性细胞,再吸收钙磷酸盐基质。结论。综上所述,我们的研究结果支持假设木糖醇移植提高介质的osteoclastogenesis居民健康细胞中发现的高隔间,由这些细胞分泌细胞因子的本地协同作用导致吸回的活跃的破骨细胞的起源。

1。介绍

牙科植入物促进患者的康复,明显改善功能和美学。然而,脊部骨质流失的1.5 mm - 1.6 mm周围观察到的放射学一些牙科植入物内加载的第一年(1,2]。桥台endosseous组件的连接在两级系统中会不可避免地导致微间隙(10 - 50μ米),与更大的残余腔之间创建止动螺钉和内部植入墙。先前的证据表明,革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌在口腔中发现可以在植入物的内部表面和微间隙区域(3- - - - - -5];高的软组织,引起炎症反应。此外,在一个迷人的研究Zipprich et al。6]表明植入的周期性加载/桥台接口中包含可能导致液体的泵腔植入高隔间。

炎症细胞浸润的存在水平implant-abutment junction-even植入物周围放置在细致的菌斑控制和临床领域健康、柔软组织被描述在一系列的动物实验(7- - - - - -10]。然而,其他临床前研究报道显著减少炎性细胞浸润和骨质流失在整体植入两件套(比传统植入物)和桥台的设计/植入界面改变了(9,11]。因此,有人建议,两件套的微间隙植入物起着关键作用的一代的炎症细胞浸润,和顶骨质流失,12)通过影响软硬高组织(13]。

Broggini等人证明了狗,主要的细胞类型构成微间隙的淹没和周围的炎性浸润nonsubmerged两件套植入是中性粒细胞(9]。在他们的实验中,而没有选择中性粒细胞单核细胞的积累和显著减少相邻的植入物,单核细胞的人口显著增加两件套植入物周围。另一项研究中,在猴子、炎症细胞浸润淋巴细胞和浆细胞在植入两件套(主要含有14]。

的病理生理后果implant-abutment接口位置有重要的临床意义,因为审美要求鼓励中植入的位置更顶端位置(15]。这样的位置可以促进炎症和骨质流失,牙龈萎缩,审美失败。相对于原来的牙槽嵴的位置,植入物放置在顶部或subcrestal水平已经证明骨质流失大于植入放置切(13,14,16]。此外,实验subcrestal植入界面显示的密度大大提高中性粒细胞比切接口(10),但微间隙的大小不是一个因素在脊部骨吸收12,17]。前瞻性临床试验也发现了一个类似的接口的位置关系和骨质流失的大小18),批准上述发现的。在本临床研究中,当植入界面定位接近于原始牙槽嵴,相比更大的骨质疏松发生植入接口放置更切。因此,界面的位置是一个重要的行列式在人类中牙槽骨丢失,在最初被描述的观察(19和以前的动物研究20.,21]。

广为人知,骨基质是由破骨细胞再吸收,这是多核巨细胞,起源于造血祖细胞单核/巨噬细胞系(22]。据报道,脂多糖(LPS)诱导骨吸收(23,24和破骨细胞的形成25]。有限合伙人的生存支持preosteoclasts通过NF -(单核破骨细胞)κB激活独立于宿主因素如铂族元素₂RANKL, il - 1、TNF -α(26]。可以调节破骨细胞形成il - 1β和肿瘤坏死因子-α同时加强RANKL的表达(27]。有限合伙人来自不同来源被用来指定一个与牙科植入物相关的效应机制。因此,虽然Tesmer等人表明,某些牙科植体设计为多个集落形成单位的发展答:actinomycetemcomitans和p . gingivalis(28),Koutouzis et al。29日)使用大肠杆菌细菌培养解决方案证明植入设计影响口腔微生物的侵入fixture-abutment接口在动态加载条件下微间隙。

因此,它已经表明,炎症细胞,微生物细胞和/或液体(8- - - - - -10,14,30.)与implant-abutment接口相关联。(10,12,14,16]然而,假定的微间隙的存在之间的相关性和顶骨质流失仍然耐火材料机械的解释。因此,本研究的目的是探讨牙科植入物周围的脊部骨质流失的可能机制使用细菌内毒素模型在体外。

我们假设细菌产品源自upregulation微间隙引起的细胞因子,在健康高巨噬细胞、间充质基质细胞和牙龈成纤维细胞,导致招聘再吸收的活跃的破骨细胞,最终,骨吸收。认为健康的牙周膜成纤维细胞可能扮演重要的角色在提供可持续的过渡从牙龈炎、牙周炎的炎症介质最近也讨论(31日),尽管这些细胞不会预期高隔间。因此,为了解决我们的问题,我们开始的前提下高组织周围的微间隙是正常和健康的治疗桥台连接。我们进一步认为,细菌产品将supra-bony软组织对细胞的作用,因此我们研究了有限合伙人的影响在巨噬细胞、细胞因子表达和分泌基质细胞和牙龈成纤维细胞。符合我们的有限合伙人模型,我们首先进行了一些比较研究来评估实验室产生的影响,Porphyromonas gingivalis(P。gingivalis),普氏菌媒介物(P。媒介物),商用,大肠杆菌(E。杆菌对人牙龈成纤维细胞),有限合伙人,因为最近提出的问题“自制”的使用有限合伙人准备(32]。

2。材料和方法

2.1。制备人牙龈成纤维细胞(hgf)从牙龈组织

牙龈组织的样本,获得知情同意,从5患者没有临床牙周疾病的迹象。组织收集来自不同网站:(1)口感,使用免费结缔组织牙龈移植;(2)边际齿龈,萃取后的第三磨牙;(3)牙科植入物周围的齿龈在第二阶段手术。收集到的组织洗3次了αmem补充了青霉素G(167单位/毫升),庆大霉素(50μg / mL), 10%的边后卫,被切成小块和消化3毫克/毫升1型胶原酶的混合物(Sigma-Aldrich)和4毫克/毫升胰蛋白酶在SM 1小时37度。消化组织在1150转离心5分钟,和上层的丢弃。然后,10毫升的SM是添加到包含球管,和细胞悬液被转移到一个t - 75培养瓶。当细胞融合达到80 - 90%,他们通过新的t - 75的玻璃瓶和镀在浓度为1.0×10⁶细胞/厘米²在6-well板通道3。这个过程被重复5次。

2.2。人类巨噬细胞(hMO)

两个健康的志愿者,一个35岁的女性,50岁的男性,捐献的血液实验,提供知情同意。静脉血(30毫升)收集从一个肱静脉变成肝素化管并立即处理。外周血单核细胞(PBMC)中使用梯度离心法分离Histopaque解决方案(Sigma-Aldrich)。孤立PBMCs孵化的RPMI(罗斯威尔公园纪念研究所)介质- 1640 (Gibco)与10%的边后卫在6孔板的密度大约细胞/厘米²在最后一卷2毫升。细胞被允许坚持塑料碗90分钟在37度,5%的股份有限公司₂在RPMI媒介。PBS的细胞被大力清洗三次,和不依从细胞(主要是淋巴细胞)被移除。细胞生存能力是91%在细胞与人类anti-CD14播种和免疫荧光的特征分析,人类的MHC II, FITC-conjugated老鼠免疫球蛋白(所有从BD科学)。

2.2.1。人类骨髓细胞(hBMCs)

hBMCs得到,当地研究伦理委员会(REB)批准后,从集合中包过滤器(美国巴克斯特,迪尔菲尔德中学,IL)通常被丢弃后收获的骨髓,从健康的捐赠者,移植。PBS的细胞被洗,然后镀在75厘米²在10毫升的SM烧瓶。文化在37度5%孵化有限公司₂。24小时后,non-adherent细胞被移除。confluency当细胞达到70 - 80%,他们使胰蛋白酶化(0.25%胰蛋白酶在PBS 37度5分钟),收获,扩大新75厘米²烧瓶。细胞被扩大到达到80 - 85% confluency通道1到4。在这个阶段,没有可检测造血细胞谱系。hBMCs悬浮在SM,播种的浓度细胞/厘米²在通道4 6-well板块。我们收集了六个不同的捐赠者送气的过滤器,重复六次hBMCs文化过程。

2.3。小鼠巨噬细胞(原始264.7)(mMO)

老鼠巨噬细胞细胞系,生264.7(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),最初是悬浮在新鲜补充介质(SM)组成的10%胎牛血清(的边后卫)(美国UT Hyclone,洛根),80% DMEM(写明ATCC)和10%的抗生素(青霉素G 167单位/毫升、50μ0.3 g / mL庆大霉素),μ克/毫升二性霉素b(所有Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。随后,这些细胞被镀在75厘米²(t - 75)聚苯乙烯组织培养瓶(BD,富兰克林湖,新泽西,美国),和孵化公司37度为5%₂。媒介是每2或3天更换一次。confluency细胞增长80%,倒相显微镜观察到,之后,他们用PBS(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)和从培养瓶中删除后的2.5毫升0.25%胰蛋白酶(Gibco) PBS在37度5分钟。灭活胰蛋白酶,5毫升SM添加,然后细胞悬液离心5分钟每分钟1150转。活细胞总数是来自ViCell-XR自动细胞计数(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)。这个细胞培养协议之后细胞扩张从0到通道2。264.7通道3,原始细胞被镀的浓度细胞/在6-well盘子。这些细胞培养过程是重复6次。

2.4。大鼠骨髓基质细胞(rSBMCs)

rSBMCs是收获的腿节100 - 120 g Wistar鼠。收获腿节被浸泡和冲洗10分钟三次αmem培养基(Gibco)补充10%的抗生素(如上所述)。松果体被切断和骨髓都是两边轻轻取出10毫升注射器(配备20量度针)充满充分补充介质(FSM: 10%的边后卫,80%αmem和10%的抗生素)。骨髓的体积暂停调整到30毫升FSM和分为两个整除15毫升,分布在两个t - 75的玻璃瓶。第一个媒介变化是在24小时内完成,然后每周随后的三倍。细胞增长5到6天融合到80 - 85%。在每个通道,通道8,细胞被收集并与福尔马林固定1.5毫升微型离心机管流式细胞仪(美国贝克曼库尔特、迈阿密、FL)分析CD45阳性细胞群(CD45、鼠标anti-rat Caltag实验室、伯林盖姆,CA,美国),调查的造血细胞的存在。整除的细胞/厘米²通过7被播种到6-well rSBMCs的盘子。通过7被选在这个试验因为通道7只包括CD45的0.36%⁺细胞。骨髓基质细胞分离得到两种老鼠CD45的量化⁺细胞。

2.5。有限合伙人的准备工作

hgf与不同类型的刺激有限合伙人:P。gingivalis,P。媒介物,E。杆菌LPS(大肠杆菌055:B5, Sigma-Aldrich)。有限合伙人的P。牙龈和P。媒介物从殖民地的细菌培养分离。在这项研究中使用的菌株P。媒介物写明ATCC 25611,P。gingivalis写明ATCC 33277。厌氧菌都维护在香港布鲁氏琼脂(Kyokuto、东京、日本)补充5%湖羊血的氛围中80% N₂,10%的公司₂,10%的H₂O在48小时的有氧运动室37度。有限合伙人被使用一个有限合伙人提取提取工具包(生物技术基因内区、Kyunggi-do、韩国),溶解在10毫米Tris-HCl缓冲区,和冻干。

2.6。LPS刺激的细胞

在不同的实验中,hBMCs hgf和刺激E。杆菌有限合伙人(0μ0.1 g / mL或μ克/毫升或1μg / mL) 24、48和96小时,他们刺激p . gingivalis有限合伙人或p .媒介物有限合伙人(1μ2 g / mL)或24小时(37度,5%的有限公司₂)。

264.7原始细胞被刺激大肠杆菌有限合伙人(大肠杆菌055:B5, Sigma-Aldrich) (0μ克/毫升或1μg / mL) 12、24、36、48岁和60个小时;组织与LPS刺激(0μ克/毫升或1μg / mL) 24小时;rSBMCs刺激了大肠杆菌有限合伙人(0μ0.1 g / mL或μ克/毫升或1μg / mL) 6、24、48和96小时;hBMCs hgf和刺激大肠杆菌有限合伙人(0μ0.1 g / mL或μ克/毫升或1μg / mL) 24、48和96小时。在每种情况下,有限合伙人加入培养基,细胞融合达到75 - 80%,大约是在第三天rSBMCs mMO和第七天,hgf和hBMCs。有限合伙人加入培养基每24小时。细胞培养上清液hBMCs和hgf收获和储存在−80度前酶联免疫吸附试验(ELISA),热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。RNA是隔绝LPS刺激细胞和细胞溶解产物后培养基被(见下文)。

2.7。检测细胞因子表达式(rt - pcr)

从hBMCs提取细胞总RNA, hgf, hMO, mMO和rSBMCs。1毫升/ 10厘米²培养皿面积三试剂(美国Ambion、奥斯汀、TX)。互补脱氧核糖核酸模板使用逆转录酶的这些细胞生产工具包(Quanti Tect逆转录装备,试剂盒,米西索加,,美国)。辅助基因,GAPDH是用于所有种类的人类,老鼠,和鼠标。特定引物的il - 1α,il - 1β肿瘤坏死因子-α,il - 6、等级、RANKL、TRL-2 TRL-4, CD14和MD-2用于人类或老鼠,和鼠标单独使用电子基因数据库(爆炸,国家医学图书馆)。特定的引物(表1)被添加到每个cDNA示例使用Taq工具包被放大(白金Taq DNA聚合酶、表达载体、Carisbad, CA,美国)。表达cDNA评估通过运行25至35周期在55度到65度反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr)扩增。放大产品1.5%琼脂糖凝胶电泳分析和可视化与溴化乙锭染色(Sigma-Aldrich)。rt - pcr是为每个单元格类型至少重复3次。

2.8。细胞因子的分泌(ELISA)测定

文化从每个细胞类型被移除上层清液和储存在−ELISA分析之前80度。ELISA试剂盒被用来量化il - 1α,il - 1β肿瘤坏死因子-α,文化上层清液中il - 6浓度无细胞根据制造商的协议。hBMCs和提取hgf裂解缓冲(细胞信号技术,贝弗利,女士,美国)和蛋白质溶解产物是存储在相同的方式。ELISA试剂盒被用来量化il - 1α,il - 1β和肿瘤坏死因子-α在细胞溶解产物浓度根据制造商的协议。吸光度与波长450 nm读修正设定在550海里。商业ELISA试剂盒的敏感性是il - 1 < 2 pg / mLα对il - 1, < 1 pg / mLβ< 2 pg / mL, TNF -α对il - 6, < 1 pg / mL。游离文化上层清液样本,样本数量的细胞溶解产物样本,每个样本重复分析的时间如表所示2。il - 1的浓度α,il - 1β、il - 6和TNF -α分析了在文化上层清液和细胞溶解产物游离hBMCs和hgf。在组织中,我们分析了只有il - 1的浓度α和il - 1β。

2.9。陷阱(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色

mMO(原始264.7)和PBS洗和10%福尔马林固定在室温下5分钟。然后,他们用蒸馏水洗净,在米歇利斯佛罗拿醋酸缓冲(pH值5.0)含有萘酚是双磷酸盐作为衬底,pararosanilin-HCL耦合器,和酒石酸陷阱检测活动,在37度了40分钟。移除陷阱孵化缓冲区后,细胞用蒸馏水洗净。他们在显微图分析和计算用数码相机连接到光学显微镜。

2.10。陷阱分析

mMO细胞96孔板是用PBS和增加100μL /分析的解决方案:1毫升的0.1米pNPP(二钠p-Nitrophenylphophate六水合物),1毫升×10缓冲酒石酸钠乙酸钠(1米和0.1米),1毫升0.1% Triton-X,填满10毫升蒸馏水。孵化的板在室温下10分钟并添加50μL / 0.2氢氧化钠作为停止解决方案。然后,在405纳米测量吸光度。

2.11。骨吸收试验

执行监测骨吸收测定使用商用OSTEOLOGIC文化系统(BioCoat OSTEOLOGIC骨细胞培养系统,双相障碍),底物的涂上一层薄薄的破骨细胞resorbable磷酸钙陶瓷(33]。264.7原始细胞(OSTEOLOGIC板上培养的细胞/)1天。然后,有限合伙人(1μg / mL)或RANKL(受体激活核因子κB配体)(200 ng / mL)添加到细胞培养基,细胞被刺激和有限合伙人或RANKL 7天。Un-stimulated细胞被用作控制。7天后,细胞培养基是移除和细胞用10%福尔马林固定。显微图OSTEOLOGIC盘子都用SEM(扫描电镜)。这个细胞培养过程重复了三次。

3所示。结果

3.1。各有限合伙人对促炎和Osteoclastogenic基因表达的影响

我们调查的影响,不同类型的有限合伙人促炎症和osteoclastogenic暴露后细胞因子基因表达有限合伙人在胶质瘤2小时。

所有三种类型的有限合伙人(来自大肠杆菌,p . gingivalis,p .媒介物显示类似upregulation il - 1β、il - 6和RANKL基因表达数据1 (b),1 (c),1 (e))。肿瘤坏死因子-α和RANKL表达检测non-LPS和有限合伙人的条件(数据1 (d)和1 (f))。

3.2。不同的有限合伙人对LPS受体的影响及其相关基因的表达

我们下一个检查的影响有限合伙人TRL 2和实验室4 LPS受体及其信号级联因素(图2(一个))。没有有限合伙人,没有实验室2或实验室观察4基因表达。这也是CD-14基因表达的情况,尽管MD-2表示有或没有LPS刺激(图2 (b))。

这些分析表明所有三个有限合伙人提取物表现出类似的效果。因此,为了方便起见,我们选择大肠杆菌有限合伙人为后续实验是商用。

检查各有限合伙人使用hGF对基因表达的影响进行了分析。然而,我们的实验目的是研究细胞影响osteoclastogenesis在周围组织细胞。因此,我们还研究了巨噬细胞和骨髓细胞的影响,可将牙科植体周围存在固定装置,从人类、老鼠和老鼠。

3.3。人类巨噬细胞

hMO表达il - 1β和肿瘤坏死因子-α基因的存在与否的有限合伙人在35周期的rt - pcr(图24小时3)。两人il - 1α和人类巨噬细胞il - 6表达增加了LPS刺激30 rt - pcr(图的周期3)。

3.4。小鼠巨噬细胞

mMO文化表明,il - 1的表达α,il - 1β,il - 6基因调节与LPS刺激30 rt - pcr(图的周期4)。然而,基因表达的肿瘤坏死因子-α观察不管LPS刺激的时间点,除了60小时(图4)。因此,在我们的实验中,TNF -α表达式是由有限合伙人不调节。的il - 1α在48小时内和il - 6基因表达减少,而il - 1β基因表达降低LPS刺激后60小时(图4)。

3.5。人类骨髓细胞

hBMCs表现出类似的趋势与rSBMCs基因表达细胞因子的发现(图5)。il - 1的基因表达α,il - 1β有限合伙人,il - 6是刺激的。然而,il - 1的表达α和il - 1β基因在96小时减少hBMCs文化。肿瘤坏死因子-α基因表达也发生在有限合伙人的存在(图24小时和48小时5)。然而,TNF -α表达很弱在每个LPS浓度和时间点。LPS-stimulated il - 1的基因α和il - 1β观察30周期,通过rt - pcr和il - 6基因在25个循环。

3.6。大鼠骨髓基质细胞

有限合伙人调节基因表达的il - 1α,il - 1β,il - 6在rSBMCs poststimulation期(6 - 96小时,图6),mMO的文化表现出同样的趋势。TNF的表达α基因的存在有限合伙人在6和48小时30周期很弱(图6)。运行周期为rt - pcr hBMCs一样。

虽然我们hGF用于估算的影响不同的有限合伙人在这项研究中,那些实验进行了2小时有限合伙人。我们也调查了LPS对hGF与较长时间段的影响,24、48、96小时,在随后的实验。

3.7。人牙龈成纤维细胞

il - 1的所有基因,α,il - 1β肿瘤坏死因子-α和il - 6表达的有限合伙人在所有时间点hGF的文化。然而,il - 1的表达β尽管并不表示在96小时(+ 5)增加周期;il - 1的表达α,il - 1β和肿瘤坏死因子-α被观察到35周期。有趣的是,基因表达都是更强的为0.1μg / mL比1 g / mL有限合伙人(图7)。LPS-stimulated il - 1α和il - 1β基因表达是减少时间的方式,然而,il - 6基因表达增加尤其是1μ克/毫升的浓度有限合伙人(图7)。il - 6基因的表达被观察到25周期。

4所示。有限合伙人对蛋白质分泌的影响

ELISA用于评估蛋白质分泌(il - 1的水平α,il - 1β肿瘤坏死因子-α和il - 6)在hmo的文化,hBMCs和hgf。

4.1。人类巨噬细胞

重要的分泌il - 1α和il - 1β被发现在文化浮在表面的游离与LPS刺激后24小时(表吗3(a))。il - 1α和il - 1β浓度约470倍和12.5倍的有限合伙人。

4.2。人类骨髓细胞

细胞溶解产物的分析ELISA透露,LPS-stimulated hBMCs分泌il - 1α在24小时内和il - 1β24、48和96小时(表3(b)),但这些蛋白质含量是非常低的。分泌物TNF -α从蛋白质溶解产物检测有无有限合伙人在所有时间点(表3(b))。然而,肿瘤坏死因子的水平α分泌也很低。因此,il - 1的分泌α,il - 1β和肿瘤坏死因子-α在hBMCs文化中是没有意义的。

相反,il - 6分泌的水平非常高的有限合伙人在hBMCs(图8(一个))。il - 6浓度大约是40000倍在96小时的有限合伙人最大而缺乏有限合伙人。il - 6的分泌胞外文化上层清液被发现在所有时间点只有有限合伙人(图8(一个))。因此,il - 6的分泌蛋白质引起LPS刺激时间的方式,但不是一种有限合伙人剂量依赖性的方式。

4.3。人牙龈成纤维细胞

分泌TNF -α并不是特定于LPS刺激的存在在24日48和96小时(表吗3(c))。的分泌TNF -α不是hgf LPS刺激引起的。

il - 6蛋白的水平明显增加,有限合伙人在胶质瘤(图8 (b))。发现了il - 6的分泌胞外文化上层清液在所有时间点:24、48和96小时。分泌il - 6的hgf在LPS刺激的存在被发现时间和剂量依赖性hgf(图8 (b))。

5。有限合伙人对小鼠巨噬细胞的分化为破骨细胞

5.1。观察破骨细胞的分化

5.1.1。陷阱分析

mMO(264.7原始细胞)与300 ng / mL GST-RANKL在培养基培养3天了最高的陷阱积极的反应相比,消极的控制,没有RANKL, LPS刺激mMO(图9)。各有限合伙人没有显示不同的陷阱积极的能力。各有限合伙人没有显示不同的陷阱大多是积极的能力。

5.1.2中。陷阱染色

mMO中包含1中培养μg / mL有限合伙人为5到7天,观察相衬下的多核细胞(跨国公司)(图10(b))。跨国公司扩大规模,但跨国公司的数量是在第七天下降。mMO没有显示形态缺乏有限合伙人(图的变化10(a))。

破骨细胞形成被陷阱染色检查,这是一个可选的染色确定激活破骨细胞和巨噬细胞。TRAP-positive单核细胞和跨国公司在mMO文化有限合伙人(图的存在10(e)和RANKL的存在(图10(h))。mMO文化没有的有限合伙人和RANKL被用作负控制和没有显示阳性反应染色(图10(c))。mMO文化刺激和RANKL作为积极的控制(图10(h))。

5.2。观察破骨细胞的激活

坑形成活动进行了分析使用商用BioCoat Osteologic骨细胞培养系统(Osteologic),由石英板薄膜表面涂层的磷酸钙(帽)。坑形成帽基质是老鼠巨噬细胞中观察到文化的有限合伙人(图10(f)和RANKL(图)10(g))。控制文化没有任何坑的形成(图10(d))。

6。讨论

尽管牙龈和牙周疾病导致upregulation和促炎细胞因子的分泌,(34- - - - - -36)我们的研究旨在阐明机制牙科植入物,放在健康组织,可能导致破骨细胞的起源,效应器的高顶骨质流失。因为后者是一个地方,而不是系统性的现象,需要了解当地的诱发机制。因此,我们假设细菌产品,来自细菌殖民植入/桥台连接,可能导致upregulation促炎细胞因子的细胞的健康的高组织,进而刺激招聘再吸收的活跃的破骨细胞。事实上,我们的结果表明,大肠杆菌细菌内毒素LPS,作为一个模型,可以选择性地刺激促炎细胞因子的upregulation候选人居民健康细胞,这可能会导致再吸收的活跃的破骨细胞的起源。

尽管植入/桥台设计差异,植入/桥台连接总是形成一个微间隙,在函数(循环打开/关闭),将允许通过有机液体含有细菌和内毒素和植入腔(7]。此外,两件的内部蛀牙的细菌殖民化牙科植入物一再通过显微镜观察和证明在体外研究[3- - - - - -5]。事实上,很可能这些蛀牙提供厌氧室可能诱发免疫反应的病原体在宿主(9]。这种反应的强度取决于:每个个体的免疫状况(如牙周疾病的情况是(37]);的数量和类型牙周病原体存在于口腔;可能的位置(相对于骨嵴)植入/桥台接口(11,13]。的确,细胞因子之间似乎有一种微妙的平衡,引发免疫反应(促炎)和那些将调节免疫反应38]。有趣的是,临床研究植入/桥台自锁连接(39,40),更稳定,减少流体渗流(对不稳定flat-to-flat nonself-locking组件)(7),显示骨脊的总体损失的减少。

我们的研究结果表明,有限合伙人调节il - 1α和il - 6基因表达检测细胞类型;而伊尔-β和肿瘤坏死因子-α只有调节hBMCs文化,和hgf。相反,分析蛋白质的分泌il - 1水平非常低或者检测不出来α,il - 1β和肿瘤坏死因子-α在英国文化,hBMCs和hgf。然而,il - 6分泌明显增加,与治疗有限合伙人,hBMCs和hgf,发现对应于先前的报道(41,42]。事实上,il - 6已被证明通过增强刺激破骨细胞活动的RANKL的表达与可溶性白介素受体(sIL-6R)在颅顶的骨头43和成骨细胞44),协同效应的效果依赖于il - 6和sIL-6R45]。此外,il - 6可以刺激osteoclast-like形成长期的人类骨髓培养诱导il - 1β释放(46]。因此,il - 6可能是负责通过增强破骨细胞的分化和激活RANKL的表达(43- - - - - -45]。

il - 6也被牵连在牙周炎的发病机制有一个角色。牙龈组织获得病变牙周网站含有较高水平的il - 6与健康的网站(47)和crevicular流体从牙周疾病的网站比健康的网站含有更多的il - 6 (48]。而伊尔-β、il - 10、il - 12、引发、il - 6和TNF -α都被发现在高crevicular液体,记录水平往往高于观察周围的牙齿,(41)il - 1和il - 6表达刺激α和肿瘤坏死因子-α在胶质瘤(42]。成骨细胞也被证明产生il - 6在回应当地微代理(49]。因此,il - 6可能在合作与其他细胞因子发挥作用在骨(36破坏和组织损伤。事实上,增加炎症细胞因子与骨质流失和进步的失败有关牙科植入物(50,51]。由于细胞因子是小分子的短寿命和短作用距离是可以产生反应很小的浓度和旁分泌的方式,52)这也许可以解释为什么最近引入平台切换在植入物的设计53,54)包含了促炎细胞因子生产桥台和平台之间的区域;从而屏蔽周围骨的有害影响。

相比的具体表达式和丰富的分泌il - 6 hBMCs和hgf,值得注意的是少量的il - 1α,il - 1β和肿瘤坏死因子-α也生产和分泌。的il - 1α和il - 1β已被证明加强RANKL表达成骨细胞和基质细胞(44,45),而il - 1α促进破骨细胞的生存通过NF-kB激活导致诱导破骨细胞激活(44]。这些发现表明,il - 1α诱发多核破骨细胞的分化和激活(55]。肿瘤坏死因子-α刺激破骨细胞的分化和生存,但不是破骨细胞的功能(56]。因此,可以刺激破骨细胞的分化和激活有限合伙人通过il - 1α,il - 1β和肿瘤坏死因子-α。我们的结果表明,LPS激活巨噬细胞可以形成再吸收的活跃osteoclast-like陷阱阳性细胞和表明,有限合伙人可能对常驻巨噬细胞直接行动除了已知的行动能力间接preosteoclasts (23]。

7所示。结论

综上所述,我们的研究结果支持假设木糖醇可能上调炎性基因的细胞中发现的健康居民高隔间里,当地的协同行动,这些细胞的细胞因子分泌导致吸回的活跃的破骨细胞的起源。

确认

作者承认从加拿大卫生研究院研究的资助(CIHR)中小企业/ IP PDF奖学金(YU),安大略研究和发展挑战基金(ORDCF),和一个无限制的补助金从Biomet 3 i (JED)。