文摘

龋齿发展的存在变形链球菌不仅与生产相关联的细胞外的水不溶性聚合物,还基于水溶性多糖。本研究的目的是评价小说glucan-specific凝集素水溶性EPS产生的监测分析变异链球菌几个发展时期在不同的媒体。变异链球菌文化出了24小时,48 h,和144 h中蔗糖(A)和中补充不足5%的蔗糖(B),微量滴定板被涂上一层浮在表面的游离其次是添加标记Concanavalin-A和酶底物。底物反应是活动检测到405海里。执行的验证试验使用碳水化合物右旋糖酐、黄原胶、蔗糖作为参考。这个新的Concanavalin-A-based化验显示最高的灵敏度为右旋糖酐和显示的葡聚糖生产变异链球菌达到最大值144 h中B根据细菌的成熟。

1。介绍

龋齿的病因常与越来越多的各种引起酸化的微生物变形链球菌扮演一个keyrole在生龋齿的生物膜的形成1]。生物膜的结构和功能特性,就像人类的牙菌斑,本质上是由微生物的存在水化聚合物主要由自产的胞外多糖(系统)的蛋白质,核酸,磷脂,粘膜细胞和营养成分1,2]。特别是,产生的支付系统变异链球菌导致口腔生物膜的生龋齿的潜力及其抗口腔卫生措施(3]。的支付系统变异链球菌在糖暴露主要由葡萄糖聚合物(葡聚糖)含有不同比例和分支的α- 1.3(水不溶性)和α- 1.6(水溶性)glucosidic联系(4]。的蔗糖和葡萄糖代谢变异链球菌包括通用的交互和监管不同的细胞外葡糖基转移酶:GtfB(水不溶性葡聚糖,研究小组;低分子量水溶性葡聚糖、SG) GtfC(研究小组和SG), GtfD (SG)和FtfF(果糖水溶性聚合物)5]。解决龋齿的微生物相互关系的研究大多是集中在水不溶性的相关性系统产生的变形链球菌和他们的基因调控6]。可溶性碳水化合物聚合物及其合成的酶已被证明的另一个重要作用增强的龋齿发展虽然的确切机制尚未阐明。水溶性多糖可能作为菌斑细菌代谢碳水化合物的来源如果营养条件有限(7),从而支持在釉质表面生龋齿的攻击。水溶性系统分泌进入环境介质可能参与体内牙菌斑的矩阵8]。关于EPSs-synthesizing酶,结果Venkitaraman et al。9]表明积极的协同活动GtfB和GtfD之间建议GtfD作为一种内在的不溶性葡聚糖合成的引物GtfB。水溶性的意义exopolymers可以进一步证明了Rundegren et al。10]显示唾液的交互组件和水溶性葡聚糖粘度增加唾液pH值6/7 / 65% 55%。这些charge-dependent交互影响血小板的凝聚力量的矩阵。在高分子量葡聚糖(可溶性葡聚糖),细菌诱导聚合,从而协助殖民(11]。龋齿的发展似乎需要SG的参与和研究小组合成基因如图所示变异链球菌突变体产生光滑面病变明显减少由于这些缺陷gtfD基因编码SG (12]。凝集素的特异性特定的糖是一个有用的工具进行分析和检测复杂的glycoconjugates。本研究的目的是小说的具体测试系统的建立与应用定量监测产生的水溶性系统变异链球菌不同生长时期通过glucan-specific凝集素伴刀豆球蛋白A。

2。材料和方法

2.1。微生物生长条件

变形链球菌(写明ATCC 25175)是生长在Schaedler肉汤(Becton Dickinson) 18个小时37°C。监控系统细菌培养液来自对数期的文化变异链球菌加入Schaedler汤没有蔗糖(介质)和5%蔗糖(介质B)。厌氧链球菌是种植了24小时,48 h, 144 h 37°C。微生物参数总细菌细胞计数/毫升(BC)的比例至关重要的链球菌(VS)和集落形成单位(CFU) /毫升种植在Schaedler琼脂(Becton Dickinson)评估在每个实验的开始和之后的每一个潜伏期。

2.2。荧光染色法的微生物

链球菌是彩色荧光在每个成长时期,通过两个DNA染色Syto 9和propidium碘(Invitrogen-Molecular探针)区分重要的细胞(绿色)和死细菌(红色)据CFU显微数字化生产(13]。链球菌的活力被定义为VS(%) = 100−死细胞的比例。

2.3。特定碳水化合物检测欺诈凝集素测定

2.3.1。参考糖

glucan-specific分析是基于糖的特异性凝集素伴刀豆球蛋白A (Canavalia ensiformis)与过氧化物酶标记(Con)(σ)葡萄糖聚合物。的lectin-based试验表征微生物多糖前面描述的14)是修改和优化在当下研究可溶性的检测变异链球菌支付系统和相应的参考糖。在目前的测试系统,20一个工作的解决方案μg / mL Con准备在生理盐水。酶联凝集素试验是评价有三个碳水化合物标准:右旋糖酐代表糖相当于系统矩阵变异链球菌黄原胶,异构多糖由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、二糖含有葡萄糖和果糖和蔗糖。100年μL整除的连续稀释1:右旋糖酐2稀释股票的解决方案(20μg / mL)和黄原胶和蔗糖(1毫克/毫升)与生理盐水(氯化钠)以及分析控件被添加到96 - 11稀释步骤中微量滴定板和涂敷20 h。随后,井用200μL无菌水。100年μL的监狱工作的解决方案是添加到每个孵化一小时。与每个200洗后三个过程μL PBS渐变为0.05%,100年μL刚做好的过氧化物酶的底物abt(σ)与过氧化氢被添加。在405 nm,动能光密度的措施进行每5分钟在60分钟。这些数据1- - - - - -3对应的数据来源于动能衬底孵化了45分钟。六个校准曲线创建为每个标准的碳水化合物。标准的糖的浓度是日志₁₀改变了对数曲线拟合的回归。

2.3.2。支付系统的变异链球菌文化

支付系统合成的变异链球菌监控两个营养条件下:没有蔗糖(A)和5%的蔗糖(B)的补充。细菌培养的颗粒浮在表面的涂层在微量滴定板根据部分中描述的条件吗2.4。1。清洗步骤后,盘子孵化了a监狱过氧化物酶的显色反应被添加的酶底物诱导abt和过氧化氢。光学密度监测活动每五分钟一个小时通过Elisa的读者在405海里。6在任何增长细菌实验条件(24小时、48小时和144 h)进行。此外,A和B的媒体被凝集素分析化验了欺诈检测。任何实验方法的缺点本文凝集素试验检测无菌或生长营养解决方案完成通过使用内部标准右旋糖酐的参考。

2.3.3。抑制试验的缺点

葡聚糖的特定绑定的反面是验证通过抑制活性结合位点反对通过添加α-methylglucoside (MG),以确保试验信号导致葡聚糖识别而不是从非特定的绑定在它们形成的文化15]。参考的碳水化合物和上层清液变异链球菌文化在微量滴定板涂层。反对一个preincubated 200毫米α-methylglucoside或氯化钠-控制30分钟。随后,一个解决方案是按照程序申请凝集素试验按描述。

2.4。总碳水化合物化学杜布瓦试验的检测

2.4.1。参考糖

Mono、低聚糖和多糖在治疗后给一个敏感的颜色反应与苯酚和浓硫酸。比色法测定糖(16)是修改使用submicroamounts试剂。标准糖浓度(右旋糖酐、黄原胶和蔗糖)用于校准方法的25岁,50岁,75,100,200,300,400,500,600μ克/毫升。30μ30 L样本或负控制混合μL 5%的苯酚和150年μL浓硫酸。30分钟后,光密度(OD)的样本是在490纳米处。

2.4.2。总碳水化合物的浓度变异链球菌文化

糖上层清液的浓度变异链球菌文化进行了分析化学在24 h, 48 h, h和144年增长时间Schaedler媒体A和B。

2.5。统计分析

所有实验进行六个独立实验一式三份(凝集素测定,杜布瓦试验)包括一个内部右旋糖酐在每个系列标准。以10为底的对数变换()是公元前和CFU完成的。统计分析的数据是使用mean-based执行95%的置信区间和克鲁斯卡尔-沃利斯检验的显著性水平。

3所示。结果

反对本文凝集素试验是评估参考碳水化合物右旋糖酐、黄原胶、蔗糖如图1。反对一显示的最高敏感性高分子右旋糖酐的检出限10 ng / mL的线性测量范围。黄原胶的检测极限是500 ng / mL了A监狱蔗糖没有诱导浓度特定绑定的反对。

碳水化合物的特异性检测欺诈的葡萄糖聚合物被抑制carbohydrate-binding凝集素分子的网站使用α-methylglucoside(图2)。的上层清液变异链球菌文化增长了24小时、48小时和144 h A和B在媒体监控系统生产应用的缺点本文凝集素试验(图3)。一些差异的95%置信区间由于系统配置文件可以观察到有关媒体A和B,而系统中可以检测到孵化时间点,相应的系统探测到的信号从媒介B主要出现在24 h和144 h孵化时间。dextran-like的系统在144年达到顶峰h B生产超过了葡聚糖信号a考虑稀释的24 h, 48 h,和144 h系统生产,增加右旋糖酐山峰更长的潜伏期时间从24 h - 144 h对媒体很明显。定量系统计算的相关数据进行dextran-like系统峰值变形文化中安装的右旋糖酐校准曲线(图3)。

比较系统概要文件在媒体A和B蔗糖在生长介质的存在似乎葡聚糖生产增加变异链球菌细胞24小时孵化时间。在48小时孵化时,系统生产的浓度保持不变与降低系统集中在b . 144 h孵化系统浓度上升后的营养解决方案。而产生的系统增加在144 h sucrose-deficient介质是两次生产24小时和48小时的dextran-like sucrose-supplemented介质系统显示在这个时间点一个显著增加约5.8倍产生的系统最大144 h后,大约五倍支付系统在24小时生产b系统内容的定量差异是独立于细胞总数显示常量值。

总碳水化合物的化学检测使用Dubois化验显示类似的检出限为右旋糖酐,黄原胶,和蔗糖约20μ克/毫升(图4)。碳水化合物监测24小时、48小时和144 h是类似的媒介和媒介B,分别95%置信区间(图所示5)。总的来说,媒介B的糖含量高出12倍平均比介质。

微生物生长参数VS,公元前日志和日志CFU显示类似的概要文件变异链球菌媒体和B(图的增长6)。而总细菌数保持不变,附近的48小时细菌活力下降为零。链球菌生长在sucrose-enriched介质的CFU值显示更强的两个日志的下降₁₀单位相比,变异链球菌在缺乏蔗糖培养基培养细胞。形态、变形链球菌独特成长为一个个独立王国只有在sucrose-supplemented介质的存在。

4所示。讨论

本研究的目的是开发一个特定的测试系统可行的监测的动态生产水溶性dextran-like支付系统的变形链球菌在不同营养条件下和增长时间点。凝集素的性能试验与标准碳水化合物(右旋糖酐和黄原胶),无菌媒体样本,抑制试验α-methylglucoside验证特定的测试系统的有效性变异链球菌相关的可溶性葡聚糖exopolymer检测。链球菌可溶的显著增加系统在中补充了蔗糖在后期阶段增长明显。dextran-like的时间监控系统显示一个动态累积的聚合物在链球菌潜伏期长增长媒体和没有补充的蔗糖。临床相关,蔗糖在龋齿活动作为证明关键作用可发酵碳水化合物源或诱导碳水化合物聚合(3,17]。黏液的性质这些glucan-rich糖聚合物介导葡聚糖的中央影响sucrose-dependent细菌粘附在牙齿表面和蔗糖博览会和增加龋齿率之间的相关性(18)尽管另外其他因素可能会影响致龋性(19]。此外,细菌抵抗抗生素的能力似乎与葡聚糖生产(17]。

关于不同的碳水化合物,可用性快速可利用的单糖(例如,0.58%葡萄糖中A和B)是优先被微生物代谢。在目前的研究中,暴露变异链球菌细胞蔗糖可能诱导转变含有葡萄糖相关酶的差别在碳水化合物代谢涉及对这些损耗的基础上,进一步提高蔗糖利用率和课程的刺激碳水化合物聚合活动随时间导致水溶性dextran-like系统最大在144 h。只有一些类似研究提供有关SG exopolymers的研究。示麦等人的研究。20.)透露,glucosyltransferase-encoding基因的mRNA表达,gtfB gtfC, gtfD,变异链球菌是carbohydrate-regulated和蔗糖刺激葡糖基转移酶的合成GtfB指数期早期GtfC更为明显。对SG的表达合成GtfD蔗糖诱导的存在只有低酶水平在早期和晚期指数阶段(21]。浮游环境中强大的代谢变化的转录和转译产品涉及在微生物从早期的指数增长阶段到成熟的固定相。可能相互冲突的结果表明,碳水化合物代谢大大取决于环境条件如媒体增长,碳水化合物含量、细菌菌株,碳水化合物的吸收,和实验室条件。最近,它已被证明变异链球菌细胞能显著改变其致病潜力和代谢反应暴露在氧气和根据成熟的细菌(22]。比较植物血凝素的显示数据分析和化学分析,碳水化合物的检出限进行欺诈检测是倍低于杜布瓦试验的分析手段。这个化学分析证实了媒体A和B之间的碳水化合物含量的差异,而不同生长时期的24 h, 48 h, 144 h不能检测到。

相反的时间响应系统累积在24 h - 144 h孵化的细菌减少活力和capaciticiy殖民地都营养条件下生长。

可想而知,链球菌失去繁殖能力和代谢活动在不利条件下但诱导累积的胞外聚合物作为生存策略的一部分。变形链球菌生长的观察在当下研究作为独特的一个个独立王国唯一的蔗糖在协议的研究Renye et al。23]。

总之,反对一个凝集素试验似乎适合dextran-like可溶性的支付系统的检测变异链球菌在不同生长时期在本研究的条件。系统生产增加蔗糖博览会在微生物成熟后延长培养时间(144小时)。还需要进一步的研究来证实潜在的临床应用。监测溶系统caries-risk患者的唾液可能成为有价值的工具除了临床参数。

确认

本研究支持科学医学院的国家宣传计划,德国图宾根。作者想感谢g·迈尔优秀的技术援助。