基因型的多样性变形链球菌在无龋齿和活跃的学龄前儿童中

摘要

目的．本论文的目的是评价其基因型多样性变异链球菌在巴西的无龋齿和活跃的学龄前儿童中。设计．采用dmft指数对28名学龄前儿童进行龋病经验调查。280株变异链球菌提取。变异链球菌利用PCR方法对糖基转移酶基因进行了评价。遗传多样性变异链球菌采用任意引物pcr (AP-PCR)对分离株进行分析。结果表明，基因型多样性与dmft/龋病经验差异显著检验与斯皮尔曼相关性。结果．斯皮尔曼相关试验显示，基因型多样性与患龋经验之间有很强的相关性(；)．有更多的变异链球菌学龄前儿童龋病组与无龋组的基因型比较。在超过1个基因型的儿童中，13个有龋齿(2 ~ 5个基因型)，4个无龋齿(只有2个基因型)。结论．我们的研究结果支持了之前关于遗传多样性的发现变异链球菌学龄前儿童患龋齿的几率对这类人群的调查可能对指导全球龋病预防规划的发展具有重要意义。

1.介绍

变形链球菌通常被认为是蛀牙的主要病因[1，2，它有各种各样的机制来在牙齿表面定殖。临床分离株变异链球菌它们的基因组或基因表现出相当大的差异[3.］．变异链球菌在某些情况下，菌种在致龋生物膜中具有显著的数量，并与口腔内的其他生物形成生物膜[4]在乳牙长出并定植后[5］．此外，流行病学调查证实，较高水平的变异链球菌儿童体内的微生物与龋齿、缺失和补牙(dmf)的高发生率相关[2，6］．相反，在没有患龋或患龋经验较低的人群中也可发现[7，8］．一种可能的解释是它们出现在低龋齿经验的受试者中变异链球菌不同人群的龋病流行程度不同，致病因素也不同[9］．

鲍登(10指出了理解克隆模式的必要性变异链球菌在无蛀牙的科目中，确定是否变异链球菌无龋齿受试者的群体表现出或非龋齿活跃群体相同的克隆多样性[10］．

几项研究表明，在变形链球菌压力(11- - - - - -16];然而，龋齿活动与遗传多样性之间的关系变异链球菌仍然是有争议的。Alaluusua等人[17提示高蔗糖摄入的龋齿活跃儿童具有更大的S。变形链球菌与没有龋齿的儿童相比。Napimoga等人[18发现龋齿活跃的受试者比没有龋齿的受试者拥有更多的基因型。另一方面，Kreulen等人[19龋齿活性与基因型多样性呈负相关。

本论文的目的是评价其基因型多样性变异链球菌在巴西的无龋齿和活跃的学龄前儿童中。

2.材料和方法

2．1．主题

研究参与者包括28名来自社会经济水平较低家庭的4 - 5岁学龄前儿童。他们有相似的生活方式、饮食和口腔卫生习惯。研究对象是从巴西南部一个中型城市幼儿园的一组儿童中挑选出来的。所有患者均来自日间托儿所，每周5天，每天8小时。在样本选择过程中，排除有任何慢性疾病并在最近3个月使用抗生素的受试者。解释了实验的目的和细节，并在研究程序开始前获得了父母和监护人的知情同意。实验程序由北巴拉那大学牙科学院的伦理委员会批准。

2．2.临床检查

孩子们坐在椅子上，在自然光下接受检查。诊断是目视的，使用口腔镜和棉花卷来帮助观察，必要时用牙周探针清除任何菌斑或碎屑。

龋齿经验是根据世界卫生组织的dmft(龋齿、缺失牙和补牙)指数来衡量的[20.］．龋齿经历分为两组:无龋齿组()及患龋儿童()．临床检查由同一检查者(F.J.S.P.)进行。测试者的一致性很高()．

2．3.菌株和DNA提取

变形链球菌从含有杆菌肽和碲酸钾的mittis - salivarius琼脂中分离出临床分离株[21］．大约10个菌落变异链球菌从每个孩子转移到脑心灌注肉汤- bhi (Difco，底特律，美国)和孵化在厌氧瓶中保存48小时。采用简单的DNA制备方法提取280个分离株的DNA，用Saarela等人改良的TE缓冲液(10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)洗涤细胞并煮沸10分钟。13]和威尔士和麦克利兰[22］．碎片成球，上清液保存在冰箱直到使用。

2．4．PCR分析

利用编码葡萄糖基转移酶的gtfB特异性引物进行PCR反应，证实分离菌株具有物种同源性Act aca CTT TCG GGT GGC TTGG和Cag tat aag CGC Cag TTT catc——(英杰公司)(23，产生517 pb的扩增子变异链球菌gtfB基因。每个反应由5个组成L模板DNA, 1每个引物，200个每个dNTP, 5L 1x PCR缓冲液，1.5 mM MgCl2, 1 U Taq DNA聚合酶(Invitrogen公司，São Paulo，巴西)，总体积25L.扩增反应共进行30个循环:变性30秒，在30秒，分机号码是1分钟。1株对照株(ATCC 25175)作为阳性对照变异链球菌以蒸馏水为阴性对照。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳分析，使用TBE缓冲液(89 mmol三硼酸盐，89 mmol硼酸，2 mmolEDTA;pH值8)，溴化乙锭染色，紫外光下观察。每个凝胶中都有一个100 bp的DNA阶梯作为分子大小的标记。所有反应至少重复两次。

2．5．AP-PCR打字

菌株鉴定为变异链球菌基因分型。遗传多样性变异链球菌采用AP-PCR方法对分离株进行分析。引物opa02 (TGCCGAGCTG)及外地加工措施13 (CAGCACCCAC)使用。PCR反应如下:1X PCR缓冲液(200 mmol .)Tris-HCl pH值8.4;500年更易氯化钾)与3.5毫米，每个dNTPs 0.2 mM，引物0.4 mM, Taq DNA聚合酶2.5 U, 2.5 U的DNA样本。PCR条件包括35个变性循环1分钟，在2分钟，分机号是2分钟，初始变性为五分钟，最后一次延长到5分钟。电泳过程如前所述;扩增产物在2%琼脂糖凝胶中分析。

对单个AP-PCR扩增子进行标记，利用Dice系数(95%)跟随Mitchell等人[24］．利用数值分类学和多元分析系统(NTSYS)程序(Exeter Software, Setauket, NY)进行UPGMA聚类分析，构建树状图。

2．6．统计分析

以dmft/龋病经验评价基因型多样性的差异检验和斯皮尔曼相关系数。统计学意义被认为在．数据分析使用了社会科学软件统计软件包，第11.5页(SSPS, Chicago, IL, USA)。

3.结果

应用AP-PCR方法对140株学龄前儿童龋齿分离株和140株无龋齿分离株进行分析，鉴定出62种不同的扩增型。数字1分别用OPA-02和OPA-13进行AP-PCR分析，得到不同的扩增谱，表明遗传多态性。

儿童的特征具有殖民化变异链球菌载于附表1．无显著相关变异链球菌的基因型多样性变异链球菌和性别。斯皮尔曼相关试验显示，基因型多样性与患龋经验之间有很强的相关性()．有更多的变异链球菌学龄前儿童龋病组与无龋组的基因型比较。在超过1个基因型的儿童中，13个有龋齿(2 ~ 5个基因型)，4个无龋齿(只有2个基因型)。

考虑到整个人群，一些学龄前儿童只有一个基因型，而其他儿童则有五个基因型(图)2)．

4.讨论

牙科生物膜由复杂的细菌群落组成，并具有特异菌株的能力变形链球菌与其他菌株竞争可能是殖民化的必要条件[25］．的研究变异链球菌毒力因子及其与其他物种的相关性是理解同一个体中不同基因型定植所起作用的基础[26］．

基因型多样性的知识变异链球菌可协助制订新的龋齿治疗策略，在标准预防治疗的基础上，预防疾病及促进健康[26］．

尽管Kreulen等人的发现[19]已经证明龋齿活动与基因型多样性之间存在负相关关系，Lembo等人的研究结果[27研究结果显示，无龋儿童与患龋儿童的基因型数量无显著性差异，本研究结果显示患龋活动与患龋儿童的基因多样性呈正相关变异链球菌．学龄前龋齿儿童比无龋齿儿童有更多的基因型，这与早期的报告一致[17，18，28，29］．生物膜中多种基因型的存在可能仅仅是有利环境的结果变异链球菌．此外，不同基因型的同时作用，具有明显的毒力潜力，有可能进一步增加患龋的风险[17］．

在对年轻人的研究中，Emanuelsson等人．［29研究发现，在曾经患过龋齿的受试者中，最多有7种基因型。Napimoga等．［18]也利用AP-PCR在龋齿活跃的受试者中发现了最多8种基因型。然而，据观察，儿童只有一到五种不同的基因型变异链球菌［3.，11，15- - - - - -17，19，30.］．这项研究的结果与之前报道的儿童研究结果一致。在无龋组中，10名学龄前儿童只有1种基因型。另一方面，在龋齿组中，13名儿童有一种以上的基因型。在这13种基因中，只有2种具有5种不同的基因型。这可能是由于在同一口腔内大量定植和多种基因型生长，可能是频繁食用可发酵碳水化合物的后果[31］．不同的克隆类型变异链球菌在一名受试者的口腔内检测到的病毒可能表现出不同的表型和遗传特性[31］．此外，高克隆多样性变异链球菌可能导致具有不同毒性属性的克隆的定植[32］．

我们的研究结果支持了之前关于遗传多样性的发现变异链球菌学龄前儿童患龋齿的几率对这类人群的调查可能对指导全球龋病预防规划的发展具有重要意义。

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