老鼠嗅黏膜间充质干细胞/基质细胞(OM-MSCs):描述研究

文摘

阀杆/基质细胞疗法是再生医学的一个分支,是一个有吸引力的选择,促进修复的损坏或不正常的组织和器官。嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞再生疗法被认为是一个有前途的工具,因为他们的一些良好的性质如多能——高增殖率、有用的位置,和一些相关的伦理问题。这些细胞易于接近鼻腔的大多数哺乳动物,包括老鼠,可以很容易地应用于自体治疗,而不应对大多数的障碍与其他干细胞的使用有关。尽管如此,在临床试验中的应用和在人类和动物患者仍是有限的,因为少量的研究到目前为止和执行的标准和明确的协议不存在收集、隔离和治疗应用。在目前工作的验证协议隔离,文化、扩张,冻结,解冻的嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞,应用于大鼠模型,以及这些细胞的生物学特性。调查OM-MSCs的治疗潜力及其在临床前试验,最终安全应用程序具备干细胞OMSC的主要特征是解决。

1。介绍

在过去的几十年里,细胞疗法在医学研究领域,出现的一种替代治疗一些疾病和病态以前困难的方法1]。这些疗法的应用程序是基于相关的修复机制开始,建立或疾病的进展。通过营养效应或原生细胞替换(2),细胞疗法使用干细胞/基质细胞促进其分化在特定地点和目的病理条件下3]。阀杆/基质细胞分为未分化,在适当的条件下能够无限增殖并能分化成不同类型的细胞和组织的刺激。多年来,寻找现成的,安全,稳定,潜在有效的常规使用的阀杆/基质细胞再生医学一直强烈的(4]。这些特征最初发现在细胞从老鼠骨髓,分离,表现出理想的特征如塑料附着力和修改成纤维细胞的殖民地文化单位(5]。发展与能力的中胚层和分化成专门的细胞,这些细胞后来被命名为间充质干细胞(msc) /基质细胞。也被称为多功能细胞,msc是异型的基质细胞,已经确认,可以在几乎所有的成年组织收集的几个物种。能够自我更新,多功能,几乎总是容易,可扩展在体外文化和异常稳定的从遗传的角度来看,他们是一个基本的再生医学和组织修复的重点6,7]。msc在再生医学中的应用处理容易扩张等特色文化,能够分化成所需的细胞类型,特定的免疫特点(immune-privileged和免疫调节),取向对于病变站点,营养刺激能力,以及调制的组织功能和炎症分泌重要生物活性分子(8]。与其他治疗方法,完整和明确的表征的作用机理还成立前使用,在msc的情况下,其治疗优势已经广泛的特点,即使还没有一个完整的理解的方式行动或体内功能(7]。

以来第一次描述,msc已经确定在几个成人组织,用很少的例外。组织,他们已确定包括脂肪组织,羊水,羊膜,sub-amniotic脐带衬膜,沃顿商学院的果冻,子宫内膜,经血,外周血,胎盘和胎膜,牙髓,唾液腺,皮肤和包皮、滑膜和嗅觉粘膜(OM) [4,9]。

尽管它使用和规律的描述,没有统一的定义或结论性的化验,允许msc的明确识别在混合的细胞(6]。2006年,国际社会细胞治疗(ISCT)专注于创造一个更具体的msc的定义和建立最低标准的识别。这些细胞必须:(a)下plastic-adherent标准培养条件;(b)提供一组标记(集群)分化包括CD73, CD90、CD105没有CD14,主要组织相容性复合体(MHC) II /人类白细胞抗原(HLA)博士和标记等造血血统CD34、CD45;和(c)能够区分在体外在至少三个细胞系:脂肪形成的,chondrogenic,成骨的(10]。这些特征是定义良好的人类msc,即使轻微的差异msc与不同的组织可以被识别。然而,这些标准可能不足够为所有物种描述msc。常用的不承认类似表面抗原的抗体的动物细胞相同的亲和力,和表达水平的变化可能发生而表现在人类细胞(11]。然而,对于人类定义的标准仍然是那些用于动物细胞的特征和应该以适应和加权的方式使用。有关分化的能力,开展多项研究已经成为可能察觉到msc能不仅传统tridifferentiation也来自其他细胞和组织的中层(韧带、肌腱、心肌细胞、肌肉),外胚层和内胚层的起源(皮肤、视网膜、肺、肝细胞、肾管,胰腺胰岛,皮脂腺导管和神经细胞)(12]。另外,最近新标记已经探讨了识别那些可以被认为是stemness-associated MSC基质细胞标记,反对传统的MSC标记一些作者问题,表明作为被认为更合适的基质细胞标记(13]。在这组,CD271表示作为一个潜在的前体均匀亚种群的msc和描述为改善文化同质性的方法。即便如此,一些研究表明,即使是CD271-MSCs异构增殖,分化和免疫调节的潜力,有助于异构成人MSC属性(14]。因此,新功能相关的表面标记的识别是非常重要的,确保创建健壮的质量标准,将允许更好地控制使用msc。

msc在收集固有层OM命名的嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞(OM-MSCs)虽然嗅觉系统的元素来自于基板ectoderm-derived之间的交互和颅神经嵴细胞迁移15]固有层组件,因此OM-MSCs很大程度上被认为是来源于神经嵴(16]。OM-MSCs最初确定的OM胚胎鼠(17]。不同的研究已经进行了其特性可以识别能力形成fibroblastic-like低密度殖民地和经典标记的表达和分化有关的15]。虽然能够tridifferentiate OM-MSCs似乎比内层中更容易分化成成骨细胞和脂肪细胞(15]。此外,他们仍然可以遵循一个肌原性的和神经源性分化18)及其条件培养液促进鞘细胞的增殖,少突细胞前体细胞和髓鞘形成在体外(18,19]。最重要的特征,使这些细胞最佳候选人再生医学是其通用性高,广泛分布在鼻腔20.),容易获得一些相关的伦理问题和小易的发展染色体或肿瘤发生的改变21,22]。甚至高的有丝分裂活动,这些细胞能维持自我更新能力文化长时间保护端粒的活性和抑制凋亡活动特征不受供体的年龄23]。

的解剖位置嗅觉粘膜都很好临死前的和后期在大多数物种的临床利益。OM收获在小动物模型,如老鼠,老鼠或兔子,要求安乐死,但外围组织的位置和使用适当的无菌技术在集合允许重用动物从其他研究中,一旦保证没有污染的嗅觉区域发生17,24- - - - - -26]。一个临死前的收集老鼠也被描述的方法,但其复杂性使其难以被应用定期收集OM和隔离OM-MSCs [24,27在人类和更大的物种,OM很容易收集在活的有机体内使用rhinoscopy技术和鼻钳15,28- - - - - -30.),然后使OM-MSCs巨大的自体移植候选人在家畜和人类治疗不同类型的病变,特别是神经损害。

检查参与组成分泌腺先前的研究对OM-MSCs允许识别的生产和分泌生物活性分子直接影响神经分化,即生产和成熟的神经胶质细胞(31日]。此外,其临床潜力已经测试领域的实验神经病学,神经退行性疾病的治疗中枢神经系统(32),海马病变(33,34),在周围神经的再生和颅神经(35- - - - - -38和在脊髓损伤的情况下39,40]。其immune-suppressive效果在自身免疫性疾病(41,42)和再生促进梗死后心肌组织(43)和缺血性组织(44)也被评估。

到目前为止,OM-MSCs研究和特征在不同区段在物种如人类15,鼠标45),兔(26,狗28)、羊、马、猕猴和狐猴(29日]。老鼠的OM-MSCs,动物模型与特定兴趣神经系统和周围神经的再生医学,已经探索了在一些研究[17,27,29日),虽然仍有许多发现和研究OM-MSCs在这个物种。

这项工作的目的是执行一个完整的描述的老鼠OM-MSCs,使用一个完整的、纵向,顺序排列在其他研究中没有观察到。特别强调了细胞分离的方法,文化和扩张,冻融协议。此外,其生物特性进行了与细胞行为文化,测定细胞核型,测定细胞基因表达、识别特定的蛋白质从细胞表面,测试multilineage分化能力和特性检查参与组成分泌腺的概要文件在扩张,对免疫调节能力。想象他们的后续使用再生疗法,也具备干细胞OM-MSC特征评估。

2。材料和方法

所有批准的程序进行动物有机体负责动物福利(ORBEA)的阿贝尔萨拉萨尔生物医学科学研究所(ICBAS)大学的波尔图()项目(209/2017)和葡萄牙兽医当局(DGAV)(项目DGAV: 2018-07-11 014510)。动物测试程序都是符合欧盟指令2010/63 /欧洲议会和葡萄牙DL的113/2013,并遵循根据经合组织指导文件的识别、评估和使用临床体征作为实验动物用于人道的端点安全评价(2000)。采取了足够的措施来减少疼痛和不适考虑人道的端点动物痛苦和痛苦。

十大鼠(鼠形),雄性sd,中与8 - 9周的男性性别,年龄和200 - 300 g BW用于OM组织的集合。3 R的角度来看,合作研究小组内的其他作品,考虑组织收集动物被重用,为他们牺牲了其他研究的目的。动物preanesthetized甲苯噻嗪(Rompun®, 1.25毫克/克)和氯胺酮(Imalgene 1000®, 9毫克/ 100克)腹腔在一个单一的管理。使用化学方法执行安乐死与戊巴比妥钠麻醉用药(Eutasil®200毫克/毫升注射溶液,切瓦桑特Animale, 200毫克/公斤)管理的腹腔内。

2.1。的嗅觉粘膜

OM收集如前所述[24]。集合本身是用镊子,atraumatically, OM衬里嗅觉休会,地区的鼻中隔和残余ethmoturbinates分离并立即沉浸在传输介质组成对磷酸盐生理盐水(PBS) (DPBS, Sigma-Aldrich®)。针是用来轻轻剥粘膜从沉积到解决方案的镊子。OM集中样本收集不同的动物,在4 - 6°C条件。

2.2。样品运输和存储

一旦OM的收集完成后,碎片在交通运输中实验室设施尽快冷藏温度下其他的脊髓4°°C。这里,只要即时处理是不可能的,片段的OM离心机在传输介质,与随后的上层清液的清除。碎片被resuspended存储解决方案包括3%的抗生素(青霉素100 U / 100 mL /链霉素μg / mL) (Sigma-Aldrich®)], 3%抗真菌的两性霉素B (2.5μg / mL) (Sigma-Aldrich®)和PBS。一夜之间,这个过程后,碎片被存储的存储解决方案的制冷温度4°其他°C或冷冻保存以备后用。为了确保完整性,这之间的时间存储和处理的样品从未超过24 - 48 h后安乐死和OM收集、组织冻存时扣除。所有细胞使用,考虑在不同的化验工作起源于从池中获得的10大鼠OM收集。

2.3。隔离和在体外扩大OM-MSCs

与电池相关的所有程序隔离和扩张在严格的无菌条件下进行,在层流罩。OM碎片离心机和上层的消除。OM片段转移到无菌培养皿很仔细,碎片沉浸在PBS避免脱水。OM片段被切割成小块,减少他们的部分不超过1 - 2毫米²。两个阶段被认为是在隔离的方法。在第一阶段,一个酶消化从细胞外基质释放OM-MSCs执行。减少碎片被转移到一个管,0.25%的溶液Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich®)添加酶消化。酶消化了水浴(37°C)大约15分钟,在不断的搅拌。酶消化后,碎片是离心机和上层的消除。其次,这些碎片被转移到6-well组织培养处理板(多井细胞培养板6井,VWR®)的密度1 - 3每口井的碎片,让他们站5 - 10分钟让坚持塑料表面(25]。一旦坚持证实,preformulated培养基组成的基础培养基(DMEM / F12 + GlutaMAX™补充,Gibco®)补充10%胎牛血清(的边后卫)认证(一胎牛血清,Gibco®), Penicillin-Streptomycin 1.5%和两性霉素B (1.5%26),在足够数量的外植体,被添加到每个好,小心,以免打扰外植体坚持塑料表面。漂浮的碎片被发现(不粘),过程中被除去,分钟后重复。盘子被孵化在标准条件(37°C, 5%的公司₂调湿大气)。井日常用倒置相差显微镜观察(Axiovert 40节能灯,蔡司®)搜索OM-MSCs外植体的辐射。媒体每2 - 3天刷新。

一周后,细胞被观察到的辐射从外植体和入侵的井盘子。4天后,细胞目的达成的70 - 80%。在这个阶段,媒介被小心翼翼地和外植体。每个与PBS被丰富,细胞分离使用0.25% Trypsin-EDTA解决方案和一个在标准条件下培养3 - 5分钟。所有井的内容被收集和离心机(1600 rpm, 10分钟),上层的消除和细胞受移植者T75培养瓶血压得到较好的控制(Nunc™EasyFlask™75厘米²,ThermoScientific®)的密度2.1×10⁶细胞/厘米²。

2.4。细胞行为文化

2.4.1。生长曲线和细胞生存能力

细胞保持在35天文化来确定他们的生长曲线。只要达到70 - 80%的融合,一种新的细胞通道,导致15通道总数。每个通道是由消除培养基,洗涤与PBS、细胞分离有0.25% Trypsin-EDTA解决方案和孵化在标准条件下3 - 5分钟,离心(1600 rpm, 10分钟)和消除浮层。确定细胞的数量和他们的生存能力在每个通道,台盼蓝排斥细胞试验(46),与细胞计数自动计数器(女伯爵二世FL自动细胞计数,热费希尔科学®),。

2.4.2。人口倍增时间(PDT)

OM-MSCs用来计算PDT解冻,维护文化,收获在70 - 80%的融合。然后,他们镀培养基在10井的12-well板(12平的测试板,橙色科学®)密度为0.05×10⁶细胞/厘米²。为10天,细胞的数量从一个每天决心。的最后10天,PDT是通过提出的方法定义Lotfy et al。(47]。使用的公式是 ,被CT文化时间(在本例中,10天)和生产人口数量翻倍。生产是使用公式计算 ,被细胞收获的亚文化,剂和使用的手机号的翻倍水平培养液用于启动量化的亚文化。这里的价值是未知的,它被认为是0。PDT决心为3种不同的时刻,即细胞P2-P3, P6-P7, P13-P14。对于每一个段落,一式三份被认为是。

2.4.3。集落形成单位化验

集落形成单位(cfu)分析了根据Penfornis表示方法等。(48]。短暂,OM-MSCs P3维持在文化融合的70 - 80%,紧随其后的是酶分离Trypsin-EDTA 0.25%解决方案。收集细胞稀释使用1:2系列在生长培养基稀释,以使镀层的密度从10到80个细胞在每个six-well板。在标准条件下细胞培养14天日常monotorization确认殖民地的发展。这一时期后,培养基被和富国沾0.5% (v / v)的结晶紫溶液在室温下5 - 10分钟。殖民地的数量在每个量化使用放大镜(2000年徕卡变焦,Meyer仪器®)。只有可见的殖民地与超过1毫米的直径或50岁以上的细胞被认为是。重叠的殖民地没有考虑。clonogenicity克隆效率(%)计算使用公式 。建立CFU价值,6井( )从six-well板数。

2.4.4。低温贮藏和解冻

OM组织碎片,以及OM-MSCs孤立和在不同段落受到低温贮藏和解冻周期确定可行性,随后细胞性能和保护细胞和组织的该方法的有效性。文化受到细胞酶分离trypsin-EDTA 0.25%解决方案,收集和自动计数。OM-MSCs低温贮藏与培养基和10%二甲亚砜(DMSO) (SigmaAldrich®) (49在cryovials至少1×10⁶细胞。cryovials被转移到冷冻容器与异丙醇(耐尔根先生®®,ThermoScientific®)缓慢冻结(−−1°C /分钟)80°C。一段最大的3天之后,cryovials被转移到罐液氮容器内(−196°C)为长期冷冻保存(LS750低温样品存储,泰勒沃顿®)。低温贮藏的过程是相同的OM片段,与差异,在这种情况下,cryovial放置在4°15 - 20分钟,让DMSO溶液的渗透到组织转移前−80°C。

cryovial内容是使用水浴解冻(37°C)的快速解冻。在层流罩,cryovial内容很快被收集,离心机,上层的丢弃。OM-MSCs resuspended培养基,统计,在标准条件下培养,和维护。OM碎片的过程是相同的,所执行的外植体酶治疗后镀后解冻。

2.5。分化的协议

细胞分化的协议,在P4解冻后使用。

2.5.1。脂肪形成的分化和油红O染色

脂肪形成的差异化协议,1×10⁴细胞/厘米²被播种的井12-well板、培养基的添加。板是在标准条件下孵化了4天。这一时期后,培养基10井被完全取代脂肪形成分化培养基(StemPro®脂肪形成分化装备,Gibco®) 2井被用作控制和维护与通常的培养基。制造商的指示后,每3 - 4天,媒体被分化的细胞保持了14天。年底这段时间,油红O染色协议使用手工执行的解决方案。文化和分化媒体被移除,井与PBS轻轻洗。细胞被固定为4%甲醛(3.7 - -4%缓冲pH7,参考# 252931.1315,Panreac AppliChem®)在室温下10分钟,并与PBS井洗3次。油红O的解决方案是添加到每个好,板在室温下培养10 - 20分钟。油红O丢弃,多余染料被几个洗PBS。PBS是添加到每个可视化。 The aim of this assay was the identification of intracytoplasmic lipid vacuoles and their red coloration due to the exposure to the Oil Red O solution.

2.5.2。Chondrogenic分化和阿尔新蓝染色

解冻OM-MSCs被自动计算和%细胞生存能力确定。细胞被离心机,上层清液,和颗粒resuspended生成细胞悬液的培养基为1.6×10⁷可行的细胞/毫升。生成micro-mass文化,5μl液滴的细胞悬液被放置在中心10井的96孔板(细胞培养板,96 - VWR®),以诱导chondrogenic分化。板是在标准条件下保持2小时。这一次之后,chondrogenic分化培养基(StemPro®软骨形成分化装备,Gibco®)添加到8井,2井被认为是控制和这些常用的培养基是补充道。制造商的指示后,媒体取代每3 - 4天,在分化细胞保持了14天。在这段时期结束时,阿尔新蓝染色协议执行(阿尔新蓝8 gx Sigma-Aldrich®)。文化和分化媒体被移除,井与PBS轻轻洗。细胞被固定为4%甲醛在室温20分钟,并与PBS井洗3次。阿尔新蓝的解决方案是添加到每一个板,在室温下孵化30分钟。阿尔新蓝被丢弃和富国与醋酸清洗3次3% (v / v)。中和酸性和可视化的倒置相差显微镜、蒸馏水被添加到所有井。 The final aim of this assay was the identification of chondrogenic aggregates and their coloration in blue due to the exposure to Alcian Blue solution.

2.5.3。成骨分化和茜素红染色

成骨分化,8×10³细胞/厘米²被播种的井12-well盘子。板是在标准条件下保持了4天。这一时期后,培养基10井被完全取代成骨分化培养基(StemPro®成骨分化装备,Gibco®),和2井被用作控制和维护与通常的培养基。制造商的指示后,每3 - 4天,媒体被分化的细胞保持了21天。年底这段时间,茜素红S染色协议使用一个商业解决方案执行(茜素红染色方案,Milllipore®)。文化和分化媒体被移除,井与PBS轻轻洗。细胞被固定为4%甲醛在室温下30分钟,和井用蒸馏水洗两次。40毫米的茜素红溶液添加到每个盘子孵化30分钟。茜素红被丢弃,井与蒸馏水冲洗3次,直至上层清液变得清晰。可视化的倒置相差显微镜、PBS被添加到所有的井。 The aim of this essay was to identify calcium containing osteocytes stained red after exposure to alizarin Red solution.

2.5.4。神经源性分化

神经源性分化,4×10³细胞/厘米²被播种的井12-well盘子。板保持在标准条件下,和媒体取代每3 - 4天,直到达成的70 - 80%。媒体被从所有井和8人收到神经源性分化培养基(MSC分化培养基,PromoCell®),和2井被用作控制和维护与通常的培养基。板培养5天,和媒体改变了每48小时。

2.6。逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)

rt - pcr针对特定基因表达的差异OM-MSC细胞,在4和6通道。19个基因的表达分析允许的识别与标记相关的基因包括最低标准的描述细胞根据ISCT msc (10)和分化的标志。三个基因作为多能干细胞的标记(NANOG, Oct4、Sox2),四个基因作为MSC标记(CD105, CD90、CD73 CD44),两个基因作为造血标记(CD45 CD34)和基因作为标记的区别:成骨的(BSP Runx2) chondrogenic(科尔II, Aggrecan),脂肪形成的(Ap-2 AdipoQ),神经性(神经生长因子和GDNF), tenogenic (Tenomodulin)和musclogenic(肌间线蛋白)进行了分析。GAPDH是用作看家基因。识别基因表达,96孔板(' PCR定制板96,生物Rad实验室®)创建有19个预先设计引物的表示基因(补充材料-表S1)。

2.6.1。RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成

隔离总RNA的RNA进行了兰姆™迷你包(生物Rad实验室®),根据制造商的指示。简单地说,一个2×10⁶细胞颗粒细胞溶解,溶解的解决方案,DNA切除DNAase我酶和筛选了80μl洗脱的解决方案。RNA是储存在−80°C,供以后使用。互补脱氧核糖核酸合成之前,RNA的数量和纯度决心通过紫外分光光度法测量_260年/一个_280年(蛋白质污染指标)和一个_260年/一个_230年(指标的多糖、酚和/或离液序列高的盐污染)的吸光度Nanodrop分光光度计(Implen Isaza)。纯度值被认为是可接受的范围从2 - 2.2_260年/一个_280年从1.8 - -2.2_260年/一个_230年(50]。

从3.51第一链互补dna合成μ20 l的总RNAμl最后体积,使用iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(生物Rad实验室®)根据制造商的指示。完整的反应混合热循环仪是孵化(T100™热循环、生物Rad实验室®)使用制造商的时间和温度上述工具包指南。

2.6.2。定量rt - pcr检测

rt - PCR分析都使用了CFX96触摸™实时PCR检测系统(生物Rad实验室®)标准PCR条件和使用itaq™普遍SYBR绿色Supermix(生物Rad实验室®)根据制造商的指导方针。盘子被读实时PCR检测系统。每一对引物目标基因是用于分析他们在OM-MSCs表达式。板包含混合针对19基因受到温度周期由制造商表示。rt - pcr竣工后,基因表达进行了分析。确认产品的特异性,融化曲线的分析也执行。

阈值的周期(Ct) < 29日被认为是强阳性反应表明丰富目标样本中核酸;Ct在30岁至39岁之间被认为是积极的反应表明适量的目标核酸;Ct > 39对应于弱反应和显示最低目标核酸值或环境污染。对于每个通道,值计算公式 。褶皱之间的差异这两个通道是使用标准的计算与公式 。②相对量化计算的公式:中移动基因值< 0.5是理气和中移动值> 2差异。

2.7。细胞遗传学分析

评估的核型,OM-MSCs在三个不同的段落(P5, P8和侯)提交给细胞遗传学分析来确定染色体稳定性的染色体数目和肿瘤的发生变化。对于所有段落,融合了70 - 80%,培养基被改变和补充10μg / ml秋水仙胺的解决方案(KaryoMAX®秋水仙胺™解决方案,Gibco®)。4 h后,OM-MSCs收集和resuspended 8毫升0.075氯化钾溶液,其次是在标准条件下孵化15分钟。离心后(1700 rpm), 8毫升的冰冷的固定剂的比例由甲醇和冰乙酸3:1,添加和混合细胞再次离心。三轮固定。最后离心后,暂停OM-MSCs分布在玻璃幻灯片。核型分析是由一个得分手Giemsa-stained细胞。为不同的段落,特定数量的细胞在中期评估依赖于细胞的数量与正常核型识别,保证更好的表示下的人口研究。

2.8。免疫组织化学分析

早期的通道(P5) OM-MSCs提交免疫组织化学分析检测特定抗原(表1)。细胞被维护在文化直到70 - 80%的融合,然后用0.25% Trypsin-EDTA酶进行分离解决方案和石蜡cytoblock (SureThin®®保护电池解决方案,Cytoglobe GmbH®)完成。部分被削减时2μm, deparaffinized、脱水和提交给免疫组织化学分析使用Novolink™聚合物检测系统(徕卡生物系统®)装备,根据制造商的指示。信息的主要抗体和抗原检索方法用于研究总结在表1。间充质来源的抗体选择确认OM-MSCs(波形蛋白和c - kit),抛弃一个内皮(CD31)和上皮细胞角蛋白(AE1 / AE3)起源和识别神经(synaptophysin)的表达和神经胶质标记(GFAP)。

样本观察、评估和使用显微镜拍摄Eclipse E600(尼康®)和软件成像软件NIS-Elements F Ver4.30.01(实验室成像®)。Immunoexpression得分不同标记的标记细胞的百分比(< 5%;5 - 80%;> 80%)和标记强度(0,-;+,弱;+ +,温和;+ + +,强)。免疫反应性被认为是积极的在识别不同的核和cytoplasmatic染色时至少5%的细胞。

2.9。OM-MSCs检查参与组成分泌腺的条件培养基分析-

识别特定的趋化因子和生长因子产生和分泌,OM-MSCs条件培养液(CM)进行了分析。空调,月初OM-MSCs通道(P4)应用。一旦融合达到70 - 80%,培养基被免职,培养瓶轻轻用PBS 5次。培养基的培养瓶进一步洗两次。随后,基本培养基没有补充,抗生素,抗真菌的,或的边后卫被加入到培养瓶,这是在标准条件下孵化后48 h。这一时期,文化中丰富的细胞分泌的因素(条件媒体)收集,离心机,上层的收集。厘米是储存在−20°C,随后分析了多路复用激光焊道分析(夏娃技术,加拿大)搜索一组特定的生物标志物(数组TM-Featured细胞因子/趋化因子数组8-plex (recyt - 08 - 204))。生物标志物研究干扰素(IFN -γ)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素- 2、il - 4、il - 6、地震)。六个独立的CM的样本进行了分析。

2.10。统计分析

统计分析了使用软件GraphPad Prism 6.00版本Windows(美国加州拉霍亚GraphPad软件)。在适当的时候,数据表示为±SEM。对比组通过一个参数测试与分析。的值被认为是具有统计学意义。结果显示,根据的重要性值的符号( ),( )对应0.01≤P< 0.05,( )0.001≤ ,( )0.0001≤和( )来 。

3所示。结果

3.1。隔离和在体外扩大OM-MSCs

执行的程序隔离OM-MSCs从OM混合,包括外植体镀后酶治疗。这个方法显示疗效和允许观察OM-MSCs辐射从外植体和收获后1到2周内进行电镀的外植体(图1(一))。

3.2。细胞行为文化

细胞观察辐射从外植体和那些在文化显示透明塑料附着力,大多呈形态,一个重要的特性来描述细胞为msc(数据1 (b)- - - - - -1 (e))。考虑之前的段落,粘附时间长,细胞生长和增殖较慢。电池性能、粘附和增殖是最大P5和P8之间。在这个阶段,低时间依从性,明确呈形状,观察和短时间达到理想的融合。段落P8-P9后性能逐渐下降。

3.2.1之上。生长动力学和细胞生存能力

生长曲线是通过分析OM-MSCs超过15章节(P15)。细胞量化的数量保持稳定在前两个章节,以指数增加第七段。这一阶段后,观察标记细胞的数量减少量化,这个值保持稳定,直到P15(图2(一个))。在第一段细胞生存能力较低。之间的通道2和12%通过可行性仍在99%和100%之间。在过去的三个段落生存能力逐渐降低(图2 (b))。

3.2.2。PDT

细胞的生长曲线不断增长的文化有相同的形状的三个决定PDT对指数和固定阶段(图3)。关于滞后阶段,这是很容易识别段落P2-P3和P13-P14 P6-P7中不可见的图。PDT的平均值是92.87±0.04小时通道P2-P3, 80.94±0.79小时为P13-P14 P6-P7和113.99±18.01小时(图4)。

3.2.3。集落形成单位化验

CFU化验可以证实的能力OM-MSCs从单个细胞产生新的纤维母细胞的殖民地。14天的孵化后,可以确定平均35.33±3.56殖民地与主轴每口井的形态,大约212个殖民地到1毫米形成于大约480种子细胞。%的clonogenicity(图44.16±4.45%5)。

3.2.4。低温贮藏和解冻

OM-MSCs提交低温贮藏和解冻过程可检测的表现并没有变化。低温贮藏发生独立的通道,解冻后,细胞粘附在塑料表面发生在几个小时,70 - 80%的融合达到3至4天,预期的形态学OM-MSCs(呈形状)也被观察到。解冻的细胞低于P5 ( ),%细胞生存能力由台盼蓝排斥试验为97.83±1.07%,生存能力95%以上的所有样品测试。

3.3。分化的协议

3.3.1。脂肪形成的分化和油红O染色

OM-MSCS的能力去证实了观察形态学变化(大细胞圆形形状)和红染色脂质空泡在细胞质中由于接触油红O的解决方案。(数据6(一)和6(b))。

3.3.2。Chondrogenic分化和阿尔新蓝染色

能力的OM-MSCS chondrogenic分化的观察证实了chondrogenic聚集和细胞外基质染色蓝由于接触阿尔新蓝蛋白聚糖的解决方案(数据6(c)和6(d))。

3.3.3。成骨分化和茜素红染色

OM-MSCS能力的成骨分化能力鉴定证实了含钙骨细胞和细胞外钙沉积红染色茜素红溶液(数据由于接触6(e)和6(f))。

3.3.4。神经源性分化

1天更换培养基后神经性的感应中,明显的形态学改变OM-MSCs中已经观察了neuroglial-like形状与轴突和dendrite-like细胞结构(数据的发展6(g) -6(我))。neuroglial-like形态是维护整个5天的观察,但增加死亡率和悬浮的细胞碎片数量也确认。

3.4。rt - pcr

表2每个基因,显示了平均Ct值ΔCt,ΔΔCt和RQ值。根据执行的分析,显示样品纯度,允许其使用在随后的阶段。细胞在P4, CD90和CD44显示Ct值< 29。所有其他基因,除了BSP, 30—39之间平均Ct值,表明积极的反应和适量的目标样本中核酸。在P6细胞,也再次CD90和CD44, Ap-2显示Ct < 29,丰富目标核酸的样本,和所有其他基因值在30岁至39岁之间。在这两个段落,CD45、CD34和AdipoQ基因没有检测到表达。统计上显著的差异确定了ΔCt值之间的基因Oct4、Sox2, CD105, CD90、CD73, CD44, BSP,科尔二世,Ap-2, Tenomodulin肌间线蛋白P4和P6(图7)。比较这两个段落,fold-expression观察变化的基因。在P6, NANOG OCT4、Sox2 CD105, CD90、CD73, CD44, GDNF, Tenomodulin德民出现衰减和Ap-2 BSP,科尔二世,aggrecan和神经生长因子出现差异。

3.5。细胞遗传学分析

细胞遗传学评价允许高百分比的细胞的识别与正常核型的物种(42岁,XY)通道(图8),尽管小这个比例在下降通道P8和侯P5。对于细胞有丝分裂指数,值是正常的段落P5和P8和低通道侯(表3)。

3.6。免疫组织化学分析

免疫组织化学,OM-MSCs显示synaptophysin弱免疫反应性(占总人口5%的细胞),适度的c - kit(包括5 - 80%)和强劲的GFAP染色和波形蛋白(涉及> 80%的细胞)。细胞为阴性AE1 / AE3和CD31 immunomarkers(图9)。

3.7。OM-MSCs检查参与组成分泌腺的条件培养基分析-

的平均浓度下CM中的每个生物标志物分析如表所示4和图10。

4所示。讨论

尽管OM的多功能细胞已经知道了很长一段时间(17),最近才OM-MSCs已经充分确定。一直努力描述这些细胞在不同的物种,并建立适当的收集、分离、描述、存储、应用方法和实验。在目前的工作,一个广泛的描述进行鼠OM-MSCs确认阀杆/基质细胞的特性和潜在的使用在未来的再生疗法。作者选择了所有程序执行的详细描述,由于制造工艺的变化可以导致比较困难获得的结果在不同的实验室和在不同的作品中,许多这些差异可以解释通过变化建立协议(11]。

尽管OM-MSCs的利基是有益的因为他们的身体外围位置,嗅觉休会,OM的远程位置在鼻腔和鼻甲骨的错综复杂的解剖特点,使进入该领域,大大阻碍了OM组织集合(51]。协议应用于这项工作是一个快速和有效的替代方案的集合OM碎片从老鼠的鼻腔,不需要复杂的过程或具体的手术器械。应该小心,避免过于激进的方法可能触发的鼻腔出血和OM的污染。(24运输和储存)解决方案的碎片OM在处理之前也OM-MSCs的重要组织保护和完整性。这里,在所有的程序,我们选择使用PBS因为它能够防止细胞破裂或皱缩由于渗透52]。抗生素和抗真菌的使用,因为收集OM的过程及其解剖位置、容易污染,避免细菌或真菌污染。

无菌条件都保持在执行程序的隔离和文化。对于细胞培养,除了抗生素和抗真菌的使用已经提到,培养基的组成基础培养基富含葡萄糖,氨基酸,维生素,补充动物生长的边后卫。所有的培养基是无菌过滤(Acrodisc®注射器过滤器,苏泊尔®膜,0.2μ米),细胞培养孵化项目在标准条件下进行(37°C, 5%的股份有限公司₂调湿大气)。所有这些制造业实践确保维护健康和功能的细胞培养没有污染在整个研究期间,在所有的程序执行。

混合的隔离OM-MSCs从OM碎片是有效的。之间的时期电镀的外植体1和2周后,可以观察到光辉的纺锤状细胞板,发现在其他作品与鼠(22)和其他物种(34,46]。尽管一些作者喜欢一个简单的方法没有执行酶消化的OM片段28,53],外植体的酶镀前处理并不影响OM-MSCs的特点,证实了其他作者(30.]。隔离OM-MSCs和他们的文化之后,msc(可以观察它们的特性10),即塑料附着力和fibroblastic-like形状,证实了其他作者(29日,54]。更高的段落,形态变化可以观察,细胞出现更多的圆形和失去了细长的形状特点,其中一些分离,和增加的细胞碎片悬浮在媒介。这些变化与大量的段落是常见和msc在长期文化的特征55]。

生长动力学可以通过生长曲线研究PDT,不应视为同义词的概念。而生长曲线允许比较的数量和特征在同一程度的融合细胞沿着不同的段落,细胞的数量是决定只有通过本身的时候,PDT显示了时间培养细胞的数量增加一倍,通过日常决定沿着相同的通道的细胞数量。通过测定PDT也可以绘制生长曲线在相同的日子。而这两项研究在目前的工作可以做在一起,PDT是一个更好的指标以来的细胞表现细胞生长捐助者之间有很大的差异和方法的准备。PDT直接与遗传稳定性和复制衰老相关,与失去效力。此外,PDT可以分析和比较不同的研究很容易(56]。描述的生长曲线观察相同OM-MSCs从其他物种26]。生长和细胞生存曲线显示细胞活力较差在较低和较高的通道,通过一个低数量的细胞,降低细胞生存能力。细胞生存能力应该为健康的文化(至少95%57)和从P13值低于这些观察。增长曲线分析了PDT测定证实了这些观察。msc的增长必须发生在三个阶段:最初的迟滞期,快速和指数增长阶段,固定相(58]。这三个阶段中存在的增长曲线OM-MSCS 3时刻考虑。最后,PDT P7-P8较低,其次是P2-P3,通道P13-P14最糟糕的结果。回忆,PDT越低,越快电池效率的增加到两倍。PDT值观察到在这个工作是高于鼠OM-MSCs在其他作品的描述29日]。所有这些发现,连同OM-MSCs的观察行为在文化、确认衰老现象的发生在长时间的文化(59]。衰老现象开始当msc培养和逐步恶化随着时间的推移,沿着通道,逐步减少的增殖潜能,端粒缩短和障碍函数55,60]。形态学的衰老表现废墟中、颗粒在细胞的细胞质61年]。所有的这些现象在OM-MSCs观察研究,尽管早期的研究报道在长期文化嗅觉neuro-epithelial派生的祖细胞自我更新维护的端粒酶活性和凋亡的缺乏活动(23]。因此,老鼠的OM-MSCs应该分配给细胞疗法的早期阶段的理想在体外文化、理想的P4和P8之间。

cfu的确定是一个很好的方法来评估自我更新效率和骨髓间充质来自殖民地的能力从一个前驱细胞(62年]。殖民地的数量由一个特定的种子细胞的数量代表了克隆形成效率,可以被定义为clonogenicity细胞的人口。在目前的研究中,在其他作品关注OM-MSCs [15,26),细胞起源于几个殖民地纺锤体形态,呈现clonogenicity值接近那些硬币的文学(29日]。

低温贮藏是一种重要的方法来保持msc,允许几乎立即可用性的细胞在细胞治疗和再生医学临床应用。在低温贮藏和随后的解冻过程中,重要的是,msc维持他们的内在属性,即他们的文化行为,他们的免疫调节特性,multilineage分化的能力(63年]。造成的变化和影响不同的冷冻保存方法,介质,冷冻保护剂,温度,低温贮藏期间相对良好定义的(64年),但并没有明确的信息在这个主题对msc的兽医。同行代理的选择是一个重要的方面。在目前的工作,我们选择了DMSO溶液的使用由于证据表明该代理保证更大的细胞冷冻保存后的异常和解冻循环。低温贮藏期间的作用机制是基于其穿透细胞,把水从他们的能力,从而防止胞内冰的形成和细胞破裂65年]。一些研究表明,DMSO具有致瘤的潜在接触细胞,但可能类似的其它冷冻保存剂效应尚未充分建立(66年,67年]。其他作品也表明DMSO 4°C以上可以成为细胞毒性(66年]。为了避免这种影响,在解冻阶段是确保没有完整的冰在融化cryovial,低温贮藏的解决方案是容易离心机,包含DMSO溶液的上层的消除。维护msc在低温贮藏期间也会影响他们的特点68年]。细胞用于这项工作不超过12个月的低温贮藏,因此它是不可能从更长的存储期预测可能的负面影响。程序使用描述协议执行的低温贮藏和解冻,没有具体的变化观察对细胞粘附在电镀后,细胞融合,在细胞通过细胞的数量和活力。

虽然有多种能力的几个物种和msc广泛建立的能力在不同的细分市场(11],tridifferentiation能力继续作为最低标准识别和描述这些干细胞/基质细胞(10]。在目前的研究中,建立具体的差异化协议后,OM-MSCs显示脂肪形成的能力,成骨,chondrogenic差异化的文化。分化成neuroglial-like血统的能力也是测试和确认,虽然还需要进一步的研究来确定神经源性分化的实际功效。OM-MSCs的早期转换成neuroglial-like血统后暴露于神经源性分化中也可以观察到,但重要的是要注意,简单的形态分化是不足以考虑神经源性分化的功能效果,还需要进一步的研究来确定这种效果。这些功能由其他研究关注OM-MSCs确认结果(15,26,28,29日,32,69年]。

rt - pcr可以量化19与OM-specific相关的基因的基因表达标记OM-MSCs和识别fold-expression段落之间的变化。纯度测定的分光光度法可以确定不同的起源没有污染的RNA样品用于获取互补。同样,融化曲线的研究和观察单个的峰值还允许确认下一个为每个基因扩增子的放大研究。19个基因的研究中,没有观察到3基因表达的两个段落:CD34、CD45和AdipoQ。没有CD34、CD45标记被认为是最低标准为msc(细胞的特征15]。CD34造血起源(不包括原始的缺失70年)和CD45的缺席不包括白细胞的起源(71年]。AdipoQ是一个脂肪形成的基因(72年]。考虑到前面提到的能力OM-MSCs脂肪形成的分化,这种基因的nonexpression是意想不到的。在P4和P6一些基因提出Ct < 29,丰富目标样本中核酸。msc CD90作为最低标准的分类(15),相关的细胞修复和细胞细胞相互作用现象(11]。预计其高基因表达,证实了其他研究OM-MSCs [26]。CD44是人类OM-MSCs用作分类一个特定的标志(73年),虽然动物细胞的分类并不总是认为这标志(11]。由于CD44是密切相关的细胞粘附现象(74年),其高表达在OM-MSCs也预期。AP-2基因与脂肪形成的差异化的能力(75年P6)也显示了很高的表达情况,虽然在P4价值较低。分别CD73和CD105与腺苷生产(76年)和血管止血现象(77年),也视为最低OM-MSCs分类标准。他们在这两个段落Ct值低于35岁,所以,他们的基因表达可以被认为是中等高。仍用Ct值低于35几种基因与特定的标记相关联的成骨的(Runx2 P6) (78年在P6], chondrogenic(科尔II, Aggrecan P6) (79年),脂肪形成的(在P4 AP-2) (75年在P6)和神经源性神经生长因子,GDNF在P4和P6) (80年,81年求同存异,确认能力tridifferentiation和中胚层分化潜力的线条,29日]。甚至更高的Ct值,其他指标tenogenic分化(Tenomodulin P4和P6) (82年P6]成骨分化(BSP) (83年)和musclogenic分化(肌间线蛋白在P4和P6) [84年]给出了相关的基因表达。更不规则的Ct值大于35 multipotency能力相关基因如NANOG Oct4 Sox2在两个段落。这些标记被认为是监管机构的msc的多能性85年),尽管一些研究令人们怀疑这些标记的影响在这个multipotentiality [86年]。这些也下调基因P6 P4相比,表明可能损失的多能细胞活动人口倾向更高的段落。相比之下,大多数在P6 differentiation-related基因上调,这也可能被解释成增加这些细胞特定的分化的倾向的间隔的最大OM-MSCs机能活动(P5-P8)成立。这表明这些细胞,尽管以更大的上调与多能性相关的基因在早期阶段,在通道6,现在更倾向于特定分化可能为临床应用这一理想的时刻。这些结果进行解释时应特别谨慎。最低标准用来描述人类msc也适用于动物源的msc,尽管一些研究已经表明,没有精确的并行性的表达这些表面标记29日,87年- - - - - -91年]。此外,还需要深入的研究来识别标记,可以认为是独特而明确的表征的兽医msc (92年]。然而,考虑到当前的知识,rt - pcr证实大鼠中的间充质来源的multidifferentiations OM-MSCs及其趋势。

OM-MSCs允许识别的细胞遗传学评价染色体稳定性、高的比例正常核型形成通道。然而,这个比例是低更高的段落。类似地,而在段落P5和P8细胞有丝分裂指数(即。,the number of cells in mitosis in relation to the total number of cells analyzed) is normal, for passage P11 it decreased. In all passages the cells were analyzed after reaching a confluence of 70–80%, a value that was observed more quickly in the lower passages. This means that in passage P11 a lower mitotic activity is observed for the same level of confluence. The lower mitotic index for passage P11 corroborates the results observed in the remaining tests, where some morphological alterations, poorer cellular vitality, a lower number of cells in the stationary phase and lower cell viability were observed for higher passages, indicative of senescence phenomena.

波形蛋白是广泛表达,高度保守的57-kD蛋白质构成类型III中间丝和由表达间充质细胞,观察在他们的发展很重要,完整性和维护(93年),在这些中间丝和修改可能导致形态和功能变化94年,95年]。波形蛋白通常是确定的表面和胞内丝msc和不同的组织,即OM (96年)和嗅觉感受器神经元继续表达这种标志与其他postmitotic神经元停止波形蛋白表达神经发展进展(97年]。被发现在老鼠OM-MSCs [45)并考虑其表达来源于神经嵴细胞(98年波形蛋白,因此可以用作MSC在OM标记。此外,c - kit iii型受体酪氨酸激酶能传感细胞信号事件绑定到其配体、干细胞因子,调节细胞增殖、分化、趋化性、粘附和细胞凋亡99年]。因此,它可以识别c - kit immunoexpression在间充质来源的细胞群One hundred.]和msc [101年,102年],这个标志也表达在胚胎嗅黏膜和嗅觉上皮细胞祖细胞,这是必要的维护导致嗅觉的神经上皮和神经发生(103年]。因此,波形蛋白和c - kit都可以被认为是有用的标记MSC识别OM,及其在当前检测OM-MSCs孤立的人口调查也证实了其组织发生进一步分类。大约5%的OM-MSCs彩色正面synaptophysin和强烈贴上GFAP > 80%。Synaptophysin抗原相关突触囊泡的神经内分泌组织,出现在老鼠的嗅觉系统在OM的嗅觉神经元(96年)和嗅球的肾小球104年]。GFAP是一种纤丝的蛋白胶质细胞的特征,其表达特点是细胞的神经系统105年]。GFAP已经确定在OM-MSCs [19),在msc受神经源性分化106年,107年]。MSC的自发表达神经标记的未分化状态已经显示为不同的细胞类型,并被一些作者作为证据的MSC倾向分化成神经源性线(108年]。阳性染色的未分化OM-MSCs synaptophysin和GFAP证据这些细胞对神经源性分化的倾向,也与神经源性分化协议所验证。重要的是要注意,一个更高比例的GFAP-labeled细胞被发现在OM-MSCs相比与其他未分化的msc,在相同的通道108年]。这可能是相关的利基OM-MSCs收集自OM自然是富含neuroregenerative活动,这可能会使这些细胞更多的神经源性分化倾向。CD31是内皮细胞粘附分子与内皮细胞和造血细胞有关,因此它没有表达OM-MSCs预计[109年]。AE1 / AE3细胞角蛋白与细胞骨架存在于几乎所有的上皮细胞和也有助于识别和区分上皮肿瘤(110年]。缺乏表达CD31和AE1 / AE3标记消除内皮和上皮性分别OM-MSCs。总之,免疫组织化学分析钢筋OM-MSCs的间叶细胞起源和证实这些细胞对神经分化的趋势。

msc的CM的物质从介质中提取的msc是培养和含有大量的可溶性细胞因子等因素,趋化因子、免疫调节分子和生长因子与潜在再生效应(111年,112年]。大部分的这些因素中发现MSC分泌派生检查参与组成分泌腺胞外展示特性和作用相同的那些MSC描述的自己,与细胞间通讯的过程、细胞信号传导、分化、细胞粘附,并包括元素,如额外的蛋白质和细胞内矩阵,炎症相关的细胞因子,趋化因子,血管生成因子113年]。MSC的proregenerative影响secretoma曾被观察到在一些组织和包括免疫系统的调制行为,抑制细胞死亡和纤维化,血管化的刺激,促进组织重建,和细胞招聘(114年]。在目前的研究中,一些生物标记研究及其浓度的CM 48 h后OM-MSCs调节测量。下的生物标志物研究分为免疫调节和免疫抑制因素(IFN -γ和肿瘤坏死因子-α),趋化因子(MCP-1),生长因子(VGEF)和白细胞介素(IL)。所有生物标记被确定在CM虽然不同浓度。这些生物标记物的相对较低的浓度应该不足为奇,并不影响其治疗效果在活的有机体内,因为这些因素的治疗浓度在交付系统一般躺在显著低范围(115年]。正-的浓度γ在CM相对较低,TNF -α值更高。在一个有机的层面上,这些因素的存在,以及传染性毒素的存在或缺氧环境,刺激激活msc和特定生长因子和趋化因子的产生116年]。事实上,干扰素-的结合γ和促炎细胞因子如TNF -α不仅刺激msc生产和分泌高水平的免疫抑制因子,趋化因子,还粘附分子表达和血管细胞粘附分子表达(117年]。细胞调节应用超过48小时似乎是足够的刺激因素的释放通常不是由msc如TNF -α和干扰素-γ,反过来刺激了OM-MSCs产生生长因子(VEGF)和趋化因子(MCP-1)。VEGF,除了其功能作为内皮生长因子,在msc在极端的生存中扮演重要角色的有机条件(118年,119年]。经历的环境条件在调节细胞也可能是一个重要的元素的生产和分泌VEGF等provasculogenic因素通过msc (120年]。MCP-1反过来作为一个强有力的化学引诱物,刺激了招聘和msc的增殖和成纤维细胞121年),检查参与组成分泌腺,它的存在已经被报道在其他OM-MSCs [113年]。综上所述,趋化因子和生长因子的生产OM-MSCs受到调节为主要的目标刺激细胞招聘、迁移和保证细胞增殖和生存在极端环境条件引起的调节过程。il - 6分泌msc和最初认为促炎作用。最近,其抑制作用在T细胞的活性和确定了控制炎症,因此执行免疫调节功能(122年,123年]。因此,il - 6具有免疫抑制作用,可能扮演重要的角色在避免有机拒绝在同种异体移植msc (124年]。生产这个白介素OM-MSCs可以安全的指标在使用这些细胞治疗的方式,因为它的免疫抑制效果,帮助避免了有机拒绝植入细胞。il - 4中扮演一个重要的抗炎作用,对肿瘤坏死因子的生产——有抑制作用α(125年),这或许可以解释这两个类似的浓度的因素。地震是一种促炎细胞因子诱导炎症和细胞死亡和被认为是抑制细胞增殖和细胞凋亡现象的影响(126年,127年]。尽管如此,一些研究显示这些白细胞介素的有利影响,例如,在抑制乳腺癌细胞在体外(128年和颅内神经胶质瘤129年),发挥抗肿瘤效应通过刺激自然杀伤细胞的活性,减少肿瘤发生,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成(130年]。不管的澄清效果,这在CM中白细胞介素的识别证据msc的参与免疫调节反应。意想不到的是相对高浓度的2厘米的OM-MSCs。msc可以控制的生产和分泌和- 2T细胞响应通过分泌il - 10 (- 2131年,132年]。可能引发的充满敌意的环境调节OM-MSCs超过48小时可能足以导致促炎反应和2的生产,这也解释了生产和分泌,虽然在较小程度上,其他的生物标记物,如肿瘤坏死因子-α干扰素-γ和地震。尽管一些研究已经进行了,似乎没有共识关于检查参与组成分泌腺的组件,必须找到MSC (133年),可以影响等方面分析用于获得厘米,msc的利基,调节时间,通道的数量的细胞用于获得它(134年]。由于OM-MSCs敏感的环境他们发现并改变分泌概要文件根据信号因素和周边环境,一些细胞内的文化的改变可以迅速触发和刺激邻近的细胞产生和分泌相同的因素,极大地改变了CM和检查参与组成分泌腺的问题(133年]。主要的免疫调节是炎性细胞因子(135年),生长因子作为补充的培养基(136年),也减少氧含量(137年]。

5。结论和进一步的方向

OM-MSCs最近成为再生医学的承诺,因为他们的边缘位置,使它们容易收集、分离,扩大在文化,因为他们的生物学特性已经建立。与方法应用于目前的工作可以建立一个协议隔离,培养,冻结,解冻OM-MSCs没有改变他们的形态和行为文化的特征。执行顺序,生物特征,允许确定一个正常核型,msc的多个基因特点和分化能力tridifferentiation和神经源性分化和特定的表面标记。的具备干细胞特征OM-MSCs也承认,允许建立这些细胞足够的治疗应用在未来的工作。

建立了细胞疗法作为治疗的承诺,但是不同的障碍相关的安全使用,标准化的流程和交付到受伤的组织细胞的机制促进增加关注msc分泌分泌因子的治疗效果。研究OM-MSCs的CM允许不同生物标记的识别和量化相关免疫调节能力,创建检查参与组成分泌腺的可能性使用在未来这些细胞再生疗法。

缩写

BSA:	牛血清白蛋白
菌落:	集落形成单位
CM:	条件培养基
CT:	文化的时间
Ct:	阈值周期
轻拍:	Diaminobenzidine
的边后卫:	胎牛血清
在这里:	热诱导抗原决定基检索
干扰素-γ:	干扰素-γ
IL:	白细胞介素
ISTC:	国际社会的细胞治疗
MCP-1:	单核细胞化学引诱物蛋白1
msc:	间充质干细胞/基质细胞
OM:	嗅觉粘膜
OM-MSCs:	嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞
PBS:	磷酸盐生理盐水
生产:	人口数量翻倍
PDT:	人口的两倍时间
码头:	蛋白水解诱导抗原决定基检索
中移动:	相对量化
rt - pcr:	逆转录酶聚合酶链反应
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
VGEF:	血管内皮生长因子
ISCT:	国际社会的细胞治疗。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者的请求。

的利益冲突

作者(年代)声明(s)没有关于这篇文章的出版的利益冲突。

确认

这项研究受到了下Operacional区域做北(ON.2 - O Novo北),QREN,菲德尔与项目“iBone疗法:Terapias inovadoras帕拉一个regeneracao ossea”,裁判。北- 01 - 0247 -菲德尔- 003262,并通过程序竞争——而危险Operacional Competitividade,项目PEst-OE / AGR / UI0211/2011和PEst-C /高速/ UI0285/2013 FCT的资助。本研究也支持下Operacional Competitividade e Internacionalizacao (P2020),底部Europeus Estruturais e银行(觉得)和FCT项目“BioMate——小说bio-manufacturing系统产生生物活性组织工程支架”,参照PTDC / EMS-SIS / 7032/2014和2020年竞争,从ANI - Projectos ID&T senior em Copromocao,而Operacionais POCI, insitu公司由项目”。生物量-改造生物制造系统通过使用可用性方法原位诊所临时植入制造”参考poci - 01 - 0247 -菲德尔- 017771。安娜丽塔Caseiro (SFRH / BD / 101174/2014)和瑞达马西奥铪锆石(SFRH / BD / 116118/2016)承认FCT,金融支持。

补充材料

表S1表示基因的列表根据与各自的扩增子上下文序列研究,整体基因ID和PCR产品长度。表S1 -列表研究各自的扩增子上下文下的基因序列,合奏基因ID和PCR产品长度。(补充材料)

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