阿司匹林降低成骨介质和Wnt信号转导诱导的成人主动脉瓣间质细胞矿化体外

抽象

在世界范围内，钙化性主动脉瓣膜病是发病率和死亡率的患者的心脏异常之间的主要原因之一。主动脉瓣矿化和钙化是成人主动脉瓣钙化疾病表现和功能不全的关键事件。由于重矿化和钙化，成人主动脉瓣尖表现出杂乱无章和与严重受损成年阀功能钙化结节沉积分散分层伴随。有趣的是，共享基因调控途径的骨形成细胞和心脏瓣膜细胞之间的开发过程中确定的。阿司匹林，a small leucine-rich proteoglycan (43 kDa), acts to inhibit mineralization in periodontal ligament cells and is also detected in normal murine adult aortic valve leaflets with unknown function. Therefore, to understand the Asporin function in aortic cusp mineralization and calcification, adult avian aortic valvular interstitial cell culture system is established and osteogenesis has been induced in these cells successfully. Upon induction of osteogenesis, reduced expression of阿司匹林mRNA和骨和骨生成标记物的表达增加被检测相比保持而不成骨诱导细胞。重要的是，人重组蛋白Asporin处理减少在成骨矿化水平介质诱导的主动脉瓣间质细胞与伴随的Wnt的水平降低/ββ-连环蛋白信号。总体而言，所有的这些数据是高度指示阿司匹林可能是一个新的生物分子靶点治疗钙化主动脉瓣疾病的病人目前尖头置换手术。

1.简介

心脏疾病常与成人主动脉瓣尖部结构和功能不全有关[1，2]. 这些主要特征是主动脉瓣矿化，随后钙化和随后的功能障碍，严重的发病率和死亡率[3，4]。据世界卫生组织估计，2017年有1790万人(31%)死于不同的心血管疾病。钙化主动脉瓣疾病(CAVD)的患病率约占所有心血管疾病的5-25%。大量的研究工作都是为了更好地理解CAVD机制。CAVD预计约占全球人口的13%，并将继续成为一个严重的全球健康问题。在65岁以上的人群中，约有25%的人患CAVD的风险增加。人类CAVD的特点是由于遗传和各种环境因素导致主动脉瓣尖处钙盐的积累，严重损害了主动脉瓣的功能[五-7]。

在瓣膜形成过程中，胚心内膜流出道内皮细胞(OFT)分化，在成人心脏中形成成熟的、成层的、三层的主动脉瓣尖[8]。在这一发育过程中，心内膜垫的高度增殖、迁移和未分化的细胞产生具有层状细胞外基质(ECM)的成熟主动脉瓣[9，10个]。成熟的瓣膜小叶分层为富含弹性的心房/心室肌、富含蛋白聚糖的海绵体和高度组织的富含胶原纤维的纤维组织[五]。CAVD主要与纤维组织中这三层结构和ECM成分的完全紊乱和无组织有关。有报道称，与骨和软骨发育相关的基因表达也在CAVD患者中升高[11个]。以前的报告建议发展心脏瓣膜和骨形成细胞[之间共享基因调节途径的存在德意志北方银行]。瓣膜细胞是两个异构类型，即瓣膜内皮细胞（血管内皮细胞）和瓣膜间质细胞（的VIC）的13个]。这些VICs有潜力分化成成骨前细胞在几个病理线索相对未知的机制。

阿斯波林，也被称为牙周韧带相关蛋白1 (PLAP1)，是ECM蛋白的一个小的富含亮氨酸的蛋白多糖(SLRP)家族的成员[14个，15个]。此前，据报道，阿司匹林在小鼠和人体组织中表达，包括骨关节炎关节软骨、主动脉、子宫、心脏和肝脏[德意志北方银行，15个-17岁]。此外，最近的报告显示出的强劲表现阿司匹林mRNA在成年小鼠主动脉瓣叶，尽管没有任何功能的相关性[德意志北方银行]。它通过与Bmp受体竞争性结合，抑制骨形态发生蛋白2 (BMP2)-Smad/1/5/8信号通路，在负调控骨细胞钙化过程中发挥重要作用，导致牙周细胞钙化水平降低[十六]。的Wnt /β-连环蛋白信号在胚胎发育包括心脏和骨骼形成中有多种多样的作用。重要的是，据报道Wnt的表达/ββ-连环蛋白途径特异性基因CAVD期间增加，并促进成骨[18岁]。主动脉瓣矿化Asporin依赖性调节与procalcific的Wnt的伴随表达/β-catenin信号在此之前并没有得到很好的研究，尤其是在成人钙化主动脉瓣疾病或CAVD的病例中。因此，对两者之间的调节机制进行研究阿司匹林和Wnt /β在瓣膜矿化过程β-连环蛋白信号可能是值得的CAVD治疗的范围探索。

在本研究中，我们首次证实了在体外培养的成体成骨主动脉瓣间质细胞(AVICs)中，asporin介导的矿化水平抑制作用。此外，我们的数据也表明，在体外培养的具有诱导成骨作用的AVICs中，Asporin在矿化和钙化促进通路上游发挥作用。

2。材料和方法

2.1条。鸟类心脏标本

指定胚胎时间点的受精鸡胚从当地政府注册的孵化场（国家家禽养殖场、托利冈日、加尔各答、西孟加拉邦）获得，成年鸡心从当地屠宰场获得。使用的特定鸟类品种是泰和鸡（罗得岛红黑色南方古猿）[19个]。重要的是，不需要动物伦理/使用批准，因为在总统大学没有动物用于繁殖目的。尽管所有受精卵和成人心脏的采购都是按照美国总统大学的采购指南进行的。

2.2。RNA分离和逆转录PCR

分别从10-12个胚胎日5.0 (E5)软垫组织、成年心室组织、5-6个成年主动脉尖的解剖组织和汇集组织中提取总RNAμl Trizol (Invitrogen公司，15596026)。然后2μ总RNA经Bio-Rad试剂盒反转录合成cDNA™ 逆转录超模，170-884），20 μl根据制造商提供的协议计算总容量。总RNA也从瓣膜间质细胞(VIC)培养物中分离得到μl三唑。然后合成cDNA，取1 μ通过反转录超模获得的RNA的g。20 进行RT-PCR检测μl总容积采用DNA Taq聚合酶(Bioline, BIOTAQ DNA polymerase BIO-21040)测定。使用表中提到的20 pmol引物对(IDT)进行了35个周期的PCR1. 对于每一个引物集的标准化和优化，为了检测最佳退火温度，我们进行了梯度PCR反应，如补充图所示一世。

2.3。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析

定量实时PCR（QRT-PCR）用于定量测定来验证基因表达的变化。三个必需基因引物，在这里，我们也证明了底漆效率（阿司匹林，β-catenin的和纤连蛋白），在我们的数据分析中广泛使用。我们奉行的准则Qiagen公司来推导“效率和坡”反对基因目标的引物对[中20个]. 为了合成cDNA，我们取了1 μg的模板RNA。然后互补脱氧核糖核酸和核酸酶连续稀释自由水如下:1:1,1:10,1:1:1000年,100年和1:10000。然后，根据cDNA稀释和Cq值(补充图)的对数绘制标准曲线二). 从标准曲线，坡度( ）计算和效率由下式确定： 。

10 进行定量实时PCRμ根据预先统一协议使用Bio-Rad公司的实时PCR试剂盒（SSO快速伊娃绿色超混，172-52 03AP）总体积的升[19个]。基因表达水平通过从归一化到Bio-Rad公司CFX管理器软件获得的CQ值来确定β-肌动蛋白表达。每个定量RT-PCR结果代表了生物学和技术上一式三份（ )。用于培养禽类瓣膜间质细胞（AVICs），分析基因表达增加或减少从计算出的倍数变化实验值CQ产生Cq和Cq.公司。统计显著性由学生的 -试验和考虑显著 值。

2.4。成年鸡主动脉瓣间质细胞(AVIC)培养及成骨诱导

从成年鸡心脏主动脉瓣尖部建立了原发性主动脉瓣间质细胞(AVICs)。这些细胞按照标准程序被分离出来，并在胶原涂层板和腔室载玻片上培养，如之前其他人所述[9]。简单地说，从主动脉基底区找到成人瓣膜小叶，并根据需要使用细钳和剪刀将其分离。后来，在棉签的帮助下，上层VECs层从解剖的尖头中被刮出。然后，用含M199培养基(Invitrogen, 11150-059)的胶原酶II (Sigma 234153)，加1%青霉素/链霉素(penp - strepcin)鸡尾酒(Invitrogen, 15140122) 37℃处理尖牙，  mins in a shaking water bath [9]。Pooled supernatants from 7-8 valves were centrifuged at 800 rpm for 5 mins and the pellet was resuspended in 3 ml complete M199 culture medium which contains M199 medium +10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% Pen-Strep. Then the final cell suspension was sieved through nylon mesh (local made) and plated onto 0.01% collagen- (Collagen I rat tail-, 3 mg/ml, A10483-01) coated plates containing complete M199 media followed by 2-5 days of culture. After establishing, AVIC explant cultures without any contaminations were used further to perform all the experiments.

为了研究成骨基因的诱导作用，用含有完整M199培养基的成骨培养基处理培养细胞，β-glycerophosphate (10 mM), L-ascorbic acid (10 nM), and dexamethasone (0.1 μM）如前[描述9]。The osteogenic (OS) induction media was added after 3 days of VICs in culture and kept in treatment for a maximum of 4 days (96 hrs) in healthy condition.

2.5。在成年禽瓣膜间质细胞(AVICs)的培养中，激活剂和抑制剂的测定

To supplement the Asporin protein in AVICs in culture, the cells were treated directly with the recombinant human Asporin protein (150 ng/ml; Abcam 132382) for 24 hrs in the presence of OS induction media for 4 days. For canonical Wnt signaling pathway manipulation, cultured cells were treated with the recombinant human Wnt3A (rhWnt3A) protein (150 ng/ml; Abcam ab81484) for 24 hrs to activate Wnt signaling, performing activation assay. Similarly, cultured cells were treated with Xav939, also for 24 hrs (2 μM、 Abcam ab120897）用于Wnt信号抑制试验[19个，21岁]。所有处理完成后，实验进行总RNA分离定量mRNA表达分析或用于免疫染色细胞固定进行。此外，定性和定量的茜素红染色，进行比较处理的细胞与未处理的对照的矿化（ )。

2.6。免疫染色

用1%多聚甲醛固定培养3分钟，4%多聚甲醛固定培养10分钟(Affymetrix, 19943)，用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)和PBST溶液(PBS+0.01% tween 20)洗涤。然后按照抗体厂家提供的方案进行免疫染色。用于免疫荧光(IF)的抗体有:抗asporin(1:50 00稀释，Abcam ab154404)和anti-α-Sma (1 : 400 dilution, Thermo Fisher Scientific, 14-9760-82). A rabbit polyclonal secondary antibody (Goat anti-Rabbit IgG H&L, Alexafluor 488, ab150077) was applied against Asporin primary antibodies. All primary antibody incubations were made overnight at 4°C. All cell nuclei were stained with DAPI (SRL, 18668). As negative controls, cultured AVICs were incubated with only the secondary antibody, but with no primary antibody incubation.

2.7。蛋白分离和Western Blotting

使用含有蛋白酶抑制剂混合物(Genetix GX2811AR)和磷酸酶抑制剂混合物(Genetix GX0211AR)的冰冷RIPA裂解缓冲液(250 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 0.1% SDS, 1% Triton X，和5 mM EDTA)从VICs中分离蛋白裂解物。Western blots如前所述(Evans-Anderson et al.， 2008)，用二抗孵育膜(1:4000;Abcam ab97051)。免疫印迹采用化学荧光检测，使用Clarity Western ECL底物试剂(Bio-Rad 1705060)，并用ChemiDoc MP (Bio-Rad)扫描。用ImageJ软件(NIH)量化信号强度。阿斯波林的稀释度是2。5μ克/毫升（Abcam公司，ab58741）。GAPDH (1 : 2000; BioBharati, BB-AB0060) antibody reactivity was used as a loading control. Statistical significance was determined by Student’s -测试（ )。

2.8条。亮场与荧光显微镜

所有的光显微图像，使用倒置显微镜和相机附接（尼康SMZ800）截取。在培养AVICs也正在在明视场使用倒置显微镜（Zeiss）成像。对于免疫染色载玻片，使用显微镜（Zeiss实验室，流感显微镜，和Leica荧光显微镜）检测荧光和图像使用蔡司软件捕获：ISC捕获和Leica软件，LAS X.

2.9。茜素红S染色

For Alizarin Red S staining, the cells were washed with 1X cold phosphate buffer saline (PBS) and fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 45 mins at 4°C. For qualitative staining, 2% Alizarin Red S (Sigma) solution was used, and for quantitative analyses, 40 mM Alizarin Red S solution was prepared [五]。After cell fixation, the cells were stained with freshly prepared 2% Alizarin for 30 mins. Then cell plates were washed with distilled water (dH₂O) 2-3次，每次2分钟，风干。数字亮场图像是用LAS X软件(徕卡)拍摄的。

On the other hand, fixed cells were stained with freshly prepared 40 mM Alizarin Red S for 30-40 mins with gentle shaking at room temperature. For quantitative assay, 800 μl of 10% acetic acid (for 60 mm cell plates each) was used to incubate the fixed cells at room temperature for 30 mins. Then, the cell suspensions were collected using a cell scraper into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Then these samples were vortexed for 30 seconds followed by heating at 85°C for 10 mins. After that, the samples were carried out for centrifugation at 20000 g for 20 mins. Then, 500 μ在新的试管中收集每种上清液l，200 μ10％氢氧化铵的升加入到每个管中以中和酸。pH值内测量4.1至4.5。最后，将制备的样品溶液在96个孔板等分（150 μ各升）的吸光度。取OD值用于控制和使用Gene5软件（BioTek的，酶标仪）OS-诱导的样品。那么最终的量的差别是由学生的计算 -试验和考虑显著 值，其中 [二十二]。

2.10。考马斯亮蓝染色

可视化和捕捉培养物中分离成年禽阀间质细胞（AVICs）的形态，将细胞用考马斯亮蓝之后培养4天染色。The cultured cells were washed once with 1X PBS and incubated with the Coomassie brilliant blue solution for 30-40 mins. Next, the Coomassie blue stain was removed by washing with dH₂O代表2-3次，风干成像之前。然后，明场图像进行使用倒置显微镜（Zeiss）拍摄。

2.11。统计分析

为了得到qRT-PCR数据中基因表达的所有倍性变化，我们使用周期阈值（CT）值对所有独立实验的生物和技术复制进行了三倍性的规范化表达分析。我们申请了学生的 -试验中，特别是（双面）双尾，观察其统计学显着性（ )。

接下来，对于Asporin免疫染色实验，取所有计数值，在生成每组实验的百分比后，绘制图表。总的来说，所有的统计分析都是以学生的 -测试（ )。

也用于茜素定量测定，OD（光密度）值被认为是茜素红的吸光度染色用于统计分析细胞溶液。这里还，我们已申请学生 -测试并审议了变化倍数为显著 值。

2.12。细胞活力测定

细胞生存力通过计数DAPI染色细胞核测定用重组Asporin蛋白（rhAsp）后处理。对于这一点，我们已经计数活细胞（DAPI阳性细胞）由下式的百分比： 。

3.结果

3.1。成年禽瓣膜间质细胞(AVICs)的建立及标记基因表达分析

几个以前的报告中已经确定的是，培养的主动脉瓣间质细胞（AVICs）经历导致AVICs矿化和随后钙化[成骨细胞分化3，7，23个]. 采集成年鸟类心脏标本，从每个标本中分离出3个主动脉瓣尖。下一个AVICs是从主动脉夹层三尖分离培养出来的。明亮的视野图像显示主动脉底部有三个薄而清晰的尖点（图中箭头图1（a）)。如在方法部分中提到继标准化协议，主AVICs培养已经成功建立。Cells have started to grow and show distinct, clear filamentous morphology after 48-72 hrs of seeding. The bright-field microscopic image has shown AVICs with well-defined spindle-shaped morphology (arrowheads in Figure图1（b）). 接下来，考马斯亮蓝染色进一步显示了在高倍镜下中航工业的更明显的形态（箭头如图所示图1（c）). 为了进一步鉴定分离的禽流感病毒，我们对其进行了免疫染色αα-SMA抗体，已知的VIC标记，以及强烈的表达已经被检测为示出在图1（d）-一（f）（箭头）。在培养4-5天，健康AVICs已被用于进一步的性实验。

选择性标记基因的表达已经被证实是有效的。数字1（克）与用于AVICs分离的成年禽类心脏的左心室组织相比，在培养中从AVICs分离出的标记基因在mRNA水平上表达。我们对avic特异性标志物进行了基因表达分析(纤连蛋白和SM22α),阿司匹林作为我们感兴趣的分子以及心肌细胞(CM)特异性标记物(MYH7和GATA4）通过在分离AVICs和心室（VEN）从成年禽的心组织逆转录酶PCR（RT-PCR）（图1（克）)。在这两种，1 μ总RNA g作为模板合成特异性cDNAs，用于逆转录酶PCR分析。中航工业两个标记(纤连蛋白和SM22α相比VEN组织）已经显示出AVICs增加的表达。而且，显著表达阿司匹林与VEN相比，AVICs中检测到mRNA。相比之下，cm特异性标记的表达（MYH7和Gata4)在相比所述AVICs VEN组织增加。此外，补充III（逆转录PCR）数据也表明的较高表达阿司匹林在成人主动脉牙尖组织相比胚胎流出道垫（OFT）组织（在发育中的胚胎和主动脉肺动脉瓣的前体结构）。因此，所有这些特征和基因表达数据表明成功地建立在培养初级禽流成人AVICs的。

3.2。成骨诱导在AVICs的培养

成功建立AVICs后并诱导成骨体外AVICs采用成骨诱导培养基(osteogenic (OS) induction media)治疗96 h。完整培养基补充OS诱导成分(β-glycerophosphate (10 mM), L-ascorbic acid (10 nM), and dexamethasone (0.1 μM））如其他人之前的描述[9]。对照和OS处理的健康AVICs培养物的明视场图像示于图图2（a）和图2（b）（箭头）。接着，如预期的，RT-PCR数据表明，几种标记物特异性的成骨基因（骨桥蛋白，Runx2，ALP，Msx2和Osterix的）表达式已在OS治疗被显著上调与未处理的对照AVICs（图图2（c）)。

同样地，与RT-PCR数据一致，的mRNA水平的表达骨桥蛋白，Runx2，ALP，Msx2和Osterix的基因已显示出增加3.65，2.68，0.4，2.68，和17.12倍，分别通过定量实时PCR（QRT-PCR）分析测定在未处理的对照相比OS处理AVICs（图图2（d），I-V）。总体而言，这些数据已经证实，成骨诱导OS媒体导致的AVICs几成骨标志物表达增加。因此，这些数据表明，在文化成人AVICs成功的成骨诱导。

3.3。在成骨诱导减少的内源性Asporin表达的培养AVICs

在成功建立成骨细胞并在培养中诱导成骨后阿司匹林mRNA的表达进行了分析用1 RT-PCR数据 μg的总RNA模板，用于合成cDNA。此外，还分析了天门冬氨酸蛋白在对照和os处理的AVICs中的表达。有趣的是阿司匹林mRNA在OS诱导AVICs检测相比如通过RT-PCR数据和qRT-PCR测定进行未处理的对照。在图3（甲）， RT-PCR数据表明阿司匹林根据核酸琼脂糖凝胶带强度，OS处理的AVICs表达明显低于对照组。同样，与逆转录聚合酶链反应数据一致，阿司匹林mRNA的表达是由0.62倍相比，未处理的对照OS处理AVICs降低（图3（甲）(二)。

此外，在蛋白质水平，Asporin已经发现，也减少了在与对照组相比AVICs OS处理AVICs。在图3（b）western blot数据显示Asporin下调了0.67倍( ）与对照蛋白相比，经OS处理的AVICs。

进一步验证成骨诱导及两者的效果阿司匹林mRNA和蛋白表达，OS处理AVICs免疫染色与Asporin-（Asp-的）特异性抗体。与mRNA表达数据一致，降低（ASP Asporin阳性的数⁺)细胞(图中箭头3（c），I）在操作系统处理的AVIC中检测到，与未处理的对照AVIC（图中箭头）相比3（c）(二)。定量细胞计数数据还揭示了在周围Asporin标记的细胞12.65％的减少在OS处理AVICs与未处理对照相比，分别为（图3（d）). 至少500 DAPI⁺核中的每个组实验中被计数（ )。

总的来说，这些数据表明，内源性的成骨诱导减少阿司匹林AVICs在培养中的mRNA和蛋白水平的表达。

3.4。在诱导后AVICs标记基因表达分析与骨肉（OS）媒体

接下来，控制和操作系统处理的AVICs都已采取，并已确定额外的选择性标记基因表达。几种细胞外基质(ECM)和Wnt/的表达β到成骨诱导敏感特异性途径β-联蛋白信号的基因是通过qRT-PCR分析确定。表达Col1a1系列，一个ECM标记，已经显著由0.97倍OS处理的下调，与对照相比，AVICs（图4(一)(I).肌成纤维细胞标记物，SM22α增加17.25倍OS处理的，与对照相比，AVICs（图4(一)，II）。另一个发动机控制模块标记，纤连蛋白，已经通过8.51倍的上调（图4(一)， III)，中间灯丝标记物，波形蛋白，减少了0.83倍（图4(一)，IV），细胞粘附标记N-钙粘蛋白与对照AVICs相比，os处理组增加了4.42倍(图4(一)，五）。两种基质金属蛋白酶（MMPs）Adamts5和Adamts9增加了0.23倍（图4(一)(VI)，下降了0.62倍(图1)4(一)， VII)，分别为经操作系统处理的AVICs和在培养条件下的对照组AVICs。有趣的是，胶原蛋白(Col1a1系列）和瓣膜间质细胞标记物（波形蛋白)也显示了诱导成骨的活化细胞表型。此外，我们还检测到增加（3.36倍）（图4(一)，VIII）表达PiT2的mRNA，指示与对照相比，OS诱导的细胞内AVICs磷酸盐水平的。但我们无法检测的表达PiT1成绩单在培养我们的操作系统引起的AVICs。总体而言，负责的病理重塑几个ECM基因已经显著朝着成骨诱导培养AVICs矿化和钙化表型改变。

此外，在操作系统中培养并与先前报告一致的禽流感病毒[9]，涉及基因/蛋白的Wnt中/β-连环蛋白信号包括但不限于β-catenin的，的Wnt3a和DKK1与未治疗的对照组相比，mRNA的表达发生了改变。在经os处理的AVICs中，qRT-PCR数据显示其表达增加β-catenin的和的Wnt3amRNA(分别为1.44倍和4.73倍)表达降低DKK1mRNA（0.27倍），与未经治疗的对照组相比（图4 (b)，一至三）。

此外，BMP/Smad信号和Notch/Sox9信号特异性基因标记也在对照组和OS处理的AVICs中进行了比较（补充图四)。这里，BMP2增加了0.07倍，已化Smad1倍减少0.15，Smad5的和Smad8在OS处理AVICs分别增加7.51和6.11倍相比，未经处理的对照细胞，。同样的,Notch1的mRNA表达量增加1.62倍Sox9mRNA的已OS处理的相比，在培养未处理AVICs减少0.67倍。因此，其他信号通路的基因，参与瓣膜成骨，也得到显著在OS感应上AVICs改变（补充图四)。

有趣的是，先前的报告表明，Sox9的通过阻断的成骨分化[指示软骨细胞分化24个，25个]。在这里，我们发现，Sox9在AVICs成骨诱导后表达降低。相比之下，我们还表明（图2）Runx2在os诱导的AVICs中mRNA表达增加，表明Runx2参与了成骨过程。综上所述，其他人和我们的数据可能表明，这两个转录因子之间的平衡对于AVICs中的成骨诱导是重要的体外。

总体而言，所有的这些数据显示的几个AVICs标记，ECM基因，和多个信号通路到OS诱导在培养AVICs包括Wnt信号敏感改变的表达/ββ-连环蛋白信号。

所有显示对照和os诱导的AVICs之间变化的基因表达分析结果都被表示为表中的列表2。

3.5。Asporin的表达减少矿化对成骨细胞培养基维护AVICs

下一步，为了确定Asporin蛋白对AVICs矿化的影响，还用Asporin重组蛋白（rhAsp，150 ng/ml）处理OS诱导的细胞24 小时，通过茜素红S染色评估定性和定量矿化。用免疫染色法检测阿司匹林蛋白的定位，比较OS-和OS+rhAsp处理的AVICs在培养液中的表达。同时，为了确认rhAsp处理后标记基因表达的变化，我们进行了qRT-PCR。用OS诱导培养基处理3天的AVICs，通过茜素红S染色显示矿化增加（图五(a)、nI-nIII的箭头)。有趣的是，与此操作系统控制单元相比，如图所示五（a） ，图中观察到矿化程度降低五(b)经rhAsp治疗后的nI-nIII箭头。接下来，利用图中茜素定量分析进一步证实了该数据五（c） 是的。这些定量数据表明，与没有任何rhAsp的OS对照组（0.064）相比，茜素染色的rhAsp处理的AVICs的吸光度（OD）（0.089）降低。接下来，数字五（d） 以及五（e）中已显示Asporin-（Asp-的）OS控制和rhAsp处理AVICs之间正AVICs的差异。正如预期的那样，它示出了在rhAsp处理的细胞中增加Asporin阳性AVICs的数（图五(e)与单独操作系统控制相比(图)五（d））。这是通过分析和定量增加的百分比在OS + rhAsp Asporin阳性AVICs相比，只有OS控制的（1.75％）进一步验证（图五（F））。

此外，相关的基因制作者的mRNA的表达水平还评价在OS控制和rhAsp处理AVICs通过qRT-PCR（图五（克），I-VI）。这些数据检测阿司匹林mRNA的已0.9倍被显著上调;两者成骨基因标记（骨桥蛋白和Runx2）已经倍，分别下降了0.29倍和0.79，相比于仅OS控制rhAsp处理AVICs。此外，Wnt信号的正调节物（β-catenin的，的Wnt3a)在仅用rhaspv处理的AVICs中，与OS对照组相比，两者分别降低了0.55倍和0.8倍。相反，表达DKK1，Wnt信号传导的负调节剂，已在倍相比，只有OS控制rhAsp处理AVICs增加0.3。因此，所有这些数据清楚地表明，Asporin显著抑制瓣膜矿化OS诱导培养基诱导。

此外，以确定对AVICs生存能力rhAsp蛋白的作用，细胞生存力测定已被执行。同样的,we have used three concentrations (100 ng/ml, 150 ng/ml, and 200 ng/ml) of rhAsp protein in a dose-dependent manner in AVICs in culture and as shown by the Supplementary figureV。这一数据显示，分别有88%、81.21%、93.81%和76.7%的活细胞在对照组、100 ng/ml-、150 ng/ml-和200 ng/ml处理的AVICs中被观察到(补充图)副驾驶). 在所有测试浓度的rhAsp蛋白中，没有观察到鸟类存活率的统计意义（补充图V E)。DAPI阳性核的总数量已经计数每个组中具有最小的每组500米的细胞核（ )。

总之，这些数据有力地表明，重组Asporin蛋白显著降低了维持在OS诱导培养基中的成年鸟类的矿化水平体外。

基因表达分析的所有的结果，是表示OS控制和OS + rhAsp处理AVICs之间的变化，被表示为表的列表3。

3.6。重组人Asporin蛋白抑制AVICs矿化诱导成骨媒体和Wnt信号激活

下一步，为了确定重组Asporin蛋白对维持OS诱导培养基和Wnt信号水平的AVIC矿化的影响，除OS诱导外，还进一步用Wnt3a重组蛋白（rhWnt3a，150 ng/ml，24 hrs）激活Wnt信号。令我们惊讶的是，重组蛋白（rhAsp，150 ng/ml，24 hrs）抑制了添加OS+rhWnt3a的AVIC的矿化，而仅在OS+rhWnt3a中维持。同样，数字6（甲）-6（c）显示了茜素染色成骨培养基诱导的AVICs（OS）培养6天，然后用rhWnt3a或rhWnt3a+rhAsp治疗24小时。已探测到矿化的基底水平，并在图中定性标记6（甲）（箭头）。单独使用本OS诱导相比，矿化水平的增加已经在图OS + rhWnt3a处理AVICs（箭头检测6（b）). 有趣的是，当OS+rhWnt3a-AVICs被rhAsp进一步处理时，矿化水平降低，这一点可以通过茜素活性的降低来证明（图中箭头所示6（c）)。这些定性数据由图定量测定进一步证实6（天）。在OS+ rhwnt3a处理的AVICs中，茜素浓度(0.160)的吸光度(OD)高于单独的OS诱导(0.093)。有趣的是，当OS+ rhwnt3a处理的AVICs再用rhAsp蛋白处理时，发现茜素的吸光度(OD)降低(0.065)。总的来说，Asporin蛋白的加入抑制了茜素红S染色检测到的OS介质诱导的AVICs矿化，无论是定性还是定量。

接着，为了确定参与成骨和Wnt指示基因的mRNA表达水平/β使用qRT-PCR检测OS-、OS+rhWnt3a-和OS+rhWnt3a+ rhasp处理的AVICs中的-catenin信号通路(包括Asporin)6（e），一至六）。阿司匹林rhWnt3a处理组和rhWnt3a+rhAsp处理OS诱导的AVICs组的mRNA表达均显著下调。与对照组相比，rhWnt3a治疗的AVIC下降了0.73倍，与rhWnt3a治疗的AVIC相比，rhWnt3a+rhAsp治疗的OS诱导的AVIC再次增加了3.43倍。同样，成骨标志物的表达，骨桥蛋白和Runx2，在rhWnt3a处理组和rhWnt3a+ rhasp处理的os诱导的AVICs中均有升高。骨桥蛋白在rhWnt3a+ rhpa处理的OS诱导的AVICs中，mRNA的表达比仅在rhWnt3a处理的AVICs中增加了1.44倍，比仅在rhWnt3a处理的AVICs中减少了0.07倍。同样的,Runx2倍相比OS控制rhWnt3A处理的mRNA的表达增加了0.89和在rhWnt3a + rhAsp OS AVICs倍减少1.23相比，只有rhWnt3A处理AVICs。Wnt信号通路调节，β-catenin的和的Wnt3amRNA的表达，已经在OS诱导AVICs两种治疗也已确定。β-CateninmRNA的倍相比OS控制rhWnt3a处理增加了2.2和在rhWnt3a + rhAsp处理的OS诱导AVICs倍减少0.33相比，只有rhWnt3a处理AVICs。同样的，的Wnt3A与OS对照组相比，rhWnt3A治疗组增加了1.73倍，与单纯rhWnt3A治疗组相比，rhWnt3A+rhAsp治疗OS诱导的AVIC减少了0.26倍。相反，Wnt信号负调节因子的mRNA表达，DKK1与OS对照组相比，rhWnt3a治疗组下降了0.71倍，与仅rhWnt3a治疗组相比，rhWnt3a+rhAsp治疗OS诱导的AVIC增加了1.44倍。因此，这些基因表达数据与经或不经处理的OS诱导的AVICs的矿化状态一致。

总之，所有这些数据有力地表明，在与Wnt的mRNA水平增加沿着文化OS诱导AVICs重组Asporin蛋白抑制矿化/β-连环蛋白信号特异性基因表达。

基因表达的所有分析的结果示出了OS控制，OS + rhWnt3a-之间的变化，以及OS + rhWnt3a + rhAsp处理AVICs被表示为表的列表4。

3.7。抑制Wnt信号不能挽救os诱导的AVICs矿化体外

接着，以确定是否Wnt信号是足以诱导培养AVICs矿化，OS诱导AVICs已经与Wnt信号转导抑制剂XAV939处理（2 μM) to inhibit Wnt signaling and also treated with recombinant human Asporin protein (rhAsp, 150 ng/ml) was used for treatment for 24 hrs in both cases. Assessments of qualitative and quantitative mineralization have been performed by Alizarin Red S staining of OS-induced and treated AVICs. The mRNA expression levels of several gene markers have been analyzed for Xav939 (Wnt signaling inhibitor) and Xav939+rhAsp-treated OS-induced AVICs by qRT-PCR assays. Figures7(一)-7 (c)show Alizarin-stained OS-induced AVICs maintained for 6 days in culture followed by 24 hr treatment of either Xav939 or Xav939+rhAsp protein. Basal levels of mineralization have been detected and marked qualitatively by arrowheads in Figure7(一)。有趣的是，在不变矿化状态检测XAV939处理的OS诱导AVICs（图箭头7 (b)），相比于单独的OS感应图7(一)指示促进与处理XAV939 OS诱导AVICs矿化其它活性信号传导途径（一个或多个）的存在。但是，如所预期，治疗rhAsp抑制矿化在XAV939处理的OS诱导AVICs（图箭头7 (c)）相比XAV939单独治疗（图箭头7 (b))。此外，图中还通过定量实验进一步验证了由茜素染色的AVICs强度产生的吸光度(OD)数据图7（d）. 与定性数据一致，OS诱导的AVICs和Xav939诱导的AVICs的茜素吸收率分别为0.089和0.88（ODs）。但在Xav939-和rhAsp处理的OS诱导的AVICs中，它进一步降低到0.68（OD），表明矿化水平降低。

接下来，为了确定单独诱导OS时的基因表达变化，Xav939处理OS诱导和Xav939+ rhasp处理OS诱导的AVICs，进行了qRT-PCR分析(图)图7（e），一至六）。与矿化数据一致，阿司匹林在Xav939处理的os诱导的AVICs中，mRNA的表达没有变化，但在Xav939+ rhasp处理的os诱导的AVICs中显著上调。同样的,阿司匹林与Xav939处理的os诱导的AVICs相比，Xav939+ rhsp处理的os诱导的AVICs的mRNA增加了1.71倍。此外，成骨标志物的表达(骨桥蛋白和Runx2)在Xav939处理的os诱导的AVICs中没有变化，但在Xav939+ rhasp处理的os诱导的AVICs中显著下调。骨桥蛋白和Runx2mRNA的已折叠在XAV939 + rhAsp OS诱导AVICs，分别下降了0.28倍和0.35，相比于仅XAV939处理的OS诱导AVICs。此外，Wnt信号通路的基因正调节，β-catenin的和的Wnt3AmRNA的表达，也被分析，两治疗组相比，只有OS诱导AVICs。表达β-catenin的mRNA表达相比OS控制和倍XAV939 + rhAsp处理的OS诱导AVICs减少0.27相比，只有XAV939处理的OS诱导AVICs XAV939处理AVICs减少了0.78倍。类似地，表达的Wnt3A与OS对照组相比，Xav939处理的AVICs的mRNA减少了0.05倍，与仅Xav939处理的OS诱导的AVICs相比，Xav939+rhAsp处理的OS诱导的AVICs的mRNA减少了0.65倍。相反，Wnt信号通路基因的负调节因子，DKK1与对照组相比，Xav939处理的OS诱导的AVICs的表达增加了0.18倍，Xav939+ rhasp处理的OS诱导的AVICs的表达增加了3.09倍，而Xav939处理的OS诱导的AVICs仅比Xav939处理的OS诱导的AVICs多。

因此，OS诱导的AVICs中存在矿化，Wnt水平降低/β-连环蛋白信号进一步表明了其他与中航工业矿化有关的活性途径的存在。但是，令我们惊讶的是，在Xav939处理的OS诱导的AVICs中，rhAsp对矿化的抑制作用表明Asporin的潜在功能独立于抑制AVICs矿化的多种成骨促进信号通路体外。

总之，所有这些数据有力地表明Asporin抑制矿化可能会充当多种骨在mRNA水平，包括Wnt信号通路诱导基因的上游/β-文化中AVICs中的-catenin信号。

所有基因表达分析结果显示OS对照组、OS+Xav939-和OS+Xav939+rhAsp处理的AVIC之间的变化如表所示五。

4.讨论

成人主动脉瓣间质细胞矿化和活性钙化最能描述成人心脏的CAVD表型。但Asporin在成年主动脉瓣尖部表达，其在CAVD进展和发病机制中的作用尚不明确。因此，在本研究中，我们首次发现Asporin可能具有抑制主动脉瓣间质细胞基质矿化和钙化的作用，具有潜在的治疗意义。

在这里，我们检测到阿司匹林与胚胎流出道垫层(主动脉瓣前体)组织中较低表达水平相比，成年禽主动脉尖的mRNA表达较低。我们还成功建立了禽成年主动脉瓣间质细胞(AVIC)培养系统(图)1)。由于无法在成骨培养基中维持这些分离的原发AVICs诱导矿化3天以上体外中，我们不能检测在培养中任何冯科萨反应性细胞（数据未显示），这将进一步指示与钙盐存款末期成骨过程。一旦成骨的诱导，我们已经分析并检测到与增加的矿化的水平而增加的成骨几个基因标记表达（图2)。成骨诱导产生了内源性Asporin表达水平与Wnt的伴随增加的水平降低/β-连环蛋白信号与培养中未诱导的对照禽流感病毒的比较（图3和4)。

一些报告已经确定的Wnt /β联蛋白信号作为心脏发生的关键调节剂，包括细胞增殖，分化谱系和心脏形态发生包括主动脉瓣钙化过程[19个，26个-28个]。因此，为了更好地了解相关的信号传导促进矿化在培养成骨媒体诱导AVICs，我们操纵的Wnt /β-连环蛋白信号，以确定Asporin作为抗矿化ECM蛋白的功能。有趣的是，在成骨诱导后，直接加入重组人Asporin，不管是否有Wnt信号激活，都会降低AVICs的矿化体外(数据五和6)。对于矿化评价，我们对培养的AVICs进行了茜素红S染色的定性和定量分析。有趣的是，在成骨培养基和Xav939治疗的AVICs中，添加重组人Asporin显著地挽救了矿化。总之，这些数据强烈表明，无论是单独使用成骨诱导培养基还是与重组人Wnt3a蛋白联合使用，Asporin均可抑制AVICs矿化。与此相反，直接加入Wnt信号抑制剂Xav939与单独使用成骨诱导培养基相比，并不能显著地挽救矿化，这表明在培养过程中增加了促进矿化的活性通路(图2)7). 与这些数据一致，我们的补充图II还显示了BMP-的Smad，Notch1的和Sox9与未诱导的细胞相比，os诱导的AVICs中的基因。

因此，作为推测，Wnt信号激活协同促进成骨诱导培养AVICs矿化。但是，直接加入重组Asporin蛋白抑制矿化。总体而言，所有的这些数据是高度提示直接Asporin可能结合至Wnt信号传导受体，以防止Wnt配体的结合竞争性抑制的Wnt /β-catenin信号激活，从而诱导成骨基因。同样，先前的一份报告也证实了Asporin通过富亮氨酸基序与Bmp受体直接结合，抑制Bmp- smad1 /5/8信号传导，以诱导骨形成，并随后在牙周细胞中矿化和钙化(MPDL22)。体外[十六]。因此，如BMP-的Smad1 / 5/8的信令，也Asporin抑制Wnt /β-catenin信号抑制os处理的成年主动脉瓣细胞培养成骨基因诱导。重要的是，到目前为止，在Asporin和Wnt/之间还没有功能上的串扰β在连接到AVICs矿化和钙化β-联蛋白信号。

总之，无论是单独使用成骨诱导介质还是结合Wnt信号激活，Asporin均可抑制成体AVICs矿化。因此，在本研究中，我们确定了Asporin作为一种新型的抗矿化分子，它可能会直接与多种促骨途径受体结合，竞争性地抑制各自的配体和受体相互作用，随后的信号激活诱导成体AVICs的成体成骨基因计划。

数据可用性

用来支持这项研究的结果所有生成的数据都可能包含在文章内或补充信息文件中。

的利益冲突

作者宣称，有兴趣对此文件发表任何冲突。

致谢

这项工作得到了中央大学拨款委员会重大研究项目拨款（MRP-MASTER-BIOT-2013-12885）；印度中央政府，生物技术部，科技部资助的项目拨款（BT/PR11785/BRB/10/1324/2014）；以及西孟加拉邦政府资助的总统大学FRPDF基金的支持印度中央政府，生物技术部，科技部赞助的生物护理（BT/Bio CARe/01/9686/2013-14）赠款和中央大学赠款委员会启动赠款（编号：F.4.5（192-FRP）/2015（BSR））给AS。我们还要感谢DBT建设者计划和DST-FIST（一级）对加尔各答总统大学生命科学系的慷慨资助和支持。我们感谢所有SC和实验室成员提供的技术援助和科学投入。

补充材料

补充图1：全部由温度梯度PCR用于逆转录酶PCR测定的引物的退火温度的优化。用于基因表达的分析中，首先，所有的引物组通过IDTPrimerQuest®工具设计的。然后检测每个引物组的退火温度，我们已进行温度梯度逆转录PCR实验。在这里，在该图中，我们显示60-50℃的梯度逆转录酶PCR数据（A），包括MYH7，GATA4，波形蛋白，ALP，骨桥蛋白，MSX2，β-catenin、Wnt3a、Dkk1、Notch1、Sox9、Osterix和Bmp2。接下来，我们展示60-48°C梯度逆转录酶PCR数据（B），包括Asporin，Col1a1，Sm22α，N-钙粘蛋白，和β-肌动蛋白。接下来，我们展示65-55°C梯度逆转录酶PCR数据（C），包括纤维连接蛋白和Runx2。接下来，我们展示52-50°C梯度逆转录酶PCR数据（D），包括Adamts5、Adamts9、Smad1、Smad5和Smad8。最后，我们展示了56-52°C梯度逆转录酶PCR数据（E）。所有检测到的用于进一步基因表达分析的退火温度都在引物表（表1)，以及产品大小和正向和反向引物序列。补充图2:实时荧光定量PCR法测定引物效率。为了计算引物效率，我们遵循Qiagen准则，并对重要引物集(Asporin，β-连环蛋白和纤维连接蛋白）。这里，我们已经取了1 μg of cDNA template of control AVICs sample, and it was serially diluted with nuclease free water as follows: 1 : 1, 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, and 1 : 10000. Then, we did the standard curve derivation through the quantitative real-time PCR run. After getting the threshold values (Cq), these were plotted in -轴和cDNA稀释液的日志被绘制在 -轴(如图所示)。斜率( ）在MS Excel被确定，并且所述引物效率由下式计算： 。在这个图中，我们显示Asporin的标准曲线，β-连环蛋白和纤维连接蛋白分别存在于A、B和C。这些引物的引物效率分别为阿司匹林的95.68%，阿司匹林的98.84%β-连环蛋白，纤维连接蛋白99.21%。补充图3：胚胎流出道缓冲区和成人主动脉尖内Asporin mRNA表达的检测。为了检测Asporin的基本mRNA表达，我们用逆转录聚合酶链反应（PCR）技术分析了分离的成人主动脉瓣组织与胚胎第5天流出道缓冲组织（OFT）中Asporin的表达。我们发现基因表达增加（根据成人组织中较胚胎软组织更强烈的条带）。在这里，我们用β肌动蛋白作为上样对照。补充图4：参与成骨OS诱导在培养成人AVICs后其他骨诱导途径的定量基因表达分析。在这里，我们已经分析了附加基因表达分析以控制和OS诱导AVICs之间比较特定信令标记基因。BMP / Smad蛋白特定信令标记物已在A（I-IV）和Notch / Sox9的特定信令标记物进行了分析已在B（I，II）进行了分析。这里，BMP2增加了0.07倍（A，I），的Smad1减少了0.15倍（A，II），和Smad5的和Smad8增加7.51和6.11倍（A，III和IV）在OS处理AVICs相比未处理的对照细胞，分别。同样地，Notch1的mRNA表达增加了1.62倍（B，I）和Sox9的mRNA的OS处理减少了0.67倍（B，II）相比，在培养未处理AVICs。补充图5：在培养的人类重组Asporin（rhAsp）蛋白AVICs处理后的细胞活力。这里，我们已经通过在AVICs重组Asporin蛋白（rhAsp）处理后进行DAPI染色显示细胞存活率分析。细胞在血球计数（后接种细胞/毫升;在培养过程中，在每个培养皿中加入2ml这样的细胞悬液)。然后，我们应用剂量依赖性浓度从100 ng/ml到200 ng/ml的rhAsp。然后用DAPI对细胞进行染色，我们用这个公式计算出DAPI阳性细胞为活细胞: 。我们显示(A-D)，控制AVICs的确定百分比，100 ng/ml rhaspas处理的AVICs, 150 ng/ml rhaspas处理的AVICs，和200 ng/ml rhaspas处理的AVICs，分别是88,81.21,93.81和76.7。因此，在培养中有超过75%的dapi阳性的明显细胞核表明rhAsp处理后的AVICs是可行的。此外，统计分析显示，细胞存活率(DAPI)的变化不显著(E)⁺与未处理的对照组相比，经鼻内镜处理的AVICs的细胞核中，有 和 。（补充材料）

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