从牙髓干细胞Odontoblast-Like细胞分化Subcultivation后保留其表型

文摘

成,牙髓组织的主要细胞类型,没有可耕种的,他们负责第一行牙科修复后的反应。研究牙科材料细胞毒性和成牙质细胞细胞生理需要大量的同质细胞保留大部分的表型特征。Odontoblast-like细胞(共同体)是从人类牙髓干细胞分化使用分化培养基(包含TGF -β1),和共同体扩大后胰蛋白酶化(EXP-21)进行评估和比较。尽管较慢的细胞生长曲线,EXP-21细胞表达同样成牙质细胞标记牙本质sialophosphoprotein和牙本质基质蛋白1与RUNX2成绩单和低碱性磷酸酶活性。共同体和EXP-21细胞显示出类似的矿物沉积活动证明von Kossa茜素红染色。这些结果指出小表型的变化亚文化EXP-21关于主要分化共同体,使这些细胞的subcultivation成一个有用的策略来获得生物相容性和细胞生理学研究牙科。

1。介绍

成是高度专业化的细胞产生胶原蛋白和noncollagen造牙本质细胞外基质蛋白。他们也纸浆应急人员对外源性刺激或牙科材料(1,2]。由于他们postmitotic表型,成难以文化(3,4];因此,生化或毒素的研究评估他们使用在牙科材料有限。为了克服这些困难,研究材料的毒性已经开发主要牙龈成纤维细胞(5),主要人类或鼠标未分化的间充质干细胞,永生化细胞系(6,7]。

然而,基因型,表现型,或在这些细胞反应在体外模型可能不同于实际成牙质细胞细胞反应由于基因变化8)或环境适应性的细胞系,复杂细胞毒性的解释结果。

人牙髓干细胞(hDPSC)被孤立为贴壁细胞等单核的细胞在体外向多家谱系分化能力,包括成、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞。分化成建立结构称为完成复杂;因此,这些细胞已经被提议作为工具在牙齿再生和修复9]。

获得均匀odontoblast-like细胞(共同体)后保留其表型分化从hDPSC单层超然,重播和扩张可能受益(I)研究基因表达和具体参与分泌的蛋白质合成和细胞外基质(ECM)的矿化和(2)研究与牙科生物材料细胞反应后的挑战。扩大细胞使足够多的细胞毒性和细胞代谢研究复制,克服异质性和缺乏再现性频繁出现在主要分化成的使用。

分化培养细胞是众所周知的subcultivation后恢复到一个未分化表型(10),使得它难以执行的研究需要大量的细胞。因此,培养条件的数据,扩散率和亚文化细胞的分化状态是很重要的使用主要有区别的文化比较和验证实验。本研究旨在规范在体外细胞模型区分hDPSC共同体,以及描述和比较表型分化细胞的分离和reexpansion之后。

结果表明,hDPSC区分共同体在成矿中富含TGF -的存在β1。分化细胞的分离和subcultivation造成轻微的蛋白和基因表达的变化与主要分化共同体;因此,亚文化在分化中允许细胞保留共同体表型。再扩展企业可能是一个有用的工具来进行摘要牙本质牙髓复合体形成和细胞生理学研究用于牙科生物材料的生物相容性研究。

2。材料和方法

2.1。主要的文化人类牙髓

研究伦理委员会批准的协议修改和Facultad de Odontologia所de哥伦比亚(cie - 233 - 14)。牙齿收集、处理和处置进行了符合道德标准的国家和国际立法,和所有志愿者手术前签署知情同意书。第三磨牙的年轻个体(14 - 18岁)因为矫正手术中注意事项和处理后Gronthos建议的协议等。11]。牙齿与0.5%次氯酸钠和净化,得到纸浆,这是切成小碎片和胶原酶消化一夜之间(3毫克/毫升)(Sigma-Aldrich;圣路易斯,密苏里州,美国)和dispase(4毫克/毫升)(Gibco;热费希尔科学;德国不莱梅)准备在低糖DMEM补充10%胎牛血清(的边后卫)(Hyclone;热费希尔科学;德国不莱梅)、青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μ在37°C g / mL)有限公司5%₂孵化器。细胞悬液离心,和颗粒是resuspended低糖DMEM补充10%的边后卫,在25厘米种子²培养瓶,直到他们达到80%融合。细胞分离与胰蛋白酶+ EDTA和受移植者在75厘米²培养瓶。在第四段(分裂),细胞从独立捐助者被流式细胞术检测评估间充质细胞标记。独立的文化从三个捐助者和三个副本进行了分析( )。

2.2。流式细胞术

被国际社会公认的标准细胞疗法对间充质干细胞(12被用来确定hDPSC的表型。表现型染色鸡尾酒是用在1×10⁶细胞(Miltenyi研究;格拉德巴赫Bergisch,德国)。标记包括抗体针对CD73, CD90、CD105 CD14、CD20, CD34、CD45。细胞缺乏主要抗体与老鼠同形像控件(FITC-IgG孵化₁,PE-IgG₁,APC-IgG₁,PerCP-IgG₁,PerCP-Ig)。荧光染色细胞被捕的FACSCalibur血细胞计数器(BD生物科学;美国加利福尼亚州圣何塞),100.000事件,收购后的数据进行了分析使用FCS表达软件。数据表示为每一个标记阳性细胞的百分比。

2.3。Odontoblast-Like细胞分化

细胞分化是使用协议执行报告Teti et al。(2013)与少量修改13]。短暂、纸浆与牙原性的诱导间充质干细胞治疗中、DMEM补充10%的边后卫,抗生素,0.1μM地塞米松(Sigma-Aldrich), 5毫米β甘油磷酸酯(圣克鲁斯、钙、美国),50μg / mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich)和10 ng / mL TGF -β1 (Sigma-Aldrich) 7、14、21天37°C的5%的股份有限公司₂孵化器。经过21天的治疗,细胞分化odontoblast-like(共同体)分离使用胰蛋白酶/ EDTA(0.25% / 0.5毫米)和受移植者在烧瓶内使用相同的牙原性的感应新媒体;这些细胞被命名为“扩大在21天”(EXP-21)。评估低温贮藏EXP-21细胞是否保留其分化表型,细胞在10%的边后卫resuspended补充DMEM含有10%二甲亚砜浓度的1 - 2×10⁶细胞/毫升,然后冻结在一夜之间−80°C和转移到液氮定义存储。细胞在37°C水浴解冻再次在分化培养基和培养与分化中24小时。共同体和EXP-21细胞(新鲜和解冻)是基于他们的表型特征如下所述。通过免疫组织化学方法评价成牙质细胞标记7点14和21天后再播在新鲜和解冻EXP-21细胞。细胞外基质的形成和人口倍增时间、细胞维持14和21额外的天,分别以同样的方式共同体。人类牙髓间质细胞维持基础培养基被认为是消极的控制。

2.4。评价成牙质细胞基因表达的定量rt - pcr

试剂盒(Ambion;生活技术,卡尔斯巴德,加利福尼亚州)被用来分离总RNA从共同体在7日,14日,从EXP-21细胞分化后21天。与200 ng RNA样本,使用SYBR绿色实时rt - pcr一步法rt - pcr进行主混合系统(表达载体;大岛屿,美国纽约)CFX96实时热循环检测系统(Bio-Rad;赫拉克勒斯、钙、美国)。放大条件如下:15分钟retrotranscription 50°C, 4分钟在94°C的20年代和40放大周期94°C, 20年代在60 - 62°C,和20年代在72°C。Dentinogenic mRNA标记量化使用一组特定的引物(表1);基因对骨桥蛋白(OPN), osterix (OSX)、碱性磷酸酶(ALP)、类型I-collagen (COL-I) runt-related转录因子2 (RUNX2),象牙质sialophosphoprotein (DSPP),牙本质基质蛋白1 (DMP-1)β肌动蛋白(β行为)。DSPP和DMP-1特定牙原性的标记在解冻EXP-21细胞进一步评估证明表型低温贮藏后维护。使用LinRegPCR PCR计算效率(学术医学中心、AMC、荷兰阿姆斯特丹),和相对基因定量Schefe后执行的方法(14]。

2.5。计算细胞生长曲线和人口倍增时间(PDT)

三个细胞类型(hDPSC、共同体和EXP-21细胞)被播种在一式三份48-well微型板块(8.000细胞/)在适当的培养基并使胰蛋白酶化和计算血细胞计数器和台盼蓝每日21天。关于细胞数量和数据的天数在文化策划,和PDT估计使用公式 ),文化和的天数是手机号;数据输出确认使用倍增时间软件(15]。

2.6。采用免疫检测牙原性的标记

免疫细胞化学协议之前已经报道(16]。细胞被播种在poly-L-lysine-treated玻璃盖玻片(8.000细胞/)。达到30%的融合后,上述细胞分化为21天。单层膜与多聚甲醛固定(4%)、permeabilized,孵化和两个主要抗体之一:首先,多克隆anti-DSPP (Abcam、剑桥、马、美国),这是特定于DSPP n端对应于自然乳沟片段牙本质涎蛋白(DSP);第二,anti-DMP-1 (Sigma-Aldrich)。两人都准备在阻断缓冲区1:50稀释。山羊anti-rabbit免疫球蛋白添加生物素化的抗体是在室温下,样品洗,peroxidase-coupled链霉亲和素(热费希尔科学)补充道。特定的绑定是可视化使用H₂O₂和3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride色原体。核与苏木精复染色,细胞使用蔡司Axio成像仪拍摄A2显微镜(德国哥廷根)。其他文化集处理使用Alexa萤石594耦合链霉亲和素免疫荧光(热费希尔科学)。细胞核与赫斯特复染色,观察到在一个Axio成像仪A2显微镜(德国蔡司)和分析AxioVision软件。

2.7。ECM蛋白质粘附试验

CytoSelect系统(细胞生物学实验室,Inc .);美国圣地亚哥,CA),它使用一个48-well微型板块涂有五个不同的ECM蛋白质,是用来测试的细胞基质粘附EXP-21文化。使胰蛋白酶化细胞(7.000 /)被播种在每个涂层无血清培养基在37°C井1 h,紧随其后的是洗PBS和染色Coomassie蓝色10分钟。细胞与醋酸使退色,吸光度测量在560 nm标(Tecan M200无限;瑞士Mannedorf)。

2.8。测量的碱性磷酸酶活性

hDPSC被种植在维护介质(低糖DMEM补充10%的边后卫和抗生素)在10.000细胞/好24-well微型板块,直到他们达到60%融合。EXP-21细胞维持24小时,直到坚持在媒体分化,分化和共同体/ 3、7、14、21天。在每个试验期间,这些细胞被分离,在分析缓冲细胞溶解,离心。上层清液被转移到96孔酶标量化高山活动使用Abcam工具包基于fluorogenic衬底4-methylumbelliferyl磷酸,导致增加荧光信号( = 360海里/ 440海里)当衬底脱去磷酸。

2.9。染色的文化

ECM组件使用马森的三色的染色。细胞(hDPSC、共同体和EXP-21细胞)被播种在poly-L-lysine-treated玻璃盖玻片。共同体是分化7、14或21天,和EXP-21细胞维持14天前乙醇/丙酮固定。胶原纤维被沾1%磷钼/磷钨酸为5分钟,其次是沉浸在苯胺蓝染色,以1%醋酸洗2分钟,安装,和摄影。评估钙化节点,培养细胞用甲醛固定,沾2%茜素红pH值4.1 15分钟(Sigma-Aldrich)和拍照。污渍提取16 h和5% (v / v) 2-isopropanol和10% (v / v)醋酸溶液,和吸光度测量使用微型板块读者在550海里。冯Kossa染色是用来检测中的钙沉积formaldehyde-fixed文化。5%的硝酸银溶液添加到文化为15分钟;洗后,文化被暴露于紫外线1 h,和磷酸钙节点是计算使用蔡司Axiovert 40节能灯显微镜。

2.10。统计分析

数据被收集在一个导出Excel工作表和SPSS软件,版本21.0(美国SPSS,芝加哥,IL)进行分析。提出了数据的平均值和标准偏差。差异与值小于0.05被认为是重要的。学生的与正态分布以及串联使用,Mann-Whitney测试是用于比较数据与非参数分布。所有的条件都是评估在三个独立的实验中有两个,三个或六个复制。

3所示。结果

3.1。hDPSC Odontoblast-Like细胞分化和留存他们分离后表型

正如所料,hDPSC显示间充质细胞的标记资料(CD73 +, CD90 + CD105 +, CD14−, CD20−, CD34−, CD45−)(图1(一))和附着后单独集群文化形成与维护媒介烧瓶。这些纤维母细胞增殖率高7和21天之间在文化、和分化细胞(odontoblast-like细胞,共同体)相同的形态出现在整个文化时期。EXP-21细胞获得了梭状形态和集落形成能力,显著增加增殖率再播后7日,14日和21天的培养。达到融合后,EXP-21细胞增长作为一个附着多层模式安排在平行线(图1 (b))。虽然hDPSC没有表达成牙质细胞表型标记DSPP DMP-1,区分企业高度表达这些标记开始14天,这分化模式是保持超然和受移植者EXP-21细胞即使在冻融处理(图2)。每口井的低细胞密度播种开始分化的刺激使我们获得一份详细的蛋白质标记的位置。我们因此很容易发现共同体和EXP-21细胞(新鲜和解冻)胞质荧光和DSP核模式,虽然DMP-1主要位于细胞核较低强度在细胞质中。最终分化治疗(21天),我们发现在细胞外分泌DSP和DMP-1 ECM(图的一部分3)。

3.2。细胞生长和增殖分化期间改变

评估的角色分化培养基和分离过程,增长曲线和PDT值是21天期间获得三种文化类型。共同体增殖分化缓慢(PDT 51.6 h)期间,导致延迟达到融合并生成紧密多层殖民地,与此同时更多的细胞单位的文化区域。然而,hDPSC和EXP-21细胞有类似的PDT值(38.2 h和38.8 h,职责。)当评估后的第一次文化(图96 h4)。

3.3。分化细胞表达牙原性的基因和标记

RUNX2转录因子mRNA增加了12-18-fold分化共同体和EXP-21细胞未分化hDPSC和保持高的评估点,而OSX记录达到了显著的峰后7天的共同体分化(200倍的变化)。同样,COL-I和高山转录水平明显高于7天后的区别(125 -和160.000倍的差异,分别地。)与共同体后来分化时期(14或21天)或甚至在EXP-21细胞,价值观相同的共同体在21天的区别(OLC-21)(图5)。

有趣的是,OSX的转录水平高出三倍以上的EXP-21细胞OLC-21相比细胞。对于成牙质细胞标记,DSPP成绩单OLC-7细胞增长了5倍和25倍比hDPSC OLC-21细胞。DMP-1的表达高峰是在14天的分化,显示90倍比hDPSC表达式。EXP-21细胞维持高DSPP(比hDPSC增加32倍)和DMP-1(比hDPSC增加63倍)转录、表达的价值观,就像那些细胞解冻后。反过来,OPN在EXP-21细胞转录高出20倍比OLC-21细胞(图5)。这些数据来自三个不同的捐赠者的细胞在实验在重复独立执行。

3.4。EXP-21细胞主要使用纤连蛋白、胶原蛋白和纤维蛋白原对衬底的依从性

CytoSelect系统显示增加依从性EXP-21纤连蛋白和I型和IV-collagen(高25倍)与控制衬底(BSA)。类似的发现在fibrinogen-coated井而不是laminin-coated基质。细胞获得不同捐赠者有类似的依从性行为(图6)。

3.5。分化共同体ECM矿化

ECM蛋白质,主要是COL-I,合成开始在七天的区别揭示了马森的三色的染色(图7)。正如预期的那样,高山显示强烈活动的评价在早期分化的时间(OLC-3和7)早期成牙质细胞分化的标志但是低表达(图5在hDPSC)和活动,分化细胞(OLC-21), EXP-21细胞(图8 (b))。钙沉积和矿化节点逐步出现在分化过程中,如图所示,茜素红和冯·Kossa染色显示广泛的钙化矩阵在共同体和14天培养EXP-21细胞(数字8(一个)和8 (c))。

4所示。讨论

这项工作表明,它可以区分牙髓干细胞(或间充质祖细胞)成odontoblast-like细胞。我们还表明,分离,再播,这些分化细胞的扩张并不影响培养共同体的增殖和分化特点,代表一个有价值的特性研究中使用的再生或牙科材料的生物相容性。最有趣的报道协议的优点是获得的可能性的主要文化相关的细胞研究牙科,均匀和一致的表型分离后仍和重播,使研究人员能够执行可再生的实验,有许多复制品和准确的细胞数量计算。这些细胞能够冻结和解冻重用需求提供了一个额外的好处。

许多研究报道,干细胞或祖细胞的牙科组织很容易获得,可以扩展在体外,显示显著的可塑性;此外,这些细胞分化成牙原性的细胞(17]。hDPSC孤立的工作显示古典间充质干细胞标记类似来自人类的骨髓,如CD90、CD105,和CD73,以及缺乏早期造血标记。他们也显示出优秀的增殖和分化特性。

hDPSC odontoblast-like细胞的增殖和分化是已知取决于刺激与特定的分化培养基(18,19]。因此,我们使用了TGF -β1除了抗坏血酸,β甘油磷酸盐和地塞米松。TGF -β是一种多功能细胞因子参与细胞生长、增殖、分化,以及细胞外基质合成、指示信号通路参与牙原性的一个重要的角色分化;这包括upregulation noncollagenous表达的蛋白质如DSPP和DMP-1 [20.),支持我们的结果。微分概要文件成牙质细胞分化过程中基因表达的建议进一步血统确定矿化细胞的信号通路,控制基因表达的差异牙原性的分化。

我们发现共同体人口倍增时间高于hDPSC或EXP-21细胞,这是符合这个概念,干细胞的增殖和分化之间同步特定血统维持干细胞功能是一个关键的方面。诱导分化的条件是不一样的诱导细胞增殖;因此,在开始分化,大量基因表达发生变化,这样细胞可以获得特定功能的分化细胞(21]。没有改变最初的扩散率hDPSC或EXP-21细胞,既达到高原期第十天左右,可能是因为单层停止核扩散由于高融合和接触抑制。

DSPP和DMP-1建议的主要表型标记成(7]。之间有一个对应DSPP转录和蛋白质合成,分别由qPCR评估和免疫细胞化学。牙本质涎蛋白(DSP)被描述有特定的时空表达模式在发展中国家和牙本质矿化(1),虽然这个角色似乎在更重要在活的有机体内研究比在体外生物矿化和羟磷灰石晶体沉积研究。例如,插入DSPP-null DSP基因的小鼠诱导牙本质矿化的复苏,这有利于羟磷灰石形成的胶原原纤维。这个过程描述了前期牙质牙质过渡的成矿前(22]。

有趣的是,我们发现DSP核舱位于共同体在早期分化期和新鲜和冻存EXP-21细胞,表明监管在牙质生成函数。DSP的细胞质定位差异化OLC-14和OLC-21建议主动分泌细胞外染色在分化促进初始成矿,钙离子与胶原纤维在牙质的形成是正常的。的DSP蛋白和转录表达DSPP达到顶峰后14天的分化,这种模式是保持OLC-21和新鲜和解冻扩大细胞(EXP-21)。这些结果同意陈et al。(2008),他发现高DSP MO6-G3老鼠细胞中表达,表明成牙质细胞细胞的分化;他们还发现染色细胞核和细胞质(23]。然而,核DSP的作用仍有待阐明。

离原子核Immunoperoxidase和免疫荧光染色证实DMP-1易位ECM细胞质和随后的分泌,这一过程显然参与在体外分化成的。牙发生这种蛋白质起着重要的作用,它的表达需要从早期到后期发展阶段。DMP-1信号的角色已经深入研究;内吞作用后preodontoblasts, DMP-1诱发内质网钙释放,激活p38通路和RUNX2核易位,负责启动odontogenesis-related基因的转录24]。核/胞质本地化的DSP和DMP-1发现工作是兼容双重角色的监管机构和成核蛋白质在ECM矿化。

我们描述一个衬底坚持共同体的模式,可能是重要的优化和控制细胞微环境在表面工程实验25]。每个单元格类型提出了ECM分子的亲和性不同取决于整合素的表达α和β1单元[26]。EXP-21细胞胶原蛋白的最佳附着力(我和IV)、纤连蛋白、层粘连蛋白和纤维蛋白原,但不是,可能由于整合蛋白的高表达α2,α6,βTGF - 1诱导β1治疗和缺乏α1,α3,α7层粘连蛋白所必需的依从性,据Warstat et al。(2010)26]。

ECM蛋白质分泌和矿化的主要特点是成熟的成分泌。我们的研究结果表明,媒体分化调节必须建立一个功能ECM的蛋白质。COL-I高度调节分化的7天,观察到细胞外存款。后21天的区别,所有的细胞外空间充满了纤维结构带模式呈现在每一个细胞。分化培养基诱导矿化节点的规模和数量的增加,由于基因和高山的upregulation活动的早期分化。因此出现明显,在我们的文化中,有一个编排的多个事件导致细胞合成合适的蛋白质和矩阵元素来保证控制羟磷灰石晶体的生长和形成共同体的牙质矩阵新鲜和解冻EXP-21细胞。

EXP-21 subcultivation后细胞增殖率的变化不显著,表型、细胞集群。大对生存的影响或表型预计在超然与胰蛋白酶活性相关(27)由于失去cell-ECM交互和actin-myosin收缩。然而,一种酶+轻度EDTA治疗,如使用在我们的研究中,可以帮助保持分离细胞的生存能力和分化状态直到重启中以适当的补充治疗,作为诱导干细胞的报道(28]。有趣的是,EXP-21细胞表达10倍比OLC-21 OPN成绩单。ECM分子经常引起的机械应力,是公认的信号转导激活当纸浆维修是必要的(22,29日]。因此,EXP-21细胞可以建议有这样的分化表型出现在活跃的细胞在牙本质基质修复过程。

在这个文化系统,保持适当的分化诱导物的局部微环境信号也有助于保持亚文化的分化表型。因此,添加包含TGF -分化培养基β1保证表型在亚文化,达到将永久保存成牙质细胞分化标记和维护ECM EXP-21细胞中观察到的矿化能力。

基于上述发现,报道在体外模型保留了大部分的生理、生化和遗传成的特征。因此,扩大细胞可能是一个有用的工具为研究成牙质细胞分化和底层细胞信号。此外,我们表明,subcultivation以及低温贮藏和分化成的解冻,是可能的。只有轻微的变化增殖或分化表型观察,表明效用的亚文化细胞在组织工程和生物相容性研究牙科材料。

信息披露

作者独自负责的内容和写这篇文章。

的利益冲突

作者报告没有利益冲突。

确认

这项工作是支持由哥伦比亚大学Nacional de, Banco de La那时,哥伦比亚,项目代码:3824,和大学El博斯克(UEB),项目代码:398 - 2015。

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