Nesprin-2 SMC2与Condensin交互组件

文摘

Nesprins核膜蛋白,在间期,他们主要研究函数在维护核形状,大小和定位。我们分析Nesprin-2的功能在染色质在间期和分裂细胞的相互作用。我们描述一个地区杆域预测的Nesprin-2 SMC域(aa 1436 - 1766)。我们表明,该域可以与本身。它另外有能力结合SMC2 SMC4, condensin的核心单元。观察相互作用在细胞周期的所有阶段;它还在S期尤为强烈,坚持在有丝分裂期间。Nesprin-2击倒并不影响condensin分布;然而我们注意到更高数量的染色质桥梁在后期Nesprin-2击倒细胞。因此,Nesprin-2可能影响染色体可能是因为其与condensins或其提供的间接机制交互在核膜。

1。介绍

真核细胞的细胞核港口组织在长期的遗传物质DNA聚合物和与众多相关蛋白形成染色质。染色质分开核被膜的细胞质(NE),组成的连续膜系统内(立即通知)和外核膜(ONM)封闭细胞核周围的空间(pn)。两个核孔复合物膜相连,ONM继续进入内质网(ER)。不不是一个简单的膜屏障但是内衬和交叉的大型蛋白质组件,为其提供各种细胞功能。Nesprins(核膜血影蛋白重复蛋白)和太阳一起蛋白质是东北的中心组件。目前四Nesprins (Nesprins-1-4)是已知的哺乳动物。他们居住在INM ONM,大小不同,存在于许多亚型(1]。Nesprins具有不同数量的血影蛋白重复之后,c端卡什(Klarsicht ANC-1,自从同源性)域的锚蛋白在核膜和与太阳太阳蛋白质在细胞核周围的空间域(2]。Nesprin-1和Nesprin-2港n端配对calponin同源域调解绑定f -肌动蛋白(3,4]。plectin Nesprin-3的n端结合,细胞骨架交联剂,建立了连接到中间丝状体系统(5]。Nesprin-4与kinesin-1交互,一个使用微管马达蛋白作为细胞线路(6]。微管相互作用通过kinesin-1也被描述为Nesprin-2 [7]。

基于nucleo-cytoskeletal交互,Nesprins细胞核整合到细胞的细胞骨架和参与核形状和稳定性的维护(8,9]。血影蛋白重复(SRs)平台为蛋白质或self-interactions [10]。此外,SRs的数量,因此提出了抽油杆的长度来调节细胞核的大小(11]。在中央SR域,一个额外的域被描述在Nesprin-2, SMC(染色体的结构维护)域包括氨基酸残基1464 - 1771,是由Dawe et al。12作为meckelin交互网站,功能的蛋白质初级纤毛的形成。初级纤毛是感觉器官,作为机械在各种信号通路或传感器的化学刺激13]。

SMC蛋白质核心功能在调节基因组稳定性和遗传物质的组织。他们从细菌到人类存在14]。古典SMC 1000 - 1300个氨基酸组成的蛋白质。他们有两个卷曲螺旋区域中央铰链打断了。螺旋线圈折叠回到自己和一个扩展的结构形式。的末端,N - c终端分子相互作用形成一个球状磷酸腺苷域(15]。铰链区域负责heterodimerization SMC分子(16]。6 SMC蛋白质中所描述的男人,SMC1-6。SMC1/3形式cohesin复杂介导姐妹染色单体的核心凝聚力;SMC2/4 condensin复杂行为在染色体中组装和隔离。他们存在于两个condensin复合物与截然不同的角色,condensins I和II,含有SMC2 SMC4结合不同non-SMC子单元。Condensins I和II相关联顺序与染色体在细胞周期和染色体结构的不同的角色。Condensin我不存在在间期细胞核。在有丝分裂期间,condensin我需要删除cohesin染色体臂染色体缩短,而condensin二世在染色体缩合在前期早期发挥作用(17]。Condensin我是,然而,并非完全排除在间期细胞核后发现了一个小池与基因间和intronic地区在间期(18,19]。相比之下,condensin II总是核。它与DNA间期和集中在前期染色体。基于其相间分布,在核架构提出了(20.,21]。Cohesin和condensin复合物也参与DNA修复和基因调控细胞周期(20.]。此外,condensin参与组织染色质允许染色体内关联的基因位点所示裂殖酵母(22]。SMC5/6主要涉及DNA损伤修复和DNA重组和减数分裂中有特定的角色23,24]。

我们已经进行了生化和功能Nesprin-2-SMC域的描述,以下称为Nesprin-2-SMC。我们表明,它可以自组装形成二聚体,三聚,高阶结构和可以与condensin SMC2和SMC4的蛋白质。单克隆抗体针对的SMC域显示一个分布Nesprin-2亚型包含SMC沿NE在域间期和有丝分裂过程中,染色体的存在。我们还发现了一个Nesprin-2对有丝分裂染色体的影响,可能是由与SMC2/4 condensin核心单元的交互。

2。材料和方法

2.1。转染细胞培养,细胞同步

HaCaT(人类角化细胞细胞株)COS7(非洲绿猴肾成纤维细胞)和海拉(人类宫颈癌细胞)细胞生长在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂在DMEM 37°C(高葡萄糖,生活技术)补充10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷氨酰胺(σ),和1%的青霉素和链霉素。细胞转染描述(11]。击落Nesprin-2; HaCaT细胞转染两次每隔72 h使用Amaxa Nucleofector工具包V (Lonza)的解决方案。的质粒用于击倒Nesprin-2针对n端和糖(Nesprin-2 n项成分,Ne-2 n项KD;Nesprin-2 c项成分,Ne-2 c项KD)以及控制前面描述的(7]。下面将描述新生成的质粒。细胞周期同步,HaCaT细胞治疗胸苷(2毫米)24小时,然后与诺考达唑(100 ng / ml) 12 h或者先9μro - 3306(圣克鲁斯生物技术、sc - 358700)为20到22 h然后大约3 h释放(取决于所需的有丝分裂阶段)获得有丝分裂阶段。ro - 3306是一种CDK1抑制剂和可逆逮捕在G2 / M期细胞增殖的细胞周期26]。流式细胞仪分析细胞周期阶段进行同步和同步的细胞。染色是完成Nuclear-ID™红色DNA(恩佐劳动部- 52406)。

测定细胞增殖是由镀在一个时间点6井相同数量的细胞,然后计算两井后24 h,后两个48 h后,和两个72 h。

2.2。克隆策略

互补HaCaT细胞编码的SMC域Nesprin-2 (AAN60443、1436 - 1766 aa和SRs 11 - 13日)被用作以下使用引物PCR模板:5′GAATTCAATGAACTCCTTAAAAATATTCAAGATGTG 3′,牧师:5′GAATTCCTCGAGGGATTCAGTCATCCCGATCTGGGTCTTGG 3′包含EcoRI限制性位点克隆到pGEX-4T1 (Amersham)收益率pGEX-4T1-Nesprin-2-SMC GST-Nesprin-2-SMC进行编码。销售税位于蛋白质的氨基酸。Nesprin-2-SMC序列生成的PCR克隆到pCMV-Myc(通用电气医疗集团)使用pGEX-4T1 Nesprin-2-SMC模板和引物EcoRI或XhoI限制网站,SMC (SR11-13): 5′GAATTCTGAATGAACTCCTTAAAAATATTCAAGATGTG 3′,牧师:5′CTCGAGCTAGAGGGATTCAGTCATCCCGATCTGGGTCTT 3′。SR11: 5′GAATTCTGAATGAACTCCTTAAAAATATTCAAGATGTG 3′,牧师:5′CTCGAGCTATCTCCCACATTGTTCAAGACATTCGGTGAC 3′, SR12: 5′CTCGAGGTTTTGGAGCTCTTAAAACAATATCAGAAT 3′,牧师:5′CTCGAGCTAACCAAGATTTTCATAGTAATCTTCTGTCTT 3′, SR13: 5′GAATTCTGCGAGCTCTAGCTTTGTGGGACAAACTTTTTA 3′,牧师:5′CTCGAGCTAGAGGGATTCAGTCATCCCGATCTGGGTCTT 3′。Myc-SR53-56对应Nesprin-2残留6146 - 6799是施耐德中描述等。7]。

Nesprin-2 SMC领域特定成分(Ne-2 SMC)使用以下所述生成寡核苷酸:感觉5′-ATTCTCCTGTTAAGCACTTCTGTACATGGAAGCTTGCATGTATAGGAGTGCTTAGCAGGAGAATCCATTTTTT-3′, 5′反义-GATCAAAAAATGGATTCTCCTGCTAAGCACTCCTATACATGCAAGCTTCCATGTACAGAAGTGCTTAACAGGAGAATCG-3′和随机控制使用感觉5′-CCTTTCAGATACGTCTTGTACAGGTATTGAAGCTTGAATGCCTGTACAGGATGTATCTGAAAGGCGATTTTTT-3′和反义5′GATCAAAAAATCGCCTTTCAGATACATCCTGTACAGGCATTCAAGCTTCAATACCTGTACAAGACGTATCTGAAAGGCG-3′寡核苷酸(27]。击倒的效率被免疫荧光和免疫印迹分析评估。击倒的SMC2在COS7细胞中实现了SMC2-specific siRNAs (Dharmacon e - 006836 - 00 - 0005年,通用电气医疗集团)。为控制,使用相应的炒成分。细胞株是推荐的供应商特定siRNAs结合。转染是使用Dharmafect转染试剂根据制造商的协议。转染后的细胞进行分析96 h。成功击倒被使用SMC2特定抗体免疫荧光分析评估。

2.3。销售税蛋白质的表达和纯化和销售税下拉

质粒编码GST融合蛋白变成了大肠杆菌XL-1蓝色和一夜之间成长和稀释1:50到新鲜磅媒体。细菌增长到一个OD_600年的0.6到0.8与0.5毫米IPTG诱导蛋白表达是一夜之间持续20°C。细菌是颗粒状和洗STE缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值8.0,50 mM氯化钠,EDTA和1毫米)。溶解于100年通过的μ在Dounce g / ml溶菌酶和机械剪切均质器离心紧随其后。融合蛋白被绑定到Glutathione-Sepharose 4 b(通用电气医疗集团)。GST-Nesprin-2-SMC多肽有预测分子量64.8 kDa。这是有效地表达大肠杆菌XL-1蓝色和纯化可溶性蛋白质。蛋白质是注定要Glutathione-Sepharose珠子和Nesprin-2-SMC被释放从消费税部分凝血酶解理(Sigma-Aldrich)。另外,GST-Nesprin-2-SMC被筛选了从珠子减少谷胱甘肽(20 mM)在100毫米Tris-HCl, pH值8.0。

销售税下拉化验是由赖氨酸HaCaT或COS7细胞裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,1%诺乃清洁剂p 40,和0.5%钠脱氧胆酸盐)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)推动通过一个0.4毫米针声波降解法和离心紧随其后。细胞溶解产物与Glutathione-Sepharose珠子在一夜之间被孵化绑定GST融合蛋白或销售税和洗5次与PBS或裂解缓冲与蛋白酶抑制剂补充。珠子绑定蛋白复合物进行了分析通过sds - page和免疫印迹(WB)。

2.4。抗体和免疫荧光显微镜(如果)

以下使用抗体:鼠标单克隆anti-Nesprin-2马伯甘蓝型- 478提出的肌动蛋白结合域(ABD) Nesprin-2(残留1 - 285)3(如果,1:200;杂种细胞上清液,世行,1:10),兔多克隆抗体pAbK1提出对血影蛋白c端地区重复Nesprin-2 [28(如果,1:100;世行,1:1000),具体Nesprin-1马伯k43 - 322 - 2提高对氨基端血影蛋白重复10和11 Nesprin-1 [29日](杂种细胞上清液,稀释),GFP-specific马伯k3 - 184 - 2 (30.](杂种细胞上清液,如果1:2;世行,1:10),Myc-specific马伯9 e10 [31日](杂种细胞上清液,如果未搀水的;世行,1:10),帕布销售税(32)(WB, 1: 50000), mAb k84 - 913对销售税(杂种细胞上清液,世行1:10),帕布核纤层蛋白B1 (Abcam ab16048,如果1:200;世行,1:4000),帕布SMC2(罗福斯生物制剂nb100 - 373,如果1:100;世行,1:2000),世行:马伯SMC4 (Abcam ab179803 1: 2000),如果:帕布SMC4 (Abcam ab17958, 1: 500),帕布SMC1 (Abcam ab21583,世行1:1000),山羊SMC3(圣克鲁斯生物技术、sc - 8135,世行1:50),兔子CAP-H(架a300型Biomol-Bethyl - 603 a - t,世行1:1000),帕布CAP-H2 (Biomol-Bethyl a302 - 275 a,世行1:4000),mAb PDI (Abcam ab2792, 1: 100),帕布calreticulin(热费希尔阿兹卡班的囚徒第三章- 900,如果1:50 - 200年),和老鼠马伯YL1/2特定α微管蛋白(1:5)。马伯k81 - 116 - 6(杂种细胞上清液,稀释)针对Nesprin-2 SMC域是在这项研究中生成的。这些抗体被用于免疫荧光和免疫印迹分析。多肽对应Nesprin-2 aa 1436 - 1766(计算分子量38.78 kDa)产生GST融合多肽和绑定到Glutathione-Sepharose珠子如上所述。SMC多肽是由凝血酶解放乳沟和用于生产单克隆抗体的免疫小鼠所描述(33]。Alexa 568或488荧光标记和高度交叉吸收和亲和纯化二次抗体(热费希尔)和4,6-diamino-2-phenylindole (DAPIσ)是用来观察DNA。免疫荧光,细胞生长覆盖都固定在3%多聚甲醛(PFA)磷酸盐(PBS) 15分钟紧随其后4分钟孵化Triton x - 100 / PBS为0.5%。另外,细胞被固定在冰冷的甲醇10分钟孵化−20°C。阻止了PBG (0.5% BSA, 0.045%鱼明胶在PBS, pH值7.4)在室温下(RT) 30分钟。初级和二级抗体DAPI稀释在PBG以及应用于细胞1 h RT或一夜之间在4°C。显微镜是由使用TCS-SP5(莱卡)或埃Opti网格共焦显微镜(莱卡)。为控制,细胞通常仅用二次抗体标记。在任何情况下是一个信号。

测试新成立的特异性马伯k81 - 116 - 6,杂种细胞的抗体被上层清液(损耗)和上层清液用于免疫荧光分析。损耗是表现在两个方面。例如,杂种细胞上清液与Glutathione-Sepharose孵化珠子GST-Nesprin-2-SMC多肽。珠子被移除的离心(2000 rpm, 2分钟)和上层清液用于免疫荧光分析。另外,GST-Nesprin-2-SMC被加载到一个SDS-polyacrylamide凝胶,然后将蛋白质转移硝化纤维膜,被朱红色年代染色,膜的一部分携带GST-Nesprin-2-SMC蛋白质减少和孵化马伯k81 - 116 - 6。隔夜后孵化(4°C)的解决方案被膜和申请。对于这两种方法,一个整除的抗体溶液消耗之前保持控制。

2.5。免疫沉淀反应

免疫沉淀反应(IP), HaCaT细胞收获和细胞溶解裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,1%诺乃清洁剂p 40, 0.5%钠脱氧胆酸盐,和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)。细胞被推和拉通过0.4 mm细胞溶解针和离心机(12.000 rpm, 20分钟)。浮在表面的孵化了1 h和蛋白琼脂糖CL-4B珠子(通用电气医疗集团)事先批准。随后,珠被离心(2000 rpm, 2分钟)和细胞溶解产物与5 - 8孵化μg抗体的利息为2 h rt蛋白琼脂糖CL-4B珠子平衡与裂解缓冲被添加到细胞溶解产物和孵化持续一夜之间在4°C。收集的珠子是离心和洗五次PBS和绑定蛋白释放的珠子SDS样品缓冲和加热到95°C 5分钟,通过SDS - page分析(3 - 12%的丙烯酰胺梯度凝胶;丙烯酰胺的10%和12%)和免疫印迹。转移的高分子量Nesprin-2巨头硝化纤维素膜(0.22μ孔隙大小)是由湿两到三天的印迹技术。

2.6。凝胶过滤和化学交联

评估本地蛋白的低聚物的状态,凝胶过滤柱的示例应用(交联葡聚糖g - 200,通用电气医疗集团)作为描述(34]。来确定分子量,分子量标准(通用电气医疗集团)在相同的条件下分离。化学交联Nesprin-2-SMC(1毫克/毫升)进行的长度为零的交联试剂EDC (1-ethyl-3 - [3-dimethylaminopropyl]碳化二亚胺盐酸盐)(热费希尔)连同sNHS(磺基-N -hydroxysuccinimide)在0.1 M MES缓冲区(pH值6.5)(35]。

3所示。结果

3.1。Nesprin-2杆域包含一个SMC域

我们研究一个地区在SR包含杆Nesprin-2域与SMC同源染色体结构维护域(价值 )。这一领域包括氨基酸1436 - 1766和延伸SR11-13指定Nesprin-2-SMC(图1(一))[36]。与哺乳动物SMC蛋白比较,我们发现高程度的同源性的卷曲螺旋区域SMC2和SMC4(19.7%认同,52.9%的相似性和21.5%的身份,53.9%相似,resp。)(图1 (b))。评估Nesprin-2-SMC能否接受self-interactions,我们这是GST融合蛋白表达和分析的洗脱行为39 kDa多肽,被释放由凝血酶乳沟销售税,尺寸排阻色谱法。蛋白质筛选了两座山峰,一个洗脱~ 50 kDa和相应的单体和一个更广泛和更大的淋洗之间75 kDa和158 kDa表明低聚物(图1 (c))。蛋白质用于校准列球状蛋白质,而Nesprin-2-SMC有望杆状的分子可能影响洗脱行为。洗脱模式也证实了sds - page和Coomassie蓝染色显示,卵白蛋白的蛋白质在分数面前筛选了表明低聚物的状态(图S1(a))。长度为零的交联剂的交联实验使用不同浓度EDC显示单体的存在,二聚体,三聚,甚至更高分子量复合物。EDC浓度降低,分子量更高形式的数量减少而增加单体的形式(图1 (d))。Nesprin-2-SMC寡聚化属性的支持下拉数据实验中GST-Nesprin-2-SMC沉淀Nesprin-2巨头从HaCaT细胞溶解产物(见实验细节材料和方法)。人类Nesprin-2巨头6885 -氨基酸蛋白预测分子量796 kDa。质谱分析鉴定肽覆盖整个Nesprin-2巨分子沉淀(图S1(b))。序列的高覆盖率位于残留1436年和1766年之间由于多肽用于下拉。销售税没有Nesprin-2沉淀。

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图1

SMC Nesprin-2域的描述。(一)Nesprin-2的示意图(不按比例画)。SMC的位置域(血影蛋白重复11 - 13),c端血影蛋白重复(53-56)所示。抗原表位的抗体使用以上示意图表示。ABD,肌动蛋白结合域;椭圆形,血影蛋白重复。血影蛋白重复域开始在308位置。(b) Nesprin-2-SMC域的序列比较SMC2卷曲螺旋地区和SMC4。使用LALIGN序列进行比较,从EMBL-EBI两两序列比对工具(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/)。加入Nesprin-2 (NCBI基因库AF435011.1数量),SMC2 (NCBI基因库加入O95347.2数量),和SMC4 (NCBI基因库加入Q8WXH0.3数量)。:相同的氨基酸,。,conservative substitution. (c) Analysis of Nesprin-2-SMC by gel filtration chromatography. UV traces of the elution profile are shown. Nesprin-2 SMC (calculated molecular weight 39 kDa). Molecular weight markers were ovalbumin (43 kDa), conalbumin (75 kDa), and aldolase (158 kDa). (d) Analysis of chemically crosslinked Nesprin-2-SMC. Zero-length cross-linking reagent EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) was used at decreasing concentrations. The proteins were separated by SDS-PAGE (10% acrylamide) and stained with Coomassie Blue. (e) Schematic representation of Myc-tagged Nesprin-2-SMC polypeptides. Amino acid positions refer to human Nesprin-2 giant (accession number AF435011.1). (f) Interaction of GST-Nesprin-2-SMC with individual Myc-tagged spectrin repeats derived from Nesprin-2-SMC and expressed in COS7 cells. GST-Nesprin-2-SMC was used for pulldown (right panel). Western blots were probed with mAb 9E10 specific for Myc. Asterisk, endogenous Myc [25]。(g)的特异性Nesprin-2-SMC交互。Myc-SR53-56表示在COS7细胞中用于下拉控制和GST-Nesprin-2-SMC销售税。COS7和COS7 Myc-SR53-56代表完整的细胞溶解产物。朱红色年代彩色污点和相应的污点;探讨了马伯9 e10所示。MW,分子量标记(从上到下:200、130、100、70年,55岁,35岁和25 kDa)。

我们进一步表达Myc-tagged Nesprin-2-SMC (Myc-Nesprin-2-SMC)对应于Nesprin-2全长SMC域和Myc-tagged多肽对应于其个人老域名在COS7细胞和细胞溶解产物用于下拉实验GST-Nesprin-2-SMC(图1 (e))。GST-Nesprin-2-SMC沉淀Myc-Nesprin-2-SMC及其个人SRs COS7细胞溶解产物如使用Myc-specific抗体的免疫印迹马伯9所示e10(图1 (f))。总的来说,结果表明oligomerize Nesprin-2-SMC领域有潜力。然后我们被问及这种交互是特定于这个Nesprin-2域和测试GST-Nesprin-2-SMC能否与其他Nesprin-2血影蛋白重复。因此我们表达Myc-SR53-56组成的最后四血影蛋白重复Nesprin-2 (SR53-SR56, aa 6116 - 6799,图1(一)在COS7细胞和下拉和销售税化验进行控制和GST-Nesprin-2-SMC [7]。GST-Nesprin-2-SMC没有沉淀Myc-SR53-56突显出特异性的相互作用(图1 (g))。

3.2。单克隆抗体Nesprin-2-SMC领域特定检测高分子量蛋白质和染色核膜

研究Nesprin-2亚型窝藏SMC域,我们生成的单克隆抗体免疫小鼠Nesprin-2-SMC多肽所从消费税部分释放凝血酶乳沟。在西方墨迹HaCaT细胞匀浆分离的梯度凝胶(3 - 12%的丙烯酰胺)马伯k81 - 116 - 6识别主要是高分子量蛋白质,我们假定对应~ 800 kDa Nesprin-2巨头[3]。微弱的乐队可以降解产物或氨基端亚型(以下1)(图2(一个))。在独立的实验中,我们免疫沉淀反应Nesprin-2 HaCaT细胞和探测的沉淀和SMC2 SMC4抗体,我们排除了任何的低分子量的乐队与SMC蛋白质由于交叉反应的抗体(数据未显示)。在免疫荧光分析中,mAb k81 - 116 - 6标签HaCaT NE和海拉细胞重叠pAbK1染色(图2 (b))。以前描述的多克隆抗体pAbK1已经生成的4 c端血影蛋白重复Nesprin-2和特定Nesprin-2(图1(一))[28]。此外,mAb k81 - 116 - 6细胞质中的彩色结构附近的核可能是膜的内质网(ER),我们观察到colocalization calreticulin,一个ER蛋白质(图2 (b)较低的面板)。胞质染色在HaCaT相对微弱的细胞,而在海拉细胞更明显。pAbK1也沾这些结构;然而,染色强度弱,可能是由于不同的可访问性的抗原表位(图2 (b))。Nesprin-2 tail-anchored蛋白及其mRNA已经发现固定在ER翻译。这也许可以解释观察到的定位(37]。

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图2

描述的单克隆抗体针对SMC域。(一)检测Nesprin-2马伯k81 - 116 - 6在HaCaT细胞溶解产物。蛋白质是由sds - page分离丙烯酰胺(3 - 12%)。(b)马伯k81 - 116 - 6染色HaCaT和海拉细胞。pAbK1作为善意Nesprin-2抗体。DAPI染色DNA(合并)。酒吧,10μm。较低的面板,colocalization Nesprin-2被马伯k81 - 116 - 6与ER标记calreticulin HaCaT细胞。酒吧,5μm。(c)的特异性分析马伯k81 - 116 - 6。表示抗体从杂种细胞耗尽上层清液的过程。抗体的上层清液用于免疫荧光分析。酒吧,10μm。

证明马伯k81 - 116 - 6的特异性,我们进行了抗体耗竭研究。我们发现NE的染色以及胞质染色后被完全废除损耗马伯k81 - 116 - 6的杂种细胞上清液通过孵化上层清液与硝基膜条携带GST-Nesprin-2-SMC或携带GST-Nesprin-2-SMC Glutathione-Sepharose 4 b珠子。相比之下,仍由pAbK1标记(图2 (c))。此外,蛋白质不再是发现在细胞溶解产物后推倒Nesprin-2使用shRNA针对SMC域(图S2(一)),未发现信号当细胞被免疫荧光分析(见下文,数字4 (b)和4 (c))。

3.3。SMC2 Nesprin-2约束力的合作伙伴

确定Nesprin-2约束力的合作伙伴,我们进行免疫沉淀反应实验使用马伯甘蓝型- 478针对Nesprin-2的n端和pAbK1(图1(一))。蛋白质是由sds - page分离和染色Coomassie蓝色,乐队被切断,蛋白质被质谱鉴定。为控制GFP-specific抗体马伯k3 - 184 - 2是使用。SUN1沉淀蛋白质中有组蛋白,核纤层蛋白A / C和SMC2发现免疫沉淀反应的马伯甘蓝型- 478。SUN1和核纤层蛋白A / C交互已经先前描述和特征;组蛋白和SMC2互动小说研究[2,28,38]。在这里我们接下来SMC2交互。因为Nesprin-2 SMC同源性的,我们推测这个域可以与SMC2交互并进行下拉化验Glutathione-Sepharose 4 b珠子含有GST-Nesprin-2-SMC使用HaCaT细胞溶解产物中描述的材料和方法,探索下拉SMC2的存在。销售税珠子作为控制加载。我们确实可以检测SMC2 GST-Nesprin-2-SMC沉淀的SMC2特定的抗体。SMC4形成一个复杂与SMC2 condensin GST-Nesprin-2-SMC也被拆除。销售税没有沉淀SMC2或SMC4(图3(一个))。进一步证明一个交互来从HaCaT细胞免疫沉淀反应实验与沉淀Nesprin-2马伯甘蓝型- 478。Nesprin-2下拉,我们发现SMC2 SMC4。在相反的实验中使用SMC2特定抗体,发现Nesprin-2沉淀的马伯甘蓝型- 478。GFP抗体用于控制没有降低的蛋白质测试(图3 (b))。

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图3

交互Nesprin-2-SMC和Nesprin-2 SMC2和SMC4。(一)降水SMC2和SMC4 GST-Nesprin-2-SMC HaCaT细胞溶解产物。沉淀是解决SDS-polyacrylamide凝胶(10%丙烯酰胺)和探测SMC2和SMC4特定抗体。SPN,下拉后上层清液;PD,下拉。的低分子量乐队SMC2下拉大概也是一个分解产物。(b)免疫沉淀反应的SMC2 HaCaT与Nesprin-2 mabk20 - 478和特定的细胞溶解产物Nesprin-2 SMC2特定抗体。GFP-specific单克隆抗体被用于控制。用于免疫沉淀反应的抗体在面板(IP)表示。探讨了这些墨迹与右边列出的抗体(WB)。 Immunoprecipitates were resolved on gradient gels (3–12% acrylamide) and 10% acrylamide gels as appropriate. The data are from one blot; however, the input was not directly adjacent to the SMC2 IP. (c) Interaction of CAP-H2 (condensin II) and CAP-H (condensin I) with Nesprin-2-SMC. Pulldowns were performed with HaCaT cell lysates and GST for control and GST-Nesprin-2-SMC as indicated. Unsynchronized cells were used for the experiments shown in (a)–(c). (d) Analysis of the Nesprin-2-SMC interaction with SMC2 during the cell cycle. HaCaT cells were synchronized with RO-3306 or other reagents as described in Materials and Methods in order to obtain the relevant cell cycle phases. Cell cycle phases were assessed by FACS analysis; the results are depicted in the accompanying diagram. Pulldown was carried out with GST-Nesprin-2-SMC bound to GST-Sepharose. GST was used for control. The blot was probed with SMC2 specific antibodies. (e) Localization of Nesprin-2 as detected with mAb K81-116-6 (green) during mitosis in HaCaT cells. DNA was stained with DAPI. Arrow points to filamentous staining across the chromosomes. (f) Nesprin-2 distribution in HaCaT cells during mitosis as detected with mAb K20-478 (green) and pAbK1 (red). DNA was detected with DAPI. Bar, 10 μm。(g) Nesprin-2出现在染色体。不同的Z-stacks(从上到下:0μ0.21米,μ0.42米μ0.84米,μ米)在COS7细胞后期沾马伯甘蓝型- 478。DNA与DAPI染色。酒吧,5μm。

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(c)

图4

击倒的Nesprin-2使用shRNA针对c端氨基,SMC域序列。(一)西方墨迹显示shRNA治疗蛋白质的效率水平。HaCaT细胞转染shrna针对不同地区和控制(ctrl)与相应的炒成分。在~ 800 kDa Nesprin-2被马伯甘蓝型- 478。核纤层蛋白B1是用于加载控制。(b) HaCaT细胞的免疫荧光分析处理shrna针对糖基(Ne-2 c项KD),的n端(Ne-2 n项KD),或SMC域(Ne-2 SMC KD)。细胞被沾染了抗体针对n端(mAb甘蓝型- 478、绿色)和糖Nesprin-2 (pAbK1,红色)。DAPI用于可视化的DNA。箭头指示细胞与成功击倒;星号表示细胞仍然表达Nesprin-2。 Bar, 10 μm。(c) Immunolabelling Ne-2 SMC KD细胞与马伯k81 - 116 - 6。核与DAPI标记。星号表示细胞仍表示Nesprin-2。酒吧,10μM。

condensin存在于两个复合物,condensin我和condensin II (18),我们使用CAP-H (kleisinγ,non-SMC condensin我复杂的子单元H)和CAP-H2 (kleisinβ,non-SMC condensin II复合体亚基H2)抗体探针GST-Nesprin-2-SMC下拉和确定CAP-H CAP-H2沉淀(图3 (c))。我们也对其他SMC是否与Nesprin-2蛋白质相互作用。然而,cohesin组件SMC1和SMC3未见执行后的沉淀下拉与GST-Nesprin-2-SMC(图S2(b))。这些结果使一个特定的交互condensin和Nesprin-2之间。尽管SMC蛋白质存在于细胞周期的所有阶段,他们有特定的角色在特定的阶段17]。找出交互是否局限于细胞周期的某个阶段,我们使用从HaCaT细胞溶解产物,处理各种试剂中描述的材料和方法。这导致了浓缩特定细胞的细胞周期阶段。下拉进行了化验GST-Nesprin-2-SMC和销售税加载Glutathione-Sepharose珠子和沉淀探测SMC2的存在。SMC2在场的沉淀物从未经处理的细胞溶解产物,获得细胞G0 / G1和细胞样品浓缩S和M的阶段。最著名的信号在S期溶菌产物丰富细胞有丝分裂期细胞紧随其后。GST-control没有降低SMC2(图3 (d))。通过流式细胞仪分析细胞周期阶段控制(图3 (d)条形图)。

的colocalization SMC2和SMC4 Nesprin-2很难想象在免疫荧光级别,因为SMC2和SMC4很强的信号。然而,可以看到一些重叠表明colocalization特别是末期(见下文,数字5(一个)和5 (b)上面板;看到末期控制细胞重叠)。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图5

SMC2 (a)和SMC4 (b)在HaCaT角质细胞治疗控制成分(上部面板)和处理Nesprin-2-SMC领域特定成分(较低的面板)。Nesprin-2检测与马伯甘蓝型- 478。酒吧,10μm。(c)本地化的小干扰rna介导击倒后Nesprin-2 SMC2在COS7细胞中。染色与SMC2特定抗体和马伯甘蓝型Nesprin-2 - 478。酒吧,5μm。(d)评估SMC2击倒。SMC2荧光强度测量的中心有丝分裂染色体。10核细胞和治疗12控制细胞(控制治疗)进行了分析(值= 0.0001)。

3.4。Nesprin-2定位在有丝分裂

为研究Nesprin-2定位在有丝分裂期间,我们进行了免疫荧光分析使用马伯k81 - 116 - 6, mAb甘蓝型- 478和pAbK1(数字3 (e),3 (f),3 (g))。所有抗体表明Nesprin-2迁至细胞质在核膜破裂,与ER与揭示了costaining ER标记的抗体特定PDI(蛋白二硫化物异构酶(图)S3)。它还包围了浓缩的染色体,Nesprin-2积极结构扩展整个染色体在有丝分裂阶段(数据3 (e),3 (f),3 (g)和S4)。串行部分的染色体有丝分裂细胞Nesprin-2的分布(图确认3 (g))。后期直到末期开始,我们发现信号在反对分裂染色体的两端材料可能的改革(图3 (f))。这个定位具体为染色Nesprin-2 Nesprin-1马伯k43 - 322 - 2并没有透露与染色体(图S5)。

3.5。Nesprin-2击倒不影响Condensin分布

专门探索SMC的作用域包含Nesprin-2亚型,HaCaT细胞治疗Nesprin-2-SMC shrna相比(Ne-2 SMC KD)和细胞治疗shrna针对Nesprin-2 n端或Nesprin-2糖基(Ne-2 n项KD;Ne-2 c项KD) [7]。的序列的生成SMC-specific shrna精心挑选的,以排除非目标效应是由于对SMC序列同源性。在西方墨迹标签马伯甘蓝型- 478有明显减少Nesprin-2巨头在从细胞溶解产物~ 800 kDa Ne-2处理c和Ne-2 SMC shrna(图4(一))。类似的结果马伯k81 - 116 - 6(见上图,图S2(a))。确认该击倒在免疫荧光级别与马伯甘蓝型- 478,pAbK1, mAb k81 - 116 - 6(数字4 (b)和4 (c))。细胞增殖并没有改变击倒细胞相比HaCaT控制细胞(两个独立的实验,图S6(a))。同样,流式细胞仪分析没有透露进展通过细胞周期的变化(三个独立的实验,图S6(b))。Nesprin-2消耗使用Ne-2 SMC成分没有明显影响SMC2/4位置在免疫荧光染色分析与控制细胞。SMC2/4也分布在有丝分裂期间不影响和蛋白质有明显的协会与有丝分裂染色体分析(数据的水平5(一个)和5 (b))。此外,蛋白质含量没有改变(图出现S2(c))。

我们还执行相反的实验通过下调SMC2在COS7细胞转染针对SMC2 siRNA池。自从击倒不完整,我们寻找有丝分裂细胞减少SMC2染色和Nesprin-2分布分析。我们发现Nesprin-2仍然包围了染色体质量表明Nesprin-2定位不是严格依赖SMC2(数字5 (c)和5 (d))。

然而,Nesprin-2耗尽细胞的分析揭示了染色质桥梁在安娜-和末期的存在。当我们决定染色质桥梁与SMC细胞转染Ne-2 SMC成分控制在安娜和末期,我们观察到4.4%(平均值)的控制细胞存在染色质桥梁。Nesprin-2击倒的细胞,这个数字增加到10.3% (值,0.01;440年和544年安娜,末期评估职责)。这是一个Nesprin-2特定结果Ne-2 n项KD也导致增强染色质桥形成(445年15.25%,安娜-和末期评估)。染色质桥梁数量的增加在后期被描述为condensin II基因敲除细胞以及condensins I和II耗尽细胞(39,40]。

4所示。讨论

Nesprins研究主要侧重于间期核和他们在核的角色定位,保持机械和结构性能的细胞核,细胞核周围的细胞骨架,和它们在信号转导中的作用1,41,42]。我们发现,在有丝分裂期间Nesprin-2在场以及有丝分裂浓缩DNA。在先前的研究中,我们报告说,Nesprin-2与染色质;在特定的着丝粒和其他异色的读取ChIP-seq丰富的数据(9]。然而,这种互动的性质还不清楚,它很可能是一个间接自Nesprin-2与蛋白质相互作用在染色质组蛋白或SMC等蛋白质。我们这里特别关注与SMC蛋白质。在开放的有丝分裂,不分解(NEBD)开始在前期导致切除不染色质。我们发现Nesprin-2仍与有丝分裂染色体和Nesprin-2击倒细胞存在数量的增加在后期细胞染色质桥梁。

在脊椎动物中,condensins I和II的都是由SMC2/4异质二聚体以及不同的附加non-SMC子单元,CAP-G / G2, CAP-D2 / D3, CAP-H / H2 [18]。损耗condensin I或II或两者的结合引起的海拉细胞导致延迟染色体缩合和隔离问题导致细胞与桥接或滞后染色体(17,41]。在小鼠胚胎干细胞,RNA干扰研究表明condensins I和II ES细胞增殖所需,他们的损失会导致后期启动较晚,和扩大的形成和畸形间期核43]。改变核体系结构和尺寸后condensin II击倒也描述最近[44]。

自从我们提出一个角色Nesprin-2染色体和染色体有丝分裂,我们搜查了出版物报道存在Nesprin-2染色质蛋白质组。Nesprin-2存在于间期染色质(45类别中列出),这是“non-expected染色质功能”,和Nesprin-2肽在一份报告中还发现了在新兴的染色质捕获蛋白质组学(46]。相比之下,在出版物描述有丝分裂的蛋白质组,只有Nesprin-1上市(47]。综上所述,数据从独立的蛋白质组学方法支持我们的研究结果存在Nesprin-2染色质。

基于著名的SMC单体的结构和组装成pentameric环配合物,似乎不太可能预测SMC域在Nesprin-2满足古典SMC蛋白质的作用。SMC蛋白质形式形成和每个二聚体由一个多肽v型拓扑。SMC单体连接铰链区和终端结束形成催化地活跃atp酶(16]。目前,没有Nesprin-2同种型被描述可能存在作为一个单独的同种型SMC组成的域只(48]。可能,而在Nesprin-2 SMC域与SMC2/4螺旋线圈。另外,condensin之间的交互和Nesprin-2是间接性的。有趣的是,Nesprin-2击倒不影响有丝分裂进程但初步数据表明,中期染色体的细胞有一个模糊的外观和更大的体积49,50]。类似的观察了SMC击倒后,这个观察Nesprin-2在这个途径(51]。在这种背景下,Nesprin-2可能采用的作用类似于一个以前提出了NE蛋白在转录调控被认为调节转录监管机构的时空可达性的核目标而不是直接作为转录监管机构在邻近的基因(52,53]。Nesprin-2可能作用于SMC2/4以类似的方式。我们的数据表明,失去Nesprin并没有阻止SMC2/4蛋白质组装以及有丝分裂染色体观察但染色质桥梁的数量增加,暗示着变化的过程中染色体分离。很可能因此Nesprin-2直接或间接影响SMC的时空装配或功能蛋白在染色体。

在我们的分析中,我们发现condensin Nesprin-2交互发生在整个细胞周期。有趣的是,condensins角色不仅在有丝分裂期间,而且在间期,他们很重要尤其是在基因调控。例如,函数在转录调控已经报道了condensins I和II由Li et al。19发现他们有雌激素受体的增强剂α绑定。这导致全面增强剂激活和高效转录的基因(19]。此外,Zhang et al。54)报道,在鸡DT40差别condensin我对这些细胞造成misregulation转录调控的基因表达强调它的作用在间期。相关研究结果早些时候报道秀丽隐杆线虫condensins被发现在tRNA基因、启动子和增强子在间期和第二condensin绑定与压制性影响转录(55]。相比之下,在老鼠胚胎干细胞,condensin二世和cohesin出席转录活跃基因的元素在间期和以积极的方式影响基因活性(56]。

总之,我们报告一个新颖的互动伙伴Nesprin-2巨头和显示Nesprin-2 condensin交互影响有丝分裂染色体。紧包装的染色体在有丝分裂期间,Nesprin-2互动的可能贡献,确保他们的忠实的种族隔离和使他们能够承受力量在隔离。故障在这个过程中会导致DNA桥梁导致染色体分离错误,导致微核的形成,也会引起更多的染色体DNA损伤。极有可能,Nesprins并进一步NE蛋白质导致这条染色体表型。因此,这些蛋白质的突变有可能导致形成不同的临床表现与condensin与疾病相关的57]。此外,由于Nesprin-2 condensin交互也发生在其他阶段的细胞周期和自condensins在间期有附加功能,在Nesprin-2 condensin复杂也可以影响这些过程。

信息披露

现在的地址告诉郝是动物生物技术部门,吉林大学,130062年长春,中国。这部分工作进行博士论文(鑫兴和卡门Mroß)。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突与这篇文章的内容。

作者的贡献

鑫兴和卡门Mroß设计并进行实验,分析数据,数据准备,写了手稿。灵灵,Munck玛蒂娜,亚历山德拉•赫尔佐格,克拉拉莫尔,c·p·Unnikannan, Pranav Kelkar执行额外的实验和分析数据。Sascha Neumann,路德维希Eichinger Angelika a Noegel构思研究,回顾了所有数据,准备最后的版本的手稿,文本和数据。鑫兴和卡门Mroß平等对这项工作的贡献。

确认

鑫兴是由来自中国的奖学金奖学金委员会(CSC),灵灵郝被德意志的奖学金支持Akademische Austauschdienst(德意志)和卡门Mroß属于国际研究生院发展健康和疾病(IGSDHD)。支持的工作是CMMC (C6)和CECAD (TPC05)和由格兰特从河南Sascha诺伊曼和沃尔特Boll-Stiftung。作者感谢m·施莱歇尔博士帮助化学交联,Berthold Gaßen帮忙代单克隆抗体Nesprin-2-SMC,玛丽亚Stumpf与显微镜的帮助,和罗尔夫穆勒对于克隆,蛋白质分析和宝贵的帮助。他们感谢阿斯特丽德博士Schauß和尼古拉Kladt CECAD成像设施和Drs。穆勒和g Rappl质谱法和流式细胞仪细胞排序分析,分别在中央CMMC的设施。

补充材料

补充1。图S1: (a)分析Nesprin-2 SMC的凝胶过滤色谱sds - page紧随其后。Nesprin-2-SMC多肽和卵白蛋白的洗脱图所示。(b) GST-Nesprin-2-SMC推倒Nesprin-2巨头从HaCaT整个细胞溶解产物。几个Nesprin-2多肽由6885个氨基酸的蛋白质被质谱鉴定。氨基酸位置给出确定序列的开始和结束,指人类Nesprin-2巨头(NCBI加入数字:AF435011.1)。

补充2。图S2: (a) Nesprin-2巨人不再被马伯k81 - 116 - 6从HaCaT细胞溶解产物处理shRNA针对Nesprin-2的SMC域和n端。完整的细胞从细胞溶解产物处理指定的可拆卸的质粒被分离梯度凝胶(丙烯酰胺3 - 12%)和探测马伯k81 - 116 - 6。Ne-2 ctrl KD对应于一个炒SMC寡核苷酸。(b) SMC1和SMC3不与GST-Nesprin-2-SMC交互。HaCaT细胞溶解产物(输入)被用于沉淀实验用人销售税,GST-Nesprin-2-SMC, Glutathione-Sepharose珠子,分别如上所示的面板。蛋白质是由sds - page分离丙烯酰胺(10%)和由此产生的西方印迹与抗体探测显示在右边。(c) SMC2和SMC4 Nesprin-2击倒细胞中蛋白质含量不受影响。细胞治疗的完整的细胞溶解产物显示击倒的质粒通过sds - page分离丙烯酰胺(10%)和探测SMC2和SMC4。核纤层蛋白B1作为控制。

补充3。图S3: colocalization Nesprin-2和一个ER标记的有丝分裂细胞。HaCaT细胞沾pAbK1 Nesprin-2和蛋白二硫化物异构酶(PDI)特定单克隆抗体ER标记。DNA与DAPI染色。

补充4。在有丝分裂图S4: Nesprin-2分布。与pAbK1 HaCaT细胞被标记,mAb YL1/2具体α微管蛋白和DAPI DNA。酒吧,5μm。

补充5。图S5: Nesprin-2协会特异性染色体在有丝分裂。HaCaT细胞染色与pAbK1 Nesprin-2 Nesprin-1和马伯k43 - 322 - 2。酒吧,5μm。

补充6。图S6: (a)扩散Nesprin-2-SMC击倒HaCaT细胞。的意思是两个独立的实验。(b)细胞周期进程受Nesprin-2损失的影响。HaCaT控制实验进行了细胞,Nesprin-2-SMC击倒(Ne-2-SMC KD)和细胞治疗控制包含加密序列的质粒。数据显示的三个独立的实验。没有显著差异。米,有丝分裂;S, S期;G0 / G1, G0, G1期。

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