抗氧化水对细胞的生物活性的影响

文摘

据报道,水亲水薄膜的界面形式隔离区,具有更高的密度比普通水。类似的现象观察水化亲水性陶瓷粉,和水变成一个三维细胞样的结构组成的高密度和低密度水。这种结构化水似乎刺激对植物生长的影响。这份报告概述了我们的研究抗氧化性能的结构水及其对细胞生物活性的影响。培养媒体都准备利用这种抗氧化剂结构化水促进了原始的生存能力264.7巨噬细胞细胞三次。相同的趋势被观察到的其他细胞包括IEC-6 t3-l1 C2C12, 3。同时,脾细胞的细胞因子表达取自小鼠脾以同样的方式增加。水似乎也抑制癌症细胞的可行性,MCF-7。这些结果强烈表明,结构化的水有助于正常细胞的活动而抑制恶性细胞。

1。介绍

有很多参数的作用水在细胞和今天的辩论仍在继续1]。大多数这些辩论仍处于起步阶段,集中在水是一个简单的溶剂介质是否多样化的有机组件在细胞质中也起着至关重要的作用2]。顾名思义,大多数研究在分子生物学关注的行为进行分子组件如脂类、蛋白质和其他细胞分子包括各种抗氧化剂。尽管水占据了最大的一部分细胞,它不接受适当的注意力从学术界在生物学和医学,可能是因为水的结构及其对生物活性的影响仍不清楚(3- - - - - -5]。

最近有消息称,有一个水类似于液晶的第四阶段,除了水的三个阶段:固体、液体和气体(6]。这第四阶段发生在亲水材料的界面如电解质®电影沿着极性水分子排列的表面。密度高于普通水以来,微球在悬挂排除水的结构,基于这一现象,它被任命为隔离区(7- - - - - -9]。电势也高达200−mV被观察到在隔离区的边界和外部发展本地区的隔离区(消极的)。这种潜力是由水分子离解成负离子(哦)和质子的结构(6]。这个重要的发现意味着水本身可以影响人类生活的发展和生物活性。

实际上,据报道,一个禁区形成亲水性陶瓷粉,也可以促进种子萌发和早期树苗成长布朗鹰嘴豆种子。根的长度和/或芽的形成增加了至少三倍[2 ~10]。在适当的时候,结构化的水也可能影响细胞的生物活性。确认这种可能性,评估结构水的性质由隔离区及其对细胞的生物活性的影响是必要的。在这项研究中,结构化的水形成的混合与亲水性陶瓷粉被发现有一个抗氧化性质。此外,应对任何参数对任何可能的溶解矿物成分的影响,我们已经开发出另一种方法利用远红外陶瓷粉的雷电波使结构化水以非接触的方式。

这种结构化的水是用来准备文化媒体评估其影响细胞的生物活性,这水似乎有意义的影响正常细胞的生物活性,如细胞生存能力,吞噬活动和自然杀伤细胞活性。相反,癌细胞的生存能力是抑制孵化时相同的介质结构的水做的。这些结果暗示的作用水应该被理解为一个关键组件,而不是仅仅作为一个简单的媒体在一个单元中。

2。材料和方法

2.1。评价抗氧化性质的水

2.1.1。水混合陶瓷粉

亲水性陶瓷粉,QELBY®,颗粒大小范围从40 nm为1μm,从量子获得能源有限公司。它是由细磨长石家族的天然粘土矿物以二氧化硅为主要成分(超过60%)。

评价抗氧化性质,一个极弱光子发射测量使用光电倍增管(滨松光子学,E1341-01)在完全黑暗。图1显示了光子发射测量系统的原理图。

的评价抗氧化性质的水混合粉,三种样本准备。相同数量的豆芽是只与去离子水混合;去离子水混合天然石英粉;分别与去离子水混合QELBY粉。在每个混合粉的浓度为0.01 g / ml。光子排放的数量每一秒是8分钟,平均测量值计算。测量七天每天都是重复的。另外,豆芽的变色同时观察茎。

2.1.2。水处理的非接触方法

无触点对待水,瓶含有50毫升的去离子水被张贴到陶瓷粉一半48小时之前用于培养媒体的准备。去离子水被水净化系统,获得了超纯水I型电阻率为18.2级MΩcm和减少无机物高达99.99%(年轻的林仪器,aqua MAX™超370系列)。图2显示了水处理的原理图以非接触的方式。

评价抗氧化性质的水准备在非接触方法中,光子数是每秒每天测定一次3分钟后添加0.5毫升10毫米叔丁基氢过氧化物(TBHP)到1毫升的去离子水(控制)和非接触治疗去离子水(样本),分别为4天的时间。TBHP,作为有机过氧化物,是一种强氧化剂和激进的形式在o - o键[的分解11]。更稳定与H₂O₂并被广泛用作源细胞自由基的活动以及诱导的氧化应激(12,13]。

2.2。培养基的制备

2.2.1。文化媒体由混合陶瓷粉

为了避免任何可能的污染,QELBY陶瓷粉使用电动马弗炉热处理一小时前在800°C,然后热压处理过的混合与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)。DMEM 10%的热灭活胎牛血清(的边后卫)作为补充和1% penicillin-streptomycin (P / S)是由混合粉状DMEM (Gibco®, 12800 - 017,美国)用去离子水。液体形式DMEM和1%重量浓度的粉末,搅拌5分钟,然后离开2天冰箱保持在4°C。2天后,悬浮层与绘画纸过滤®滤纸(5级)和过滤后的纸的重量测量为了估计总溶解粉末在媒体上。过滤后的DMEM稀释了新的DMEM一定浓度(例如,25、50、100、200、和400年μg / ml)之前准备培养媒体。

粉的浓度在过滤DMEM计算约为700 ~ 750。粉的最终浓度稀释媒体估计低于1 ppm。自然杀伤细胞和脾细胞细胞,RPMI 1640介质代替DMEM。补充图纸SFig。1 ~ 3,在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/1917239显示,媒体的总体图制备和细胞生存能力测量。

2.2.2。文化传媒的水准备非接触方法

另一组文化传媒是准备使用一个结构化的水准备以非接触的方式。离心机锥形管包含50毫升的去离子水被插入到陶瓷粉在室温下48小时或其他指定的持续时间。去离子水处理以这种方式被用来准备培养基与DMEM粉混合。补充图纸SFig。4显示了媒体的总体图制备和细胞生存能力为非接触测量方法。

2.3。评价细胞的生物活性

2.3.1。腹腔巨噬细胞的生存能力

鼠生264.7从朝鲜获得细胞系银行(KCLB、韩国)。腹腔巨噬细胞的可行性评估,它被播种在96孔板的密度1×10⁵细胞在最终成交量为100 /毫升μl和允许坚持3个小时。然后经过1小时10μg / ml脂多糖(LPS)刺激申请前准备的媒体。1小时后,准备媒体随着浓度的溶解QELBY陶瓷粉添加到每个孵化前。孵化进行24小时或48小时37°C湿润有限公司5%₂的气氛。在孵化后,媒体在井吸和100μl的新媒体与10μl CCK-8解决方案添加了每口井,然后孵化在37°C 2小时。细胞计数工具包(CCK-8、Dojindo、日本)治疗后2小时用于测定细胞生存能力使用酶联免疫吸附试验(ELISA)标(瑞士TECAN)吸光度在450海里。作为一个控制,细胞在DMEM培养的可行性LPS刺激测量。与LPS刺激细胞的生存能力是衡量也是一个积极的控制。细胞治疗的可行性表示为控制细胞的百分比。媒体准备的示意图和细胞生存能力评估中所描述的补充图纸SFig。1。

2.3.2。吞噬活动

腹腔巨噬细胞的吞噬活动评估是通过测量中性红染料的吸收。细胞培养在37°C的湿润5%准备媒体有限公司₂24小时,然后100年μl无菌0.075%中性红溶液添加又培养了1小时。结束后文化,板与磷酸盐洗了三次,和100%乙醇和99.9%乙酸的混合物(1:1 v / v)添加到150年μl细胞溶解产物。混合物充分混合,在550海里使用ELISA测定吸光度读者。媒体的原理图吞噬活动的准备和评估补充图纸SFig所示。2。

2.3.3。自然杀伤细胞活性

的评价自然杀伤(NK)细胞活性及脾细胞的可行性,老鼠(C57BL / 6)牺牲和脾脏是无菌收集。准备媒体,0.1克QELBY陶瓷粉混合10毫升的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中含10%胎牛血清(的边后卫)和1% penicillin-streptomycin,站在4°C为24小时。悬浮层在不同的金额用于培养基的制备,例如,25、50、100和200μg / ml新的RPMI 1640介质混合在一起。

靶细胞(YAC-1)被播种在96孔板的密度5×10³细胞/毫升3小时。效应细胞(孤立的脾细胞)和目标细胞混合效应:目标比10:1与媒体准备孵化24小时。NK细胞活性与CCK-8评估治疗后2小时的分析解决方案。NK细胞活动基于光密度计算如下(OD)衡量ELISA读者在450海里。

补充图纸SFig。3显示了整个细胞培养过程和自然杀伤细胞活性测定。

2.3.4。脾细胞和细胞因子表达

收集小鼠脾脏无菌准备脾细胞悬液。脾细胞生存能力的评估是根据CCK-8方法。脾细胞被播种在96孔板1×10⁵细胞/毫升1小时。准备的媒体与不同数量的悬浮层,0,25、50、100和200μ从RPMI 1640 g / ml,与1%的QELBY粉混合站在48小时,被添加到细胞和孵化24和48小时。CCK-8试剂添加到细胞悬液光密度测量2小时后在使用标450海里。

小鼠脾细胞的细胞因子表达的变化测量。脾细胞被播种在6-well板5×10⁵细胞/毫升3小时,然后孵化24小时准备培养基。总RNA提取使用试剂盒®试剂(豆类朝鲜、韩国)根据制造商的指示。一个μg的RNA被用来获取互补DNA(互补)使用提供的协议M-MuLV逆转录酶(Fermentas,立陶宛)逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)。特定的引物被用来放大不同的基因。PCR产品被用1.5%琼脂糖电泳分离和溴化乙锭染色,紧随其后的是紫外线透照。PCR分析做了三次,使用微密度分析车道®1 d软件。β-肌动蛋白(β肌动蛋白),interleukin-12 (il - 12)和移行细胞(INF -γ)表达式进行了分析。

2.3.5。乳腺癌细胞

人类乳腺癌细胞的生存能力,MCF-7,以同样的方式使用两种培养基。悬浮层从预拌DMEM摄于不同数量的1% QELBY陶瓷粉后48小时内的存储在冰箱里维持在4°C。另外,看到水制备过程的影响,DMEM和1%的混合QELBY粉搅拌3分钟,然后在3000转离心5分钟。不同数量的收集上清液,用于培养基的制备。

也准备的DMEM培养基仅使用治疗48小时的水在一个非接触方法用于细胞生存能力的评估。

2.4。统计分析

所有指定数量的实验研究表示在图标题,从 来 ,结果平均数±标准差。在完整细胞活动文化被100%的文化。统计学意义决定使用一个单向方差分析(方差分析)其次是邓肯的多个测试范围。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抗氧化性质的水

3.1.1。水混合粉

的QELBY®粉显示出良好的亲水属性和胶体的形成与水混合时是观察。豆芽的茎与水混合在一个联系方法,光子的数量是没有多少不同的三个标本测量16小时后如图3(一个)。然而,光子排放的数量去离子水与二氧化硅混合粉(红线)增加6天后其次是去离子水(蓝线),如图3 (b)。七天之后,它几乎是相同的,如图3 (c)。相比之下,与去离子水混合QELBY®陶瓷粉(绿线)清楚地显示较低的光子发射即使如图7天3 (b)和3 (c)。表1显示的平均数量超光子发射8分钟的每一秒来衡量豆芽茎与不同种类的混合水准备联系方法。

在去离子水或去离子水混合硅粉如图4(一),4 (b),4 (c),豆芽的颜色是深棕色或棕色。然而,豆芽茎的颜色存储与去离子水混合QELBY陶瓷粉没有显著变化,如图7天之后浅棕色4 (c)。这些结果表明,豆芽茎在去离子水和去离子水混合硅粉氧化速度比存储在去离子水与QELBY粉混合。

为了定量显示颜色的变化,任意单位从1(白色,没有变化)5(深棕色,严重改变)。图5显示颜色的变化与孵化时间,16个小时,6天,7天,豆芽如图4。直到孵化6天,没有区别在颜色只在去离子水和去离子水混合QELBY陶瓷粉末。第二天,第七天的孵化,豆芽的颜色与去离子水混合QELBY®粉几乎没有变化,但在去离子水的豆芽开始发生变化。豆芽的颜色与去离子水混合硅粉迅速改变不断从白色到深棕色从一开始到最后的第七天。

3.1.2。水处理的非接触方法

实验测量表明,去离子水的光子发射增加测量的第二天。在天3和4,光子的数量排放低于第二天。然而,他们仍然高于第一天,如图6(一)。相比之下,光子排放的数量去离子水处理以非接触的方式显示一个戏剧性的减少4天,达到其初始水平的四分之一93 h的暴露后,如图6 (b)。

图7重绘于图中所示的数据吗6直接比较控制数据。16小时后无触点治疗,处理过的水已经显示了较低的光子数量排放控制相比,如图7(一)。这种差异增加后93小时的曝光和大约四分之一的水平控制(图7 (b))。这表明抗氧化性质的水处理以非接触的方式增加曝光时间增加。

3.2。培养媒体对细胞活力的影响

3.2.1之上。培养媒体由混合粉

生264.7巨噬细胞细胞的生存能力以剂量依赖的方式增加的量添加悬浮层,如图8。控制相比,它在媒体200年增加了1.5倍μ克/毫升浓度。细胞的生存能力没有显著差异,不管孵化时间长度(24小时或48小时)。注意所有的样品准备培养基孵育LPS刺激后显示更高的生存能力与样品处理只LPS刺激或孵化LPS刺激。

准备的培养基也增加了吞噬活动如图9。5的浓度的活动几乎翻了一番μg / ml,几乎相同级别的活动保持到80年μ克/毫升。与生存能力不同,剂量依赖的方式并没有观察到。供参考,原始264.5巨噬细胞的活性细胞与LPS刺激只增加约1.5倍比控制。

NK细胞活性测定表明,准备媒体以剂量依赖的方式有积极影响,如图10,导致的介质和200年增加了三倍μ克/毫升的悬浮层。

孵化的小鼠脾细胞与准备的媒体表现出明显的剂量依赖效应的可行性,如图11虽然不如吞噬的戏剧性的活动。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)表明interleukin-12 (il - 12)和移行细胞(INF -)表达式被酝酿与准备媒体调节剂量依赖性,如图12。这个结果证实了增加脾细胞细胞的活动图所示11。

3.2.2。培养媒体准备与水处理的非接触方法

DMEM培养基由混合的粉,只有去离子水以非接触的方式对待,腹腔巨噬细胞的生存能力几乎增加一倍或翻了三倍的长度取决于孵化时间如图13。由于巨噬细胞细胞外刺激敏感的免疫细胞,其他正常细胞巨噬细胞细胞之外,包括鼠形(IEC-6),小鼠成肌细胞(C2C12)和小鼠脂肪细胞(3 t3-l1)孵化以同样的方式来确认是否也遵循同样的趋势。虽然有一些生存能力水平的差异,他们都显示相同的趋势,也就是说,增加细胞的生存能力,如图13。培养时间的影响相比并没有太大的巨噬细胞细胞。未曝光的去离子水制备控制用于所有类型的细胞。

观察不同曝光时间的影响在腹腔巨噬细胞的可行性,培养基制备使用去离子水为6,以非接触的方式治疗12、24和48小时。他们所有人展示了几乎三倍增加生存能力有轻微差异,如图14。这意味着即使是一个短的曝光时间短于6个小时足以增加腹腔巨噬细胞的可行性。

3.2.3。培养媒体对乳腺癌细胞的影响

我们做了相同的实验,观察其对异常细胞的生存能力的影响。乳腺癌细胞,MCF-7孵化以同样的方式和生存能力抑制浓度的方式,如图15。是抑制水平低于80%相比,200年的控制浓度μ克/毫升。同样的趋势在媒体准备的水以非接触的方式对待48小时的EQ在图的酒吧15。

是否有任何影响细胞制备过程的可行性,QELBY陶瓷粉混合的DMEM和离心5分钟后混合粉而不是等待48小时的停工时间。离心后的上层清液用于培养媒体的准备金额不同。结果如图16表明,相同浓度的效果略低,100年和200年μg / ml,相比数据如图15。在400年的浓度μg / ml,生存能力压制几乎70%的控制。这个结果意味着站在48小时的时间可能不需要看到的效果培养媒体准备联系方法。

4所示。讨论

有一个参数对界面水的物理化学性质和可能影响生物活性的可能性取决于细胞膜的疏水或亲水属性和其他细胞的有机组成部分。声称,水与疏水表面会有较低的密度和更好的从水中各种表面活性剂的吸附和蛋白质(14]。这种方法只基于界面水的密度的变化。

据报道,上述的增加光子发射与氧化反应有关。光子的数量排放减少当抗氧化剂组件如儿茶素添加到水(15]虽然增加氧化气氛下16,17]。因此,光子的数量预计将减少排放水和抗氧化剂的财产。在这项研究中,它显然证明了结构水通过亲水性陶瓷粉的混合物准备展品抗氧化剂的财产。抗氧化剂抑制脂质氧化、蛋白质或其他分子组件在细胞18,处理后的一代光子发射也涉及蛋白质和氨基酸的氧化豆芽茎(19]。这不仅表明,水的密度的变化,而且一个电气特性可以水的作用的一个关键因素。事实上,它已经发现,一个电势存在高达200−mV在禁区之间的边界和本地区以外的隔离区(消极的),除了密度的差异(6]。

有趣的是,以非接触的方式还演示了一种抗氧化剂处理的水属性如图6和7。抗氧化剂水平的财产增加曝光时间较长的。的能源结构水的形成以非接触的方式可能是陶瓷粉的红外线辐射(20.- - - - - -22]。这种技术是非常重要的实验结果分析因为只有水的结构修改组件的水没有任何添加材料。

水结构的修改似乎是一种连续的和渐进的现象。根据实验结果处理后的光子发射(数字6和7),以非接触的方式进行了93个小时,水可以结构化持续很长一段时间通过长时间接触粉末。然而,曝光时间对细胞活力的影响表明,不到6小时就足以获得生存能力的增加原始细胞(图- 264.714)。这意味着它可能不需要一个高度结构化的水通过治疗时间用于生物。换句话说,细胞结构非常敏感的水,这是支持的事实,即使是少量的预混合的结构水,0.5%(图9),是有效提高吞噬活动。此外,结构水是足够稳定显示这些影响,即使与一个新的混合新鲜培养基和动摇。只有少量的结构化的水有必要增加生物活性的细胞,如图8。

培养媒体与QELBY混合粉末或用抗氧化剂结构化水准备展览增加正常细胞的可行性。认识到同一趋势观察两种媒体准备通过与QELBY混合粉或与去离子水混合治疗以非接触的方式,实验结果报道在这里必须解释为相关的抗氧化特性修改生成的水结构,而不是材料组件。

预计活性氧清除效果可能会通过这个媒体其他营养抗氧化剂23- - - - - -26]。因此,线粒体膜的电子传递链可能被激活,导致正常细胞的生存能力增加。考虑到CCK-8化验设备的原则,这个解释更有说服力,因为甲瓒染料形成CCK-8四唑盐的解决方案是减少了电子传递链中的脱氢酶。

另一种可能是在质子浓度增加。当电势产生的禁区和外部之间,大量的质子生成以外地区(6]。这意味着质子时可以提高水的供应结构。考虑到线粒体膜电位,Ψm,由电位离子和质子梯度,质子数量的增加可能导致增加的Ψm。实际上,据报道,Ψm生264.7增加了1.36倍,HD11细胞暴露他们QELBY粉后48或72小时(以非接触的方式27]。增加Ψm可能有助于提高生存能力和增加ATP生产。然而,这不是观察这些细胞。

另一方面,相同的培养媒体恶性肿瘤细胞显示了相反的趋势。这是一个很有趣的现象,因为相同的刺激器结果相反的反应取决于细胞,正常或恶性的。此时,机制尚不清楚,但增加Ψm可能为进一步的研究提供线索。根据以前的报告,观察Ψm增加也为海拉细胞超过1.36倍,而细胞内的ATP水平下降后72小时的接触(27]。众所周知,癌症细胞有更hyperpolarisedΨm比正常细胞(28- - - - - -32),可以比正常细胞(大于50%33]。据报道,10%的价值变化的最佳Ψm可以导致严重的可变性ATP合成,由一样大减少了90% (34]。因此,hyperpolarityΨm癌细胞的可能与电子传递链的故障,也就是说,氧化磷酸化。华宝报道,癌症细胞的新陈代谢发生通过有氧糖酵解与正常细胞不同,它依靠有氧呼吸(35]。Ψm的增加与减少ATP生产的海拉细胞培养与QELBY粉以非接触的方式暗示Ψm变化是癌细胞的生存能力下降的原因,MCF-7。肯定,实验效果的结构化水潜在Ψm需要一个详细的机制。

已经声称继续氧化应激可以导致慢性炎症,进而调节大多数慢性疾病包括癌症(36,37]。在这个报告中,结构的抗氧化性质的水,增加生存能力和细胞因子的表达,抑制癌细胞。更详细的抗炎作用QELBY粉也被报道(其他地方38]。据推测,这些结果,抗氧化,抗炎,和抗癌效果QELBY陶瓷粉,是彼此密切相关。此外,它是发现DNA暴露QELBY免受自由基造成的损害(27]。这些结果表明,未来研究的影响QELBY应该关注其整体整体影响生活的身体而不是集中在分子水平细胞周期监管体系。

再一次,这些结果强烈表明,水在细胞代谢中起着至关重要的作用,比预想的更多。水不仅仅是一个简单的液体,而是扮演着一个重要的角色在细胞和分子机制的正常细胞的刺激增强生物活性,同时抑制恶性肿瘤细胞。所有这些结果强烈的积极作用结构细胞生物活性的水。

5。结论

实验研究结果表明,培养基的物质营养成分和水结构可以关键因素分析细胞的生物活性。结构水,准备通过与亲水性陶瓷粉混合,或治疗以非接触的方式,表现出抗氧化性质。细胞生物活性的增加是密切相关的抗氧化性质结构水。结构化的水似乎表现出相同的属性作为一种抗氧化剂。因为没有抗氧化成分被添加在非接触的水处理方法中,这些属性仅与水的结构。这些实验结果强烈表明,水可以在细胞生物活性起着关键作用,根据其抗氧化效果,根据它的结构。水本身可以是一个活性组分在细胞生物学,和许多其他的细胞分子。

信息披露

资助者没有任何额外的角色在研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。资助者只提供金融支持和研究资料。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Min先生年轻安对细胞生存能力进行实验测量。提供的金融支持量子能源有限公司纽约州立大学韩国,韩国先进的科学和技术研究所和韩庚国立大学我将非常感谢。

补充材料

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