促血小板生成素分泌人类卵巢癌细胞

文摘

促血小板生成素(TPO)基因表达在人类卵巢从卵巢癌症患者和癌症细胞,以及一些癌症细胞系包括MDA-MB231(乳腺癌)、K562和HL60(白血病细胞),OVCAR-3NIH和SKOV-3(卵巢癌),进行使用RT PCR、实时PCR和基因测序。人类肝脏组织作为控制。房产申诉专员署在细胞和其监管的存在通过活化蛋白C被流式细胞术研究。传真照片内容的细胞提取以及等离子体的卵巢癌患者被ELISA评估。传真照片的功能表现在coculture的可行性的基础上TPO-dependent细胞系(Ba / F3) MTT测定,Annexin-V标签。如肝脏、卵巢组织和所有癌症细胞行除了MDA-MB231表达三个TPO-1(完整的传真照片),TPO-2 bp删除(12)和TPO-3 (116 pb删除)的变体。原发性卵巢癌细胞以及肿瘤细胞株产生传真照片。促血小板生成素的生产由aPC OVCAR-3增加当细胞受到刺激。OVCAR-3细胞的上清液可以替代外源性传真照片和抑制TPO-dependent细胞系(Ba / F3)细胞凋亡。产生的促血小板生成素肿瘤可能直接影响血小板增多/血栓发生卵巢癌患者。

1。介绍

血栓形成是一个主要的并发症在恶性疾病1,2]。50多年前,莱文和康利报道,血小板增多与乳腺癌、肺癌、消化和卵巢癌3]。止血疾病癌症的结果能力的肿瘤细胞分泌促凝血的因素和与血液成分如血小板(4,5]。而血小板正常止血至关重要,他们肆无忌惮的激活可能会导致血栓形成导致血小板增多的并发症。此外,血小板升高的患者有更高的风险患静脉血栓栓塞(6]。

旁边的凝血作用,血小板也参与各级肿瘤生长和传播(7]。因此,激活血小板视为lysophosphatidic酸(LPA)的一个重要来源,这已被证明是参与促进骨转移模型小鼠的轴承乳腺癌或卵巢癌细胞(8]。

促血小板生成素(TPO)是一个关键调节器megakaryopoiesis和巨核细胞的祖细胞增殖通过促进干细胞分化成巨核细胞和他们的扩张,因此,提高血小板生产(9,10]。

房产申诉专员署主要由肝脏也是由肾脏分泌的,骨髓和脾11]。人类TPO基因局部3号染色体上问,由6个外显子和五个内含子12- - - - - -14]。迄今为止,8房产申诉专员署mRNA已确定的不同变体,包括全长mRNA (TPO-1)及其7可变剪接变体。增殖活动强调只有在TPO-1同种型(15]。

此外,传真照片似乎megakaryopoiesis调节器。的确,传真照片被承认为一个至关重要的监管机构的猪卵巢滤泡细胞增殖和分泌活动(16]。在病理条件下,一些癌症细胞系从肺、胃、肝脏和甲状腺人类癌表达TPO基因(17]。病例报告,Furuhashi等人报道,传真照片可能是由卵巢癌(18]。Tsukishiro和他的同事发现,在比较研究中,血浆TPO浓度可能是一个生物标志物,区分良性肿瘤患者和那些恶性卵巢癌(19]。已经描述的传真照片增加了炎症过程介导的il - 6水平,由巨噬细胞和单核细胞,剂量依赖性增加房产申诉专员署mRNA水平肝癌细胞系(20.]。然而,存在thrombopioetin通过免疫组织化学方法检测是由于促血小板生成素的捕获由于促血小板生成素受体表达在人类癌症细胞21]。

以前,我们检测到传真照片发布在一个腺癌细胞系培养基(NIH: OVCAR-3细胞系:缩写OVCAR-3在这项研究)。我们还观察到激活蛋白C (aPC),一种天然的抗凝剂,增加OVCAR-3传真照片分泌(22]。

本研究的主要目的是分析TPO基因表达在卵巢癌和评估癌细胞产生的卵巢传真照片是否功能。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

2.1.1。细胞系

使用的人类癌症细胞系是卵巢(OVCAR-3低分化浆液性癌细胞系和SKOV-3 endometrioid癌症细胞系),乳房(MDA-MB231和MCF7),胃(AGS KATO-III),肠(LS174T)、肺(A549)、白血病(骨髓白血病K567和早幼粒细胞白血病HL60)和颈(海拉)。我们也使用人类微血管内皮(HMEC-1)和interleukin-3——(IL-3)依赖小鼠(Ba / F3)细胞株。细胞系来源于美国类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。Ba / F3细胞系表达了人类促血小板生成素受体(MPL)请提供的卡罗琳·马蒂和伊莎贝尔巴解组织(23]。heat-inactivated RPMI 1640培养基培养细胞含有10%胎牛血清的边后卫,50微克/毫升的链霉素,50个国际单位/毫升的青霉素、和2 nM谷酰胺(Gibco、圣奥宾、法国)。细胞培养在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。

2.1.2。的媒体

细胞被播种在盘子或烧瓶,confluency增长至80%,然后在无血清培养基培养。三个化验文化条件:(1)存在的蛋白C (PC) (Protexel、Courtaboeuf、法国)的浓度为10µg / ml,(2)存在的活化蛋白C (aPC) (Xigris、Suresnes、法国)也在10的浓度µg / ml,(3)没有任何控制。细胞烧瓶孵化前5小时流式细胞术分析细胞板被孵化24小时coculture实验。Ba / F3细胞株培养的(1)重组IL-3 (5 ng / ml) (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier,法国),(2)重组人促血小板生成素(TPO) (50 ng / ml)(美国寿命生物科学),(3)电脑(10µg / ml), (4) aPC (10µg / ml)。

2.1.3。评估ELISA的传真照片

文化后,细胞被小心翼翼地清洗磷酸盐(PBS),然后没有胎牛血清细胞培养在培养瓶或额外的生长因子。18小时后收集细胞和溶性提取物进行传真照片的决心。TPO量化使用商用ELISA (R & D系统Quantikine人类房产申诉专员署酶联免疫试剂盒,阿宾顿,英国),根据制造商的说明细胞培养上清液。研究结果表示在pg / ml / 1×10⁶细胞。

2.1.4。Coculture癌细胞和Ba / F3细胞

OVCAR-3 MDA-MB23 1和K562培养在底部两个细胞培养箱内相隔0.4µ米微孔膜(费舍尔科学、Illkirch、法国)和Ba / F3细胞培养上隔间。

2.1.5节讨论。腹水患者的细胞培养

腹水的液体从患者消化Lariboisiere医院提供的(法国巴黎)。所有的病人给他们书面知情同意。临床和生物学注释是记录在一个批准的Access数据库”委员会国家de l 'informatique et des自由,法国。“总共6癌症患者被纳入研究。医疗记录报道,4病人从卵巢癌症的起源。只有一个病人胃印戒细胞癌。所有患者承认手术期间从2014年10月到2015年2月。每个腹水的示例是离心机和细胞颗粒获得培养在烧瓶内涂上0.2%的明胶(σ,法国)DMEM培养基(GIBCO、圣奥宾、法国),补充20%的heat-inactivated胎牛血清的边后卫,50微克/毫升的链霉素,50个国际单位/毫升的青霉素、谷酰胺和2海里。

2.2。基因表达

2.2.1。引物选择、PCR和Nested-PCR

传真照片引物PCR和nested-PCR,选择从佐佐木等人的研究17]。我们的选择是基于TPO基因结构及其可能的剪接变体如图1(一)和1 (b)。房产申诉专员署形成的特定的引物欧陆坊基因组学(Ebersberg,德国)。引物用于PCR和nested-PCR图所示1 (c)。房产申诉专员署基因表达的检测是研究利用F1 / R1组引物放大在公共产品(所有传真照片拼接变体)。我们也进行PCR -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),确保完整性和互补脱氧核糖核酸的定量比较。GAPDH cDNA放大使用特定的引物(G1 / G2)从欧陆坊基因组学(图1 (c))。TPO基因表达检测研究的传真照片信使rna在细胞来自患者的腹水文化或细胞系。细胞RNA提取准备使用RNeasy工具包(试剂盒、Courtabœuf、法国)。卵巢总核糖核酸和肝脏互补脱氧核糖核酸从人类成年组织是由BioChain nontumor(美国纽瓦克)。反转录后(Mu-MLV逆转录酶和益生元(dT)引物),聚合酶链反应(PCR)进行的MasterMix(5 ',杜塞尔多夫,德国)。PCR产品(使用F1 / R1引物,图1),以及一个100个基点DNA梯,在琼脂糖凝胶电泳分析包含GelRed核酸凝胶染色。电泳分离的产品后,我们有选择性地切除只对nested-PCR强烈的乐队。DNA筛选了并使用DNA凝胶萃取纯化工具包(一起Biotek集团,安大略省,加拿大)。Nested-PCR执行使用F2 / R2或F3 / R3引物,产品被琼脂糖凝胶电泳分析。DNA的乐队感兴趣的又一次选择,切除和DNA纯化。纯度和浓度的RNA或DNA样本测定光密度测量和的比例260:280海里使用NanoDrop™2000 c分光光度计(热费希尔科学、法国)。

2.2.2。测序Nested-PCR产品

Nested-PCR欧陆坊产品中提取DNA测序的基因组(Ebersberg、德国),使用循环测序技术(双脱氧链终止/循环测序)ABI 3730 xl测序仪。序列分析的基本局部比对NCBI数据库中搜索工具(爆炸)。

2.2.3。实时聚合酶链反应

TPO基因表达也分析了实时PCR和TaqMan®引物与家人探针传真照片或GADPH(图1 (d))是应用生物系统公司(法国)。实时PCR进行使用TaqMan基因表达分析和LightCycler®96实时PCR系统(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。使用比较基因表达进行了分析方法(24]。

2.3。流式细胞术

2.3.1。蛋白定量

OVCAR-3和MDA-MB231无血清培养系统在烧瓶和孵化有或没有PC / aPC刺激如上所述。所提供的蛋白质运输抑制剂,包含Brefeldin-A, BD生物科学(Le Pont de Claix、法国),添加(1µl /毫升)的培养基。细胞分离与accutase,用磷酸盐(PBS)洗净,悬浮在100% heat-inactivated的边后卫。使用Perfix-nc细胞固定和透化作用过程进行检测设备的制造商(贝克曼库尔特、法国)。细胞混合与anti-hTPO起初主要抗体(1:200)(Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier,法国),然后用PBS,孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)耦合的二次抗体(1:100)。细胞被洗两次,小球在500年resuspendedµl工具包中提供的缓冲区。流式细胞术是通过使用一个标准的第二章eight-color流式细胞分析仪(生物科学正欲、法国)在530 nm和数据分析使用Flowjo软件(美国Flowjo LLC)。

2.3.2。细胞生存能力

Ba / F3细胞与MDA-MB231 OVCAR-3或单独cocultured K562细胞,存在与否的10μg / ml PC或aPC,如上所示。与IL-3 Ba / F3细胞培养,传真照片,电脑,或者aPC和担任控制。72 h后,Ba / F3细胞收集从每个好,用PBS洗净,然后用4%的固定(最终浓度)甲醛。然后,Ba / F3细胞悬浮在冷绑定缓冲(10毫米消息灵通的pH值7.4,140 mMNaCl, 2.5毫米氯化钙,0.1% BSA),孵化15分钟在4°C FITC共轭Annexin-V(美国伯明翰SouthernBiotech),并从光屏蔽。数据采集和分析进行了流式细胞术如上所述。

2.4。MTT可行性测试

Ba / F3细胞cocultured OVCAR-3或MDA-MB231or K562细胞PC或aPC的存在。Ba / F3细胞培养与传真照片,作为控制。72 h后,Ba / F3细胞可行性研究使用噻唑基溴化四唑蓝比色测定(MTT)根据恩等人协议(25]。

2.5。统计分析

所有的值是平均值±SEM报道。统计学意义是决定使用GraphPad Prism 6.0软件(克鲁斯卡尔-沃利斯检验/学生的以及)和被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。房产申诉专员署表达式卵巢癌症的主要文化和细胞系

TPO基因表达进行了分析从腹膜液体培养细胞收获六个病人患有癌症。临床特点的病人在图进行了总结2(一个)。照片从每个病人培养细胞呈现在图2 (b)。rt - pcr分析显示,与印戒细胞,从卵巢细胞起源TPO基因(图表示2 (c))。延长这一分析,我们检查传真照片各人类癌症细胞系的基因表达。结果显示不同的传真照片表达的细胞系认为:卵巢(OVCAR-3和SKOV-3)和白血病(K562)癌症细胞系表达传真照片在高水平;KATO-III胃(AGS),肠(LS174T)、肺(A549)和颈(海拉)癌症细胞系表达传真照片在一个非常低的水平;传真照片无法检测到基因表达在人类乳腺腺癌(MDA-MB231和MCF7)和在人类微血管内皮细胞系(图(HMEC-1)3(一个))。房产申诉专员署基因表达被发现在正常卵巢组织低于在肝脏。

3.2。积极的传真照片细胞系表达不同的记录模式,包含传真照片

我们接下来相比不同的传真照片拼接变体在癌症细胞系)阳性TPO升高表达式(OVCAR-3、SKOV-3和K562)和控制卵巢组织。结果表明,所有癌症细胞线表达的三个TPO-1(完整的传真照片),TPO-2 bp删除(12)和TPO-3 (116 pb删除),类似于肝脏和卵巢控制组织(图3 (b))。自从拼接有限数量的核苷酸变异不同,这些变异的存在证实了测序。值得注意的是,测序数据显示TPO-3变体存在C / T 5183个SNP(图4(一)),是一种常见的突变对所有克隆(14),不影响最终的蛋白质序列。

我们进一步量化的房产申诉专员署形成OVCAR-3卵巢癌细胞,由腹膜癌的细胞),以及白血病细胞K567和HL60。MDA细胞被用作控制。结果呈现在图4 (b)表明卵巢癌的可溶性提取TPO水平显著高于控制。

3.3。通过活化蛋白C的监管传真照片生产

因为我们之前显示aPC-stimulated OVCAR-3传真照片由细胞因子产生array [22]中,我们进一步研究了传真照片表达的调节PC和aPC评估定量PCR OVCAR-3刺激前后的蛋白C (PC)或活化蛋白C (aPC)。结果表明,无论是电脑还是aPC对房产申诉专员署mRNA水平(图有任何影响5(一个))。进一步探索房产申诉专员署生产,我们在各种条件下分析房产申诉专员署蛋白质含量流式细胞术。我们认为MDA-MB231细胞系作为负控制(图5 (b))。我们观察到的传真照片内容OVCAR-3 PC刺激前后细胞相似。然而,房产申诉专员署分泌显著增加细胞孵化时aPC(图5 (c))。结果比较TPO OVCAR-3细胞间蛋白质含量的有或没有一个蛋白质运输抑制剂(图5 (d))允许得出传真照片是由细胞分泌的。

3.4。OVCAR-3分泌功能传真照片

评估是否传真照片从OVCAR-3细胞功能,TPO-dependent Ba / F3细胞株与OVCAR-3 cocultured,在电脑或aPC的存在与否。Ba / F3 cocultured MDA-MB231细胞,不产生传真照片与K562(控制)或产生高水平的传真照片或与电脑单独培养,aPC、外生传真照片,或interleukin-3 (IL-3)。Ba / F3细胞生存能力评估在各种条件的MTT测定和Annexin-V标签。Ba / F3细胞在每个条件的可行性与Ba / F3细胞孵化与外生传真照片。结果表明Ba / F3细胞相同的可行性与OVCAR-3 cocultured时细胞有或没有电脑刺激但cocultured OVCAR-3刺激时增加了aPC。

除了Ba / F3孵化IL-3(数据时也活了下来6(一)和6 (b))。使用MTT试验,我们评估的传真照片由OVCAR-3刺激或不是由aPC,通过比较的生存Ba / F3细胞孵化与异种的传真照片和cocultured aPC-stimulated OVCAR-3(图6 (c))。相对房产申诉专员署分泌(ng)表示在图6 (d)。

这些观察表明,通过aPC TPO分泌物是由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GBFI)。

4所示。讨论

这里给出的结果确认正常卵巢组织以及卵巢癌细胞表达传真照片显示传真照片首次由肿瘤细胞功能。这些结果提供了新的见解癌症和止血障碍之间的关系。

血小板增多与恶性疾病有关,传统上,由于白细胞介素- 6 (il - 6)和集落刺激因子(26- - - - - -28]。石等人表明,il - 6可能单独行动以旁分泌的方式增加肝促血小板生成素的生产,从而增加血小板计数(28]。

此外,萨卡尔等人证明传真照片及其受体的表达c-MPL牛卵泡。他们还表明,传真照片和黄体c-MPL表达式和生产,在发情周期,取决于黄体期(29日]。因此,国产传真照片和c-MPL可能起到至关重要的作用在调节发情周期期间血小板生成。

此外,血清TPO水平更提高卵巢癌的女性比那些良性卵巢囊肿(19,30.]。在这里,我们表明,正常卵巢组织,卵巢癌结节,卵巢癌细胞株,尤其是OVCAR-3表达传真照片。这些结果让人联想到从初步观察在卵巢癌18]。

房产申诉专员署癌症细胞系的基因表达不同起源也不是相同的。卵巢或白血病细胞系表达更多的传真照片。奇怪的是,rt - pcr和流式细胞仪观察到,从卵巢癌结节TPO提取量高的细胞系OVCAR-3或骨髓白血病K567和早幼粒细胞leukemiaHL60细胞系。相比之下没有传真照片从乳腺癌细胞系(MDA-MB231),相比之下,卵巢或白血病细胞。以前我们发现OVCAR-3细胞与活化蛋白C孵化时,癌细胞迁移是调节通过mek erk和Rho-GTPase通路信号作用[31日)和培养基检测到细胞因子的分泌传真照片数组增加四倍(22]。在nonpublished结果,我们也证明了活化蛋白C和,在较小的程度上,蛋白C诱导微粒释放OVCAR-3细胞系。这里我们观察到一个upregulation传真照片合成的培养基中活化蛋白C的存在。有趣的是,当癌细胞preincubated与Brefeldin-A aPC的存在,一种抑制剂的蛋白质运输从内质网到高尔基体(32,33),传真照片分泌抑制。这些观察表明,通过aPC TPO分泌物是由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GBFI)。

在平行研究中,TPO水平卵巢癌患者的血浆()显著增加,而正常血浆TPO水平(结果未显示)。

TPO基因的序列分析材料在卵巢癌细胞细胞系确认线以及白血病细胞表达了三个TPO-1(完整的传真照片),TPO-2 bp删除(12)和TPO-3 (116 pb删除)的变体。我们没有观察到任何修改的基因序列与肝脏和卵巢来源。TPO-3变体(C / T 5183 SNP)是一种常见的突变。

关于房产申诉专员署由卵巢癌细胞分泌机能活动分析,我们发现卵巢癌细胞系的coculture条件中等TPO-dependent Ba / F3细胞系可以减少Ba / F3由于房产申诉专员署OVCAR-3细胞分泌细胞凋亡。

此外,我们报告第一次,TPO基因的表达模式在卵巢癌细胞类似于观察肝脏,最重要的是,TPO生成功能。

这些结果有两个主要的临床意义。(我)首先,传真照片可以作为生物标志物的检测和卵巢癌的病理过程。事实上,数据显示假说,TPO-secreting卵巢癌细胞大大加剧海拔传真照片卵巢癌患者血浆水平。进一步的研究应该执行建立定量房产申诉专员署等离子体水平和癌症进展之间的关系。(2)第二,生产功能性传真照片的卵巢癌细胞可能是负责血栓栓塞的风险或在卵巢癌患者血小板增多。在这样一个背景下,最有可能的是癌细胞产生的传真照片直接采取行动促进血小板的扩张。

的利益冲突

作者没有利益上的冲突。

确认

作者要感谢博士尼古拉Vodovar (Lariboisiere医院,U942、巴黎、法国)为他宝贵的援助。作者深深地感谢阿姆河Therwath教授(Lariboisiere医院,U965、巴黎、法国)为所有他的帮助和指导。作者也承认安妮Munier (IFR 65细胞排序和流式细胞术平台,巴黎,法国)流式细胞术分析她的帮助。

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