高灵敏度的方法来估计分布的透明质酸分子尺寸小生物样本使用气相分子电泳淌度分析

文摘

透明质酸是一种带负电荷的多分散的多糖,其规模和组织浓度在许多生理和病理过程中发挥重要作用。透明质酸的各种功能取决于其分子大小。到目前为止,它已经很难研究透明质酸的作用在疾病病理变化在细胞外基质可用性较低或组织样本很小。难以获得足够大的从人体病变组织或组织活检动物模型也限制了透明质酸的研究。在本文中,我们表明,气相分子流动电泳分析仪(芽)可以用来估计透明质酸分子大小的分布与数量有限的透明质酸生物样本。吉玛的检测水平低的透明质酸分子大小的估算方法允许小器官的不同部分。因此,吉玛方法打开的机会获得一个概要文件的透明质酸分子大小和分布估计的变化引起的疾病或实验条件,不可能获得。

1。介绍

透明质酸(HA)是一种带负电荷的多糖组成的无支链的重复的二聚体N-acetyl-D-glucosamine D-glucuronic酸(1]。unsulfated,相比其他葡糖氨基葡聚糖,很少存在蛋白质共价结合。多分散的分子,通常平均分子量在200 - 2000年间kDa但它可以发生10⁷达作为一个分子(2]。

在脊椎动物中,到目前为止,三个HA合成酶,HA合成酶1、2和3 (1 - 3)3,4)和大约三分之一的HA总额每天都翻了。退化发生酶通过透明质酸酶(HYAL)或氧化。在人类中,有6个基因HYAL 4可以产生功能酶(5]。

HA存在于各种形式的组织身体:蛋白质分子必将hyaluronan-binding自由流通,松散与组织或固定在细胞膜受体。HA绑定到蛋白质的一个复杂的有不同的属性和功能根据其分子量、浓度和蛋白质(6- - - - - -8]。哈哈还可以与细胞膜受体结合,例如,CD44,通过细胞内信号调节细胞增殖、迁移,和炎症(9]。

HA的各种功能取决于其分子量(10- - - - - -16]。高分子量(高分子量)哈,所谓的原生哈,在某些情况下被证明有相反的效果相比,分散哈(17,18]。如果HA的合成和降解之间的平衡是中断,支离破碎的低分子量的积累(流明瓦)哈就可以形成。这通常是有害的组织,然后导致病理状态。

理解哈在病理条件下的作用,以及在发展过程中,重要的是要分析其分子大小分布可靠方法也适合少量的组织和体液。

气相分子流动电泳分析仪(芽)(TSI公司,MN)最初建立了球状蛋白质和蛋白复合物(相对较弱19,20.]和我们以前所示体外的方法也可以用来估计HA分子大小的测定(21]。方法利用微分流动分析仪来确定电泳淌度(EMD)的单个带电分子在空气中,保留时间成正比,因此电泳和分子直径大小、粒子。吉玛的优点是检测水平低,可以实现可靠的吉玛分析以50 ng / mL的HA浓度或更少,在小样本不超过20卷μL (21]。样品浓度低也确保了分析是在浓度远低于HA域重叠发生的临界浓度(22]。

由于HA的物理性质和形状依赖吉玛的方法,实现高分辨率的流明瓦范围比高分子量范围哈(21]。吉玛容易分离流明瓦哈ca 100 kDa,而高分子量的分辨率较差。然而,在生理或病理的研究样本通常这不是一个劣势。方法仍然分离高分子量流明瓦哈,分辨率高,正是这种流明瓦政权公顷大小显示强大的细胞信号的影响。

吉玛的检测水平低的方法打开新的机会研究HA分子大小分布在疾病尚未组织可能的研究。在本文中,我们表明,吉玛方法可用于估计HA分子量分布与数量有限的HA生物样品,如小活检只有几毫克的组织。

2。材料

成年白来航鸡鸡从商业人口控制在动物饲养和维护设施国家兽医研究所的乌普萨拉,瑞典。矢状样本收集从中间梳的一部分。这些样本被冻结在−80°C。动物实验伦理委员会的批准在乌普萨拉是获得所有的实验都涉及鸡(C307/11)。

心脏从野生麋鹿从本地驼鹿猎人是一种礼物。心一直在−20°C和心肌隔组织样本进行分析。

人类心肌隔组织来自奥斯陆,挪威,从心脏捐赠者拒绝手术的原因。心肌被保存在冰与后续冻结1 - 4小时前组织抽样−80°C。从区域获得批准研究伦理委员会(地区Etisk Komite)在挪威。

肾组织切除从成人Sprague-Dawley老鼠和样本内髓质(乳头)被冻结在−80°C。动物实验伦理委员会的批准在乌普萨拉获得所有实验中老鼠(C169/11)。

除了野生麋鹿,所有的动物在这个项目是由训练有素的人员和饲养根据农业的瑞典委员会的指导方针。

3所示。方法

3.1。隔离和净化的哈

隔离HA从组织样本稍微修改协议从图戈et al。23使用了)。根据样本,5 - 60毫克的湿纸巾是用真空旋转蒸发器(表干1)。当组织完全干,他们被磨均质。

下面是一个简单的协议的总结。

在均质组织蛋白酶K消化蛋白质(Sigma-Aldrich)是用于去铁胺甲磺酸包含缓冲区,以防止公顷退化。HA在氯仿提取液液萃取,被乙醇沉淀(EtOH) 99%。

消化核酸,HA含颗粒的溶解在一个缓冲区包含benzonase (Sigma-Aldrich)其次是消化的软骨素chondroitinase ABC (Sigma-Aldrich)。为了避免消化HA的软骨素消解时被允许进行到底在37°C(10分钟24]。氯仿提取和乙醇沉淀的重复。

原油HA-samples未纯化的阴离子交换minispin列(热科学)。把盐,筛选了HA分数透析彻底反对20毫米醋酸铵的pH值8.0。最后能整除的是准备吉玛根据表分析和随后被稀释1。自吉玛方法不是特定哈,鸡梳的净化前后被杰玛检查杂质分析透明质酸酶治疗。

3.2。分子量与吉玛分析评估

所有使用吉玛HA分子量分析。根据组织起源、样本大小和初始浓度HA样本稀释吉玛分析前1至100倍。所有吉玛的最终体积测量调整ca 20μL开始之前的测量,每个芽运行使用125年和300年之间问的样本。所有吉玛测量进行所述在白垩土等。21)唯一的例外,微分流动分析仪(DMA)调整扫描电泳淌度的分子,直径在1.72和54.2之间而不是2.55和25.5 nm。

4所示。结果

显示吉玛的潜力分析哈研究我们展示的例子哈大小分布在四个不同的组织和物种,心脏组织从人类和野生麋鹿,鸡梳子,鼠肾脏。

分析所需的重量大约是50毫克湿重心脏和肾脏和ca 20毫克鸡梳子样本。纯化HA提取心脏和肾脏都不必稀释而鸡梳子公顷需要100倍稀释前分析仪器(表的防止过载1)。HA分子大小分布的差异观察之间的所有样品。吉玛的原始数据分析报告的电泳淌度直径(EMD)不同的样品。EMD分子量通过分析HA为标准从Hyalose L.L.C.(图1)[21]。HA驼鹿心脏和鸡肉梳都表明统一山峰EMD 7.2 nm左右,这是符合高分子量公顷ca 5000 kDa。相比之下,HA从鼠肾脏均显示高分子量峰的麋鹿和鸡肉样品,和另外一个宽峰中心EMD 5.2 nm左右,对应于一个低分子量的ca 30 kDa [21]。人类心脏还显示存在同一范围的流明瓦哈大鼠肾脏的高分子量公顷内容大小明显大于其他三个示例所示。

5。讨论

本文给出了一些例子,说明了杰玛的独立能力从高分子量公顷流明瓦小生物样本。这开辟了可能性研究的参与流明瓦哈在病理条件下,以前不可能由于缺乏材料。

吉玛的强度与其他方法相比HA分子大小确定检测水平低。证交会与multiangle光散射(mal),沉积技术,流field-flow分馏或凝胶电泳通常的检测极限> 0.01毫克/毫升(25- - - - - -28]。自从吉玛方法至少敏感200倍,可以分析非常少量的组织,例如,比较左和右墙在一只老鼠的心脏。吉玛因此可以用来估计HA的分子大小分布在低浓度的样品,东西从小型组织样本中提取HA时是至关重要的。然而,如果还需要更多的精确分子量测定和足够的材料是可用的,然后,例如,凝胶电泳更适合[29日,30.]。

正如所料,驼鹿心脏组织和成年鸡梳子显示高分子量HA含量约5000 kDA。相比之下,除了本地的高分子量HA在大鼠肾内髓质,很大一部分流明瓦哈约30 kDa也发现。透明质酸酶2的超表达或透明质酸酶1缺乏可能导致分散积累流明瓦哈对于此示例。然而,在肾脏的HA变化迅速根据身体水合作用,以及一个广泛的营业额的HA脱水肾脏是可以预料到的31日]。因此,自组织分析在本研究从脱水老鼠,支离破碎的HA的大部分是预期。

分析HA标准和梯子从Hyalose L.L.C.也显示,最大的分子量(6 MDa)没有一个EMD 9 nm(数据未显示)。人类心脏的吉玛光谱样本显示峰值中心EMD ca 9 nm,指示异常大的哈。这可能与蛋白质交联哈分子或哈交联。后一种情况表明交联蛋白的保护从公顷退化在提取过程中屏蔽。

我们已经看到这个非常高分子量HA在样本很小的鸡库姆斯(数据没有显示)。因此,很可能这个非常高分子量HA提取只能从某些类型的组织,例如,人类心脏和年轻的鸡肉梳组织不包括提取过程作为交联的来源。非常年轻的鸡肉梳高分子量HA是透明质酸酶降解,但微量的其他分子迫使交联可能藏在基线噪音。这凸显了需要建立一个可靠的HA特定亲和力提取这将是有用的所有变体HA分子大小的确定方法。

6。结论

到目前为止,已经很难研究疾病病理变化在细胞外基质可用性较低或组织样本的容量很小。HA分析难以获得足够大的活检组织的人类疾病或动物疾病模型已经在许多情况下限制HA在这种疾病的研究。吉玛的检测水平低的方法现在允许研究疾病,哈哈。此外,评估的方法允许HA分子大小的分布从不同地区的小器官,例如,鼠肾脏(图1)。因此,吉玛给的机会获得一个概要文件在HA分子量的分布和估计的变化引起的疾病或实验条件,不可能获得。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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