血清和氧气浓度对基因表达的影响,间充质干细胞旁分泌因子的分泌

文摘

间充质干细胞(MSC)分泌旁分泌的因素可能产生一种保护作用后对心脏冠状动脉阻塞。这项研究是为了确定缺氧的影响和血清mRNA表达和分泌的旁分泌的因素。小鼠骨髓MSC是培养有5%或20%的血清和常氧(21%啊₂)或低氧(1% O₂)条件。的mRNA表达血管内皮生长因子(VEGF)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α),MIP-1β,矩阵metalloproteinase-2 (MMP-2)是由RT-qPCR决定。分泌到培养基是由ELISA。缺氧引起基因表达的减少MCP-1和增加VEGF血清(5%),MIP-1α,MIP-1β,MMP-2。血清减少降低了VEGF基因表达(normoxia) MCP-1(缺氧),MIP-1α(缺氧),MIP-1β(缺氧),MMP-2(缺氧)和基因表达增加MMP-2 (normoxia)。这些因子的分泌水平到媒体通常平行基因表达有一些例外。这些数据表明,血清和氧含量有显著影响的基因表达和分泌旁分泌因子通过MSC将影响MSC是如何交互的在活的有机体内在心肌缺血。

1。介绍

工作在许多实验室已经证明干细胞管理能够降低心肌梗死后心脏功能的缺失。我们已经表明,静脉注射骨髓间充质干细胞(MSC)的小鼠冠状动脉闭塞后的一个小时能够减弱功能的丧失是由于心肌梗塞(1]。这些MSC分泌旁分泌因子血管内皮生长因子(VEGF)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α),MIP-1β这可能在MSC的保护作用中发挥作用2,3]。理解的方式合成和分泌控制这些因素是很重要的在临床情况下更好地利用MSC。

氧气的数量现在虽然MSC是培养对MSC的行为有很大影响(4]。大气中的氧气水平通常用于文化(21%啊₂;normoxia)相比显著升高12%氧气中发现动脉血液和各种组织中的1 - 7%皮肤、骨髓、心肌、脑、脾(4- - - - - -7]。此外,永久在大鼠冠状动脉阻塞后,心肌氧分压15毫米汞柱(2%)水平下降到小于2毫米汞柱(< 0.3%),维护后左室重构(8]。缺氧,或“原位normoxia”[9),改变MSC基因表达(10,影响到旁分泌因子的分泌11- - - - - -13),和MSC分化能力的影响14- - - - - -16]。

同样,大量的血清培养基中影响干细胞的行为。MSC通常在10 - 20%血清培养包含许多因素,可能不会出现在这些细胞所在的组织。此外,缺血性冠状动脉闭塞后的条件现在包括缺氧和血清剥夺(17,18]。减少血清促进心肌细胞分化[2%19)、减少细胞增殖和维护具备干细胞移植基因,血管生成因子,血管内皮分化(20.在MSC。血清剥夺改变旁分泌因子的分泌和表达干细胞和血管内皮标记的MSC (21- - - - - -23]。

我们之前已经证明MSC分泌VEGF, MCP-1 MIP-1α,MIP-1β具有明显的生物效应细胞迁移,细胞凋亡,毛细血管的形成(2]。此外,MMP-2由MSC分泌可以促进定向细胞迁移(24]。因此,本研究的目的是模拟心肌缺血的条件在通过降低氧气和血清浓度在文化为了确定这些条件的影响的基因表达和分泌VEGF, MCP-1 MIP-1α,MIP-1β,MMP-2骨髓MSC。为此,我们在5%或20%血清培养的MSC在常氧(21%啊₂)或低氧(1% O₂)环境。

2。方法

2.1。间充质干细胞培养

小鼠间充质干细胞(MSC)骨髓中分离培养Mesencult基底中有20%小鼠血清补充(干细胞技术)如前所述1]。MSC(段落3 - 10)是培养在37°C 6-well盘子2 mL / Mesencult 5%或20%小鼠血清浓度为0.30×10的补充⁶细胞/。常氧细胞培养48小时在正常大气氧(21%)+ 5%股份₂。缺氧细胞培养24小时在正常大气中的氧气,然后额外的24小时在减少氧气的气氛中(1%啊₂,5%的公司₂,94% N₂)。

一个细胞增殖试验使用alamarBlue(表达载体;为了正确执行DAL1025)增长率在不同文化条件下的差异。MSC培养如上所述。经过48小时的文化,井与PBS然后洗处理Mesencult + 5%血清补充含有10% alamarBlue试剂。细胞培养在常氧条件下4小时37°C。吸光度测量在570和600海里和alamarBlue减少(AR)确定。基于“增大化现实”技术的直接与细胞的数量成正比。

2.2。量化使用ELISA旁分泌因子的分泌

文化的48小时后,媒体被移除和离心机在14000 g×10分钟。浮在表面的移除,分为单一使用整除,储存在−20°C。媒体分析了上层的ELISA使用Quantikine工具包(研发系统)VEGF (MMV00) MCP-1 (MJE00) MIP-1α(MMA00) MIP-1β(MMB00),矩阵metalloproteinase-2 (MMP-2;根据制造商的指示DMP2F0)。为了正确的细胞增殖的差异,因此每细胞分泌产生的数量,这些测量值被规范化为细胞培养在5%血清在缺氧条件下使用标准化因素由alamarBlue细胞增殖试验(见下文)。

2.3。信使rna量化使用RT-qPCR

总RNA分离后48小时内使用RNAqueous-4PCR工具包(Ambion)的文化。RNA是DNAse对待我,然后量化和评估质量通过测量吸光度在260和280海里。反转录进行1μ使用iScript cDNA g RNA合成装备(BioRad)混合益生元(dT)和随机引物。qPCR是2μL RT DNA模板与智商SYBR绿色Supermix BioRad MJ迷你热循环仪(BioRad)使用与MiniOpticon 300μ特定的引物(表1)。No-RT和水控制包括确保特异性。在最初热从95°C(3分钟),40周期的95°C(30秒),55°C(30秒),和72°C(1分钟)进行。单带适当的分子尺寸被确认的产品用2%琼脂糖电泳底漆。相对表达决心使用排名Manager (BioRad)通过比较数据参考基因YWHAZ(酪氨酸3-monooxygenase /色氨酸5-monooxygenase激活蛋白质、ζ多肽);这是归一化平均表达水平。

2.4。统计分析

平均值和标准误差计算对于每一个治疗组,并使用学生的决定意义以及。下列生物相关的比较是:(1)常氧细胞生长在5%和20%血清,(2)缺氧细胞血清生长在5%和20%,(3)常氧细胞缺氧细胞生长在5%血清,和(4)缺氧细胞与常氧细胞生长在20%血清。

3所示。结果

3.1。细胞增殖实验

之前的旁分泌因子分泌可能是治疗组之间相比,48小时后细胞的数量出现差异的文化必须是平衡的。要做到这一点,一个细胞增殖试验使用alamarBlue。发现细胞培养与减少20%血清补充alamarBlue含量严重超标(AR) (;)相比,5%血清。缺氧时没有对细胞培养的影响在5%血清,在缺氧条件下的意思是AR值升高血清(20%;)。文化相比,5%血清在常氧条件下,基于“增大化现实”技术的价值高出24%,20%血清/常氧文化和高36%,20%血清/缺氧的文化。基于这些数据,20%血清ELISA值/常氧文化和20%血清/缺氧文化规范化5%血清/常氧文化乘以0.804和0.737,分别。没有用于校正系数5%血清/缺氧文化因为AR值没有显著不同于5%血清/常氧文化。

3.2。旁分泌因子的分泌

旁分泌因子的分泌MSC在文化媒体使用ELISA(表量化2,图1)。血清从20%减少到5%,改变从常氧缺氧环境中检测到的水平有明显影响的媒体。先前的研究已经表明,VEGF在我们实验室MIP-1α,MIP-1β,MCP-1 Mesencult媒体没有检测到含有20%血清补充(2]。

VEGF水平显著降低()在媒体从细胞培养相比,5%血清补充的补充在常氧和缺氧条件下20%。缺氧对VEGF的分泌无影响。

如与VEGF、显著降低血清减少5% ()MCP-1水平媒体相比,20%在常氧和缺氧条件下补充。此外,缺氧显著降低()MCP-1水平在5%和20%血清的文化。

MIP-1α水平影响血清补充或氧气浓度水平。另一方面,MIP-1β水平(表2,图1)明显升高(),5%血清相比,20%低氧条件下,未见在常氧条件下产生影响。而且,缺氧显著降低()MIP-1β分泌在5%和20%血清补充剂。

变化MMP-2分泌MIP-1的一般趋势β。血清减少5%导致显著的高度()MMP-2水平而在常氧和缺氧条件下为20%。而且,缺氧显著降低()MMP-2分泌在5%和20%血清的文化。

3.3。旁分泌因子mRNA水平

归一化相对mRNA的表达在MSC各种旁分泌因素决定使用RT-qPCR(表3,图1)。信使rna平行变化观察分泌的变化虽然有些差异。

血清减少5%导致急剧下降的相对表达VEGF mRNA在常氧比例为20% (在缺氧条件下),但不是。缺氧导致相当高度的细胞增长在5%血清VEGF表达水平(%)而不是20%。这类似于与VEGF分泌到周围观察到的响应媒体除了血清中的表达水平5%。

血清减少到5%没有显著影响的相对表达MCP-1 mRNA 20%血清的补充。缺氧显著降低()的相对表达MCP-1 mRNA在5%和20%血清的补充。这是类似于观察MCP-1分泌除了缺乏血清的作用。

MIP-1的相对表达的变化α和MIP-1β信使rna是相似。表达显著降低(),5%血清相比,20%低氧条件。在常氧条件下都能看到没有影响。缺氧mRNA表达显著升高5% ()和20%(< 0.01%)补充剂。这些影响是与这两个因素分泌到培养基中缺氧对MIP-1没有影响α和抑制MIP-1β分泌。

降低血清从20%到5%显著增加()的相对表达MMP-2 mRNA在常氧条件下类似于分泌到媒体。然而,减少血清没有显著的影响在缺氧与分泌增加。缺氧没有影响表达式的血清浓度虽然减少分泌到媒体。

4所示。讨论

这项研究清楚地表明,氧气浓度和血清水平的改变导致重大改变旁分泌因子mRNA表达和分泌的MSC。这是第一次,同时研究了这两个参数和数据表明,低血清和氧气条件下出现在缺血后发现冠状动脉阻塞可能产生重大影响的分泌功能MSC和所发挥的作用在防止心脏病发作后心肌功能的损失(1]。观察到的特定变化取决于特定的旁分泌因子被研究。信使rna的变化往往平行分泌的变化,但也有例外。

我们发现缺氧的基因表达显著降低MCP-1但对MIP-1显著增加基因的表达α,MIP-1β血清VEGF(5%)而MMP-2表达不受影响。分泌物的MCP-1 MIP-1β,MMP-2都显著减少缺氧而VEGF和MIP-1α未受影响。差异的原因为MIP-1 mRNA表达和分泌α,MIP-1β,MMP-2不会立即显现,但可能是由于不同的基因表达的控制与控制平移和转译后的事件,导致从mRNA生产分泌。其他研究者已经证明了VEGF基因表达和分泌的增加10- - - - - -12和MCP-1的分泌减少13MSC在缺氧。我们的结果通常没有演示后VEGF增加缺氧,但是这个因素也对血清反应不同的减少我们的手(见下文)。此外,组织缺氧胎盘生长因子的基因表达增加,heparin-binding表皮生长因子,MMP-9,碱性纤维母细胞生长因子(bFGF) [10,12),造成转化生长因子的分泌增加β2,胰岛素样生长因子结合蛋白2,3,4,6,胰岛素样生长因子- II (IGF)和白介素- 711,15),和基质细胞衍生因子- 1的分泌,减少巨噬细胞集落刺激因子,interleukin-1ra,咆哮,处于受控,CXCL10 [13通过MSC)。显然,缺氧改变MSC的旁分泌分泌物中起到的作用,会影响冠状动脉闭塞后维持心肌功能。

暴露于低氧环境中导致显著的细胞生理的变化。在这些原则是稳定的低氧诱导因子(HIF -) 1α在氧气5%和0.5[之间依赖的方式25),可能是由于线粒体活性氧的释放,防止其退化(26]。这引发了持续表达HIF-1的浓度α当结合HIF-1β形成一个活跃转录因子促进细胞存活(27]。各种基因受此影响级联包括趋化因子受体和那些促进厌氧呼吸,减少有氧呼吸,参与notch信号(27]。HIF-1αmRNA表达于脂肪中提取MSC 48小时后升高文化存在1%的O₂(12]。鉴于这一点,毫不奇怪,我们发现缺氧改变旁分泌因子的基因表达和分泌,和低氧诱导因子-α可能参与了反应。

这项研究表明,降低血清浓度从20%到5%的增加引起的mRNA表达MMP-2但VEGF的表达明显下降(仅normoxia), MIP-1α(缺氧),MIP-1β(缺氧)当MCP-1未受影响。分泌MMP-2 MIP-1分泌β都显著升高血清VEGF和减少MCP-1显著降低,MIP-1吗α是不受影响。我们也观察到,减少血清细胞增殖下降引起的。改变扩散、基因表达和分泌减少血清后并不令人惊讶,因为媒体含有蛋白质和生长因子信号更少。其他研究已经表明,减少血清(2%)或剥夺会导致增加VEGF的表达和分泌MSC (20.,22,23]。目前还不清楚为什么降低血清VEGF的表达和分泌减少而其他人在我们的研究发现它是升高的,但这可能是由于我们使用血清中含有刺激补充剂(Mesencult;干细胞技术)代替的边后卫。然而,我们先前已经表明,该补充不包含VEGF, MIP-1α,MIP-1β,或者MCP-1 [2)由制造商确认,因此观察到的变化不仅仅是由于内源性VEGF的减少。从其他实验室报告显示,减少从20%到2%血清MSC文化导致扩散大幅下降,肝细胞生长因子的分泌增加22),胎盘生长因子基因的表达增加,angiogenin-1, bFGF [20.]。血清剥夺导致基因表达的增加和igf - 1的分泌,瘦素和血管生成素(23,28通过MSC)。由于冠状动脉闭塞导致心肌serum-deprived状态,这些结果有显著的治疗对MSC的旁分泌行为的影响。

缺氧和降低血清也影响与分化相关的基因在MSC。缺氧OCT-4多能性基因的表达增加,nanog在MSC (29日)和刺激的一组基因的表达,保持未分化状态30.]。缺氧促进成骨的(31日理学硕士()和chondrogenic分化32但减少脂肪形成的MSC分化[15,16椎间盘表型[]和提升发展14]。减少引起的血清水平2%“具备干细胞”基因的表达增加(ATP结合盒g2,骨髓基质细胞antigen-1 FGF-4, frizzled-9, SOX-2,和OCT-4),血管生成基因(胎盘生长因子,VEGF、angiogenin-1和bFGF),和内生的基因(CD34、血管内皮钙粘蛋白、内皮细胞粘附molecule-1,冯Wildebrand因子,VEGF受体2)在MSC (20.]。血清减少导致增加心肌细胞(19和内皮分化21,23通过MSC)。因此,缺氧/低血清条件下存在冠状动脉闭塞后提供条件,保持MSC的多能性,同时促进分化的能力。这种变化在分化状态也可能影响旁分泌因子的表达和分泌。

旁分泌因子由MSC分泌有明显的生物活动被认为扮演一个角色在他们的心血管效应(3]。我们已经表明,MSC的媒体(CM)促进犬血管内皮细胞的血管生成,MCP-1或者MSC-CM减少caspase-3活动H9c2细胞,和MCP-1 MIP-1α促进了MSC迁移和VEGF抑制MSC移植(2]。VEGF是一个著名的启动子和血管生成的监管机构33),MCP-1 proangiogenic影响(34,35]。MCP-1 [36),MIP-1α,MIP-1β(37,38)免疫功能的调节中发挥作用,和免疫调制可能复苏的一个重要机制MSC援助组织损伤(39)包括心肌梗死(40]。MMP-2白明胶酶是消化胶原蛋白和严格监管的各种因素包括组织金属蛋白酶抑制剂(41)也是由MSC分泌(42]。的分泌MMP-2 MSC,我们和其他人证明transendothelial和组织迁移可能是重要的MSC (24,43)和血管生成(44]。微分调节这些旁分泌因子的低氧、低血清条件,证明了在这个研究可能是重要的有利影响MSC注射后缺血期间存在冠状动脉闭塞(2]。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的2013年和2014年夏季研究经费和2014临时研究从基督教三一学院奖学金。作者要感谢D.L. Geenen援助和使用他的实验室设施准备的MSC,感谢j . Kim援助与ELISA检测。

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