的影响洋葱l . Lipopolysaccharide-Stimulated破骨细胞前体细胞生存能力,统计,和形态使用4′,6-Diamidino-2-phenylindole-Staining

文摘

洋葱l是具有许多药理性质。我们的目的是检查在体外的影响洋葱l .提取(AcE)Porphyromonas gingivalis有限合伙人,大肠杆菌LPS-stimulated破骨细胞前体细胞决定细胞生存能力和其他未来的细胞化验。破骨细胞前体细胞(原始264.7)刺激Pg有限合伙人(1μg / mL)大肠杆菌有限合伙人(1μ存在与否的g / mL)不同浓度的AcE (10 - 1000μg / mL) 5天在37°C / 5%的股份有限公司₂。刃天青减少和总蛋白质含量分析被用来检测细胞的可行性。AcE并不影响细胞的生存能力。刃天青减少化验表明,AcE,高达1000人μg / mL,没有明显影响细胞的生存能力和细胞的蛋白质含量。另外半胱天冬酶3/7发光分析被用来揭示细胞凋亡及凋亡活动之间没有区别测试组和对照组。DAPI荧光图像彩色显示没有改变的形态学和细胞计数LPS-stimulated破骨细胞前体细胞在所有测试使用AcE浓度相比,控制。这些发现表明,洋葱l .提取可用于在体外研究Porphyromonas gingivalis有限合伙人,大肠杆菌LPS-stimulated破骨细胞前体细胞。

1。介绍

自然产品来自药用植物已被证明是一种丰富的生物活性化合物和一些这些提取物被认为对健康是有益的1]。科学的评价植物的属性通过强有力的药理活性,毒性分析和经济可行性需要增强识别药用植物和草药产品2]。

最近,研究天然化合物明显先进调制的病理过程中的免疫系统(3- - - - - -5]。炎症是一种重要的主机应对外资挑战或组织损伤,从而导致组织结构和功能的恢复6]。然而,长期的炎症可以不再是一个有益的事件,这导致许多疾病的发病机制,如哮喘、糖尿病、风湿性关节炎、和牙周炎(7,8]。

这些疾病有不同的起始因素;然而,都是介导免疫紊乱,引起组织损伤,从而导致复杂的生物效应在活的有机体内(6- - - - - -8]。脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌的细胞壁的组成部分,是一种炎性疾病微生物因素(9- - - - - -11]。洋葱l在支气管与抗过敏药相关研究和潜在的病理(5)以及抗菌、抗组胺剂,抗炎和抗氧化活动12]。然而,对天然化合物越来越浓的兴趣已经引发了一系列的注意他们的安全配置文件和毒性9]。有限数量的这些化合物有充分的研究和他们的功效还有待调查3]。因此,本研究的目的是确定的methanolic提取的影响洋葱l细胞生存能力、细胞形态学、诱导细胞凋亡、细胞计数的破骨细胞前体细胞(原始264.7),和扩散Porphyromonas gingivalis(Pg有限合伙人和大肠杆菌LPS-stimulated炎症条件。这个想法是为了确定non-cytotoxic浓度和活细胞数为未来的其他细胞化验。

2。材料和方法

刃天青减少,蛋白质化验,半胱天冬酶3/7发光分析,荧光图像DAPI染色的方法用于确定noncytotoxic浓度洋葱l .原始264.7破骨细胞前体细胞系。

2.1。试剂

洋葱l .样本去皮切割和浸渍在烧瓶中提取包含1000毫升99.8%的甲醇(CH₃7天哦)。过滤后,提取被集中使用旋转蒸发器蒸发减少压力。这个浓度过程重复三次。随后,AcE在烤箱干,然后维持在−20°C到使用。不同浓度的AcE (10、50、100、1000μg / mL)进行了测试。有限合伙人的大肠杆菌,Porphyromonas gingivalis二甲亚砜(DMSO)≥99.5%,其他化学品购买从西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。细胞培养

小鼠单核细胞/巨噬细胞生264.7细胞(写明ATCC加入。矿- 71)培养和维持在37°C在5%的股份有限公司₂调湿大气与DMEM(英杰公司11995)这是补充的边后卫(英杰公司12484028)和100年的10%μ青霉素g / mL /链霉素。每3天中被改变。

2.3。细胞毒性实验

细胞生长在96孔板Pg有限合伙人,大肠杆菌LPS-stimulation存在和缺乏AcE (10 - 1000μg / mL)。DMSO溶液(50%)是用于积极控制。刃天青减少化验(Alamar蓝色)(表达载体,木豆1025)5天后进行。文化被安置在介质含有10%的Alamar蓝色。在100年4 h孵化μL中被转移到井的96孔板和光学密度(OD)测量使用Cytation 3,成像阅读器(美国Biotek)波长的570和600海里。细胞的百分比显示细胞毒性相对于对照组(Ctrl)确定。更大比例的减少Alamar蓝试验反映了更大的细胞增殖。此外,蛋白质分析被用来评估细胞增殖。细胞溶菌作用是列入Kartner et al ., 201013]。细胞被暂时用PBS和细胞溶解蛋白质裂解缓冲(10毫米氯化钠,0.1%柠檬酸三钠的90毫米,特里同x - 100, pH值4.8)。蛋白质浓度测定用皮尔斯BCA分析(热科学23225)。OD测量使用Cytation 3,成像阅读器(美国Biotek) 562 nm波长计算公式提供蛋白质的水平。

2.4。半胱天冬酶测定3/7

caspase-3/7活动被Caspase-Glo 3/7分析测量工具(皮尔斯,美国)。细胞培养中存在和缺乏AcE (10 - 1000μg / mL) 5天,与100年被添加μL Caspase-Glo 3/7的试剂。轻轻搅拌和孵化后的细胞在室温下1 h,每个样本的发光测量plate-reading光度计Cytation 3日Biotek(美国)。

2.5。图像分析,DAPI染色细胞计数

细胞培养与Pg有限合伙人,大肠杆菌LPS-stimulation存在和缺乏AcE (10 - 1000μg / mL)为5天。DMSO溶液(50%)是用于积极控制。细胞被沾染了4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI Sigma-Aldrich),然后自动计算。五个视觉图像被使用荧光显微镜(美国Biotek Cytation 3)。分散或浓缩核被定义为凋亡细胞(14),每个样本进行了分析使用Gen5软件(美国Biotek)。

2.6。统计分析

统计显著性由方差分析;数据进一步分析了图基的成对比较来检测特定的测试组和对照组之间的差异使用GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。每个实验进行了一式三份,至少重复三次。

3所示。结果与讨论

本研究调查的提取的影响洋葱l . (AcE) LPS-stimulated破骨细胞前体细胞的细胞生存能力。我们的研究结果显示,治疗各种浓度的王牌没有明显毒性作用意味着细胞实验条件下可行的评估。

炎症引发的感染和组织损伤是多种生理和病理过程(6]。越来越有兴趣探讨药理活性天然产物的免疫介导的疾病,如牙周炎(3,9]。然而,数量有限的自然化合物充分研究与疗效和安全性(9,15]。

小鼠单核巨噬细胞的炎症分子的生产原料264.7细胞可以诱导在LPS刺激9,11]。因此,这些炎症分子的抑制剂可能被认为是抗炎药候选人(16]。洋葱l .已被用于治疗炎症性疾病如哮喘(5)和ovariectomy-induced骨吸收在老鼠17]。AcE抑制RANKL-induced ERK, p38和NF -κ从老鼠B激活破骨细胞前体细胞18]。

细胞分析是用来确定测试药物药理作用在细胞增殖或显示直接细胞毒性影响,最终导致细胞死亡19]。各种技术被用来研究细胞的可行性。resazurin-reduction在本研究中,蛋白质分析和形态学和细胞计数DAPI染色。二甲亚砜(DMSO)是一种细胞培养试剂与许多应用程序在化学和生物研究(19]。在这项研究中用于比较(积极的控制)。此外,裂解caspase-3染色是用来识别细胞凋亡在原始264.7。刃天青是细胞渗透氧化还原指示剂,可以用于监控活细胞数目与协议类似于利用四唑化合物。然而,它比四唑稍微敏感减少化验(MTT)。可行的细胞活跃新陈代谢可以减少刃天青resorufin产品是粉色和荧光(20.]。在这项研究中,根据Alamar蓝色化验,264.7原始细胞的接触到不同的浓度洋葱l .超过5天没有显著影响,表明AcE没有增殖效果,和集成电路₅₀值高于8000μ克/毫升(图1)。此外,暴露Pg有限合伙人或大肠杆菌264.7 LPS-stimulated原始细胞AcE高达1000μg / mL不是有毒这个特定细胞系(数字2(一)-2(g))。此外,确认王牌对细胞生存的影响蛋白质浓度在所有样本相比,标准。这个测试结合了铜的著名的减少^{2 +}对铜^{1 +}蛋白质在碱性介质的高度敏感和选择性比色检测亚铜阳离子(铜^{1 +})bicinchoninic酸(21]。为了量化总蛋白质含量化验。在相同的生长条件下5天Pg有限合伙人,大肠杆菌LPS-stimulated细胞没有任何明显的减少总蛋白质含量高达1000μ克/毫升与阴性对照组相比(Ctrl)如图3(一个)和3 (b)。凋亡细胞死亡在原始264.7巨噬细胞和其他几个系统可能引起的细胞毒性细胞的结果用不同的药物和治疗还存在通过upregulation激活(22,23]。引起的细胞凋亡并不是治疗的王牌,高达1000人μ克/毫升(图3 (c))。

DAPI DNA-specific调查形成荧光复杂通过附加的小树林t丰富的DNA序列,在奥托首次合成埃朗根(Dann的实验室24]。的实用性DAPI荧光显微观察DNA的细菌,植物,原生动物,哺乳动物细胞中演示了这项研究。这些观察建立作为DNA-specific DAPI荧光染色(25]。因此,在相同的生长条件下,DAPI染色并没有显示任何细胞的数量减少或改变形态的所有王牌测试浓度与阴性对照组相比(Ctrl)(数据4(一)-4(g))。

总之,本研究的结果提供了足够的证据证明洋葱l .甲醇提取物可以安全地用于进一步药理研究利用Pg和大肠杆菌LPS-stimulated破骨细胞前体细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢巴西机构FAPESB CNPq,斗篷的金融支持。多伦多大学的启动基金项目和CFI(加拿大创新基金会)支持这个项目。

引用

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