评估潜在的CDK2抑制剂NU6140影响多能性的表达标记NANOG OCT4、SOX2在2102年ep和H9细胞

文摘

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)调节细胞周期进程和RNA转录,CDKs有吸引力的目标创建癌细胞的治疗方法。在这项研究中,我们调查的影响小分子代理NU6140(抑制CDK2和细胞周期蛋白相互作用)对人类胚胎干细胞(他)细胞和胚胎carcinoma-derived (hEC)通过转录因子的表达细胞多能性负责。多参数流仪法遵循NANOG的表达变化,OCT4、SOX2在单个细胞。他和回应NU6140 hEC细胞治疗通过诱导细胞凋亡和NANOG的表达减少,OCT4、SOX2在幸存的细胞。更高的灵敏度比hEC NU6140应用他细胞检测。NU6140治疗他被捕,hEC G2期细胞,抑制进入有丝分裂期就是明证没有显著增加3组蛋白磷酸化。当拟胚体(EBs)由NU6104对待他从未经处理的细胞相比,EBs他外胚层的细胞差异内胚层、中胚层的血统被发现。这项研究的结果强调CDK2活动的重要性在维护他和hEC细胞多能性和他细胞的分化。

1。介绍

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)调节细胞周期进程和RNA转录在不同的细胞类型。CDKs形成复合物,影响几个上游和下游通路调节细胞周期,细胞增殖和细胞凋亡。自改变细胞周期进展发生在一些恶性肿瘤,抑制CDKs被认为是一种很有前途的癌症治疗的目标。在CDKs负责细胞周期进展CDK2本质上是一种灵活的蛋白质(1)与许多构象所需各种配体的相互作用。CDK2调节细胞周期进展通过形成(a)细胞周期蛋白E-CDK2复合物在G1的边界过渡和(b)细胞周期蛋白A-CDK2复合物为有序的S期进展和G2 M相变。CDK2因此一直是一个有吸引力的抑制,虽然复杂,任务。使用structural-drug设计几个小分子肽开发目标ATP绑定子站或其他重要活动确认CDK2所需结合位点。创建高度选择性CDK2化合物是一个挑战由于CDK1内ATP绑定子的身份,CDK2、CDK3分子;CDK2也拥有92%和80%在CDK5和CDK6分子序列的身份,分别(b38 RCSB蛋白质数据银行代码:1)。为了影响CDK2绑定到一个特定的配体是重要的因此优化CDK2抑制剂和CDK2残基之间的相互作用。

各种特定CDK2抑制剂已被证明可有效诱导细胞凋亡,减少各种癌症细胞的增殖(2]。在正常细胞诱导细胞周期阻滞已被证明是可逆的(3,4]。CDK2抑制剂影响细胞周期的性质却不完全理解。只有疲软的G1逮捕一直在观察CDK2−−/ mef (5,6]或在建立肿瘤细胞系(siRNA消融后7]。逮捕的细胞周期G1期然而被发现在细胞同步并释放nocodazole-induced有丝分裂块(8]。此外CDK2抑制剂flavopiridol更在S期细胞毒性治疗时转化细胞(9]。细胞在某些细胞周期阶段CDK2抑制因此可能更敏感。然而一些癌细胞具有抵抗CDK2抑制,如图所示的独特upregulation CDK2目标蛋白质和既存细胞多倍体肿瘤细胞(10]。

CDK2抑制剂中那些purine-based结构(NU6140及其衍生物)显示高特异性抑制CDK2与细胞周期蛋白与其他交互互动(CDK1 /细胞周期蛋白B,到/细胞周期素D, CDK5 / p25、和CDK7 /细胞周期蛋白H) (11,12]。NU6140希拉宫颈癌细胞发生凋亡,逮捕细胞G2 / M期,并减少细胞生存本身和结合紫杉醇(13]。然而NU6140在上皮细胞对细胞凋亡(没有影响14]。在carcinoma-derived NU6140究竟是如何影响细胞周期细胞和效果是否可逆仍不清楚。

几个特定功能的人类胚胎干细胞(他)细胞的特殊兴趣学习CDK2抑制的影响。第一,他的细胞具有无限增殖潜能和多能性,向他们提供能力分化成所有三个细胞lineages-ectoderm内胚层、中胚层(15- - - - - -17]。区分的能力提供了一个机会探讨CDK2抑制是否能改变这些细胞的分化潜能。第二,他的细胞具有一个独特的细胞周期配置文件和一个缩写G1期,S期长(18]。第三,最近他的法研究组织磷酸化蛋白质组细胞在分化显示CDK2 Cdc2活动中心在促进多能性和自我更新19]。这三个特征综合起来表明他细胞可以是一个有用的模型为研究CDK2抑制的结果。的广谱抑制剂CDKs roscovitine他细胞抑制CDK1所示,2和5,导致G1 / S逮捕,积累hypophosphorylated Rb,导致小细胞殖民地,表达下调多能性标记OCT4 [20.]。调制CDK2表达式通过使用小核RNA)会导致逮捕在G1期细胞和诱导细胞分化成胚胎外的细胞系21]。CDK2 p21的表达,一种天然抑制剂,与G1在他被捕细胞(22]。先前的研究表明CDK2活动的重要作用在他细胞周期调节。因此很重要的一点是澄清如何CDK2抑制剂NU6140改变细胞周期和他多能性的细胞。

他细胞多能性通常是由三个转录因子的转录网络协调OCT4, NANOG, SOX2。转录因子(TFs)已被证明函数作为细胞可变电阻;也就是小TF表达的变化导致大他细胞的自我更新和多潜能的变化(23]。他细胞多能性和自我更新维护,受细胞周期调控24]。他细胞转录因子的表达特点被发现在一些癌症和往往是与不良临床结果(相关25]。胚carcinoma-derived细胞(hEC, NTERA-2 BG01V,和2102 ep)有几个优势作为一种工具来研究癌签名在细胞癌通常显示蛋白质和mrna的表达特定于他自发分化的细胞,具有低利率。CDK2抑制剂的效果在各种癌细胞的扩散已被广泛研究,但则较少受到关注的能力CDK2抑制剂调节转录因子的表达多能性负责。

在这项研究中,我们旨在描述的影响CDK2在细胞周期抑制剂NU6140 carcinoma-derived细胞与他相比。我们应用多色流仪方法单细胞分析CDK2和多能性标记的表达在不同的细胞周期阶段。由于我们第一次实验的另一个重要的问题我们想回答是转录因子的调节是否负责多能性(NANOG OCT4、和SOX2)可逆的和持久的。此外我们也估计CDK2抑制的影响在他细胞的分化潜能。

2。材料和方法

2.1。道德声明

本研究使用商用人类胚胎干细胞线(WA09-H9,国家干细胞银行、麦迪逊、WI,美国);没有在活的有机体内进行了实验动物或人类,因此一个伦理委员会的批准是不必要的。

2.2。细胞培养

人类胚胎carcinoma-derived (hEC)细胞株2102 ep(美国GlobalStem)保持在DMEM培养基(含葡萄糖4.5 g / L) (Gibco生命技术)含10%胎牛血清(PAA实验室、林茨、奥地利)和MEM Nonessential-Amino-Acids-Solution(美国英杰公司0.1毫米)。

人类ES细胞系H9 (WA09,国家干细胞银行、麦迪逊、WI,美国)保持在基底膜基质(美国BD生物科学,圣何塞,CA)涂层板在mTeSR1维护媒介(干细胞技术有限公司、加拿大温哥华)根据制造商的规格。每天mTeSR1维护媒介改变了。增长3 - 4天后细胞微量吸液管尖殖民地分离机械,和温柔的吸量和由此产生的个人他细胞团被镀到新鲜人工基底膜涂覆盘子。

2.3。抗体和试剂

Anti-NANOG (PE共轭)、anti-OCT4 (Alexa萤石647共轭和PerCp-Cy5.5共轭),和anti-SOX2 (PerCp-Cy5.5共轭)抗体,再加上他们同形像控制抗体购自BD生物科学。Anti-cleaved-caspase 3和anti-histone 3抗体检测磷酸化丝氨酸10人购买的细胞信号(美国)。Anti-CDK2抗体得到从细胞信号和圣克鲁斯生物技术(美国圣地亚哥,CA)。Anti-SOX1 (NorthernLights共轭,nl - 493), anti-OTX-2 (nl - 557), anti-Brachyury (nl - 557), anti-HAND1 (nl - 637), anti-GATA4 (nl - 493),和anti-SOX17 (nl - 637)抗体购自研发系统(阿宾顿,奥克,英国)。诺考达唑和NU6140 (Sigma-Aldrich化学品,圣路易斯,密苏里州,美国)溶解和稀释在DMSO (Sigma-Aldrich化学物质)。

2.4。多元Permeabilised-Cell流式细胞术和细胞周期分析

细胞融合水平的大约60 - 70%(3 - 4天之后他细胞通道,1 - 2天hEC细胞)在6-well板块进一步治疗24 h和100 ng / mL诺考达唑,10μ(或各种浓度)NU6140,或0.1% DMSO作为控制(对应于在10 DMSO溶液的浓度μM NU6140解决方案)或种植治疗37°C公司5%₂湿润的气氛。DMSO浓度的0.1%用于化验报告更少在他的影响力比更高的DMSO浓度细胞分化[26,27]。与0.05% trypsin-EDTA收割后的解决方案(PAA实验室、林茨、奥地利)和PBS和洗涤,单他细胞悬浊液是用1.6%多聚甲醛固定(PFA, Sigma-Aldrich)在室温下10分钟(RT)作为检测细胞内磷蛋白质的描述28,29日]。细胞被洗permeabilisation缓冲区(Foxp3染色缓冲区设置,e-Biosciences)。他使用2%山羊血清细胞被封锁(PAA实验室)permeabilisation缓冲区在RT(10分钟)和彩色与相应的抗体或其同形像控制在30分钟RT,细胞周期分析细胞进一步与DAPI染色(Cystain DNA, Partec GmbH,明斯特,德国)。流式细胞仪数据获取与FACSAria使用FACSDiva软件(BD生物科学)。分析2102 ep细胞固定1.6%后PFA和冰冷的甲醇permeabilized 20分钟在4°C,用PBS包含5毫米EDTA、屏蔽与6%山羊血清permeabilisation缓冲区,然后沾他细胞抗体(如前所述)。2102年再悬浮ep细胞包含5毫米的PBS缓冲使用EDTA。

当细胞只收获细胞周期分析他们沾propidium碘乙醇后固定。

细胞permeabilisation、固定、染色和数据采集的样本在同一天完成的。更准确的分析我们使用顺序选择基于尺寸和粒度的细胞群。只选择了单个细胞检测细胞在不同细胞周期阶段,只有这些细胞被用来分析各种参数的表达式(见图1- - - - - -6),允许非特异性信号最小化。

2.5。免疫印迹分析

蛋白质样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%)和transblotted (MiniTransblot单元、Bio-Rad大力神,CA)到一个聚乙二烯二氟化物膜(微孔、Billerica MA)。探讨了膜与兔子anti-NANOG抗体(英杰华系统生物学、圣地亚哥、钙、美国),鼠标anti-OCT4抗体(圣克鲁斯生物技术)和anti-SOX2抗体(Abcam、剑桥、马、美国)其次是辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit(细胞信号)或山羊anti-mouse二级抗体(腊八粥、塔尔图、爱沙尼亚)。一只老鼠anti-beta-actin抗体(Abcam)是用于检测加载控制。绑定与ECL试剂抗体检测(西方闪电Plus-ECL PerkinElmer Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)和510年曝光的印迹用Bioscpectrum成像系统与VisionWorks LS夺得软件(高地,从紫外线产品有限公司,美国)。

2.6。他细胞分化成外胚层,内胚层、中胚层血统

他与融合细胞水平的大约60 - 70%(通过后3 - 4天)在人工基底膜处理10μM NU6140 24 h,然后进一步72 h和新鲜mTeSR1维护媒介。

拟胚体(EBs)是由在低依恋他悬浮细胞培养板与敲除DMEM / F12媒体(Gibco,生活技术)基因敲除血清替代补充20%,不必要的氨基酸(0.1毫米),GlutaMAX(2毫米),和beta-mercaptoethanol(0.1毫米)。形成EBs的能力评估视觉使用显微镜和37°C加热阶段。

2.7。统计分析

小动物——一张长有配对以及置信区间的95%被用来分析数据和执行GraphPad棱镜4软件。值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有结果平均值±标准误差。细胞的分布在细胞周期的每个阶段使用ModFit软件计算。

3所示。结果

3.1。NU6140的影响在hEC多能性标记不同的表达和他细胞

首先,我们评估的能力CDK2抑制剂影响在他细胞多能性标记物的表达。使用流仪分析检测转录因子的表达(NANOG OCT4、和SOX2)是结合细胞周期的分析资料。细胞治疗和DMSO溶液治疗他的表达NANOG和OCT4高(95.6%和98.1% NANOG + OCT4 +细胞在DMSO治疗或未经处理的人口)。细胞治疗与诺考达唑或NU6140减少NANOG + OCT4 +细胞群(诺考达唑和NU6140治疗后4.2%和77%,分别地。,图1)和增加细胞的数量没有NANOG OCT4表达式(诺考达唑和NU6140治疗后91.1%和11.3%,分别地)。NANOG之间的显著相关性和OCT4表达相似,在我们之前的研究中发现30.]。在DMSO治疗细胞SOX2所有NANOG + OCT4 +细胞表达,表明SOX2多能性是很重要的。诺考达唑治疗细胞中检测到三个亚种群的细胞,包括那些表达如下:(i)这三个转录因子;(2)只有SOX2没有NANOG OCT4表达式(32 - 34%);(3)没有检测到SOX2表达式(58 - 63%,图1(一))。NU6140治疗最小的影响减少SOX2表达式(2 - 3%的细胞没有SOX2表达式)和存活细胞的数量表达这三个标记(SOX2, NANOG OCT4)高于细胞处理诺考达唑(77 - 86%和4 - 7% NU6140诺考达唑,职责)。TFs的表情变化也发现在人口水平用免疫印迹技术收集所有附着的细胞进行分析(补充材料图可以在网上http://dx.doi.org/10.1155/2014/280638)。他细胞的数量减少治疗后接近与NU6140意义(诺考达唑)和显著()当他们而DMSO溶液处理细胞,表明两个代理能够抑制细胞增殖(补充材料图)。

比较高等商学院NU6140他和细胞的影响,我们进行了类似的实验2012 ep细胞在他前面的实验细胞。TFs 2102年ep细胞的准确检测我们发现一个固定与冰冷的甲醇1.6% PFA和permeabilisation导致最优检测TFs和非特异性最小化信号。减少表达式NANOG和OCT4幸存细胞(51%的NANOG + OCT4 +细胞,图2(一个))中检测出诺考达唑治疗细胞相比对待DMSO NANOG + OCT4 +细胞(94%)。NANOG的表达和OCT4 NU6140治疗后存活细胞高(81%比94% NANOG使用DMSO + OCT4 +细胞,图2(一个))。诺考达唑治疗后SOX2表达细胞的数量coexpressing NANOG和OCT4较低(55 - 59%和84 - 90%)和人口的细胞只表达SOX2更高,与NU6140相比治疗(26 - 30%和4 - 10%)。细胞的数量没有SOX2表达高诺考达唑治疗细胞(13 - 14%)比NU6140治疗细胞(3 - 4%)。贴壁细胞的免疫印迹分析显示显著的变化TFs(补充材料图的表达)。NU6140和诺考达唑明显(、补充材料图有效地减少hEC细胞的增殖。诺考达唑和NU6140类似的影响在他和hEC细胞,但他细胞比hEC更敏感的细胞。

从临床的角度的另一个重要问题是经济复苏后的细胞抑制剂和进一步的去除这些细胞在正常情况下的文化。我们研究转录因子的表达是否恢复诺考达唑或NU6140冲刷后的进一步培养的细胞在一个24小时的新媒介。释放后发现nocodazole-block NANOG和OCT4表达的增加(从4%到77% NANOG + OCT4 +细胞,图1(一))在他细胞里,伴随着减少分组人口没有NANOG OCT4表达式(从91%提高到14%,图1(一))。这个相当快速复苏NANOG和OCT4表情检测24 h后不同于我们以前的报告,没有发现显著增加删除后诺考达唑(30.]。因为他本研究细胞培养基底膜基质馈线表面上但在之前的实验中,我们使用他MEF馈线上培养的细胞首先然后人工基底膜上镀涂层板、培养这些差异可能影响生长速率,集落形成,复苏的细胞。NU6140应用程序及其释放他的人口增加细胞表达NANOG和OCT4从77%到98%(图1(一))。类似SOX2表达式也可检测的变化在他细胞治疗诺考达唑或NU6140和被释放后,他们从这些代理。在治疗使用诺考达唑或NU6140我们发现在细胞释放大量的他只表达细胞表达SOX2和小群SOX2没有NANOG OCT4表达式。SOX2表达细胞的数量没有NANOG OCT4表达式由58 - 63%调整为11 - 12%在诺考达唑治疗和释放细胞,从2 - 3%到0.3% NU6140和释放细胞治疗。

当2102 ep (hEC)细胞被用来代替他细胞,消除诺考达唑导致类似的效果;然而切除NU6140有不同影响所有三个TFs hEC细胞的表达。细胞的数量coexpressing NANOG和OCT4仍然几乎相同NU6140治疗后和删除(81%和80%,分别地。,图2(一个)),但没有增加细胞群SOX2释放后发现(从4%到11%)虽然细胞表达的数量在所有三个TFs保持在一个相似的水平。

他可以恢复细胞多能性标记表达式诺考达唑和NU6140切除后,细胞的数量保持不变,没有显著增加细胞增殖检测(补充图1)材料。诺考达唑治疗类似的效果及其去除hEC细胞中被发现,但NU6140导致持久的抑制的多能性标记SOX2表达式。诺考达唑或NU6140冲刷后,他比hEC细胞细胞更有效地恢复,表明不同的机制调节的表达在他和hEC细胞多能性标记。

3.2。NU6140对hEC CDK2是不同的,他的表达细胞

由于发现他的差异和NU6140 hEC复苏治疗后,我们研究了多能性的水平之间的相关性在他和hEC细胞标记和CDK2表达式。重点主要是多能性标记NANOG SOX2,因为OCT4相关的表达与NANOG的表达。首先是证实,95%的细胞(未经处理和控制DMSO溶液治疗细胞)表达CDK2和他这两个种群之间的细胞以下发现:(i)多数人口表达NANOG和CDK2(96 - 99%)和(2)一个更小的细胞群表达只有CDK2没有NANOG表达式(1 - 2%)。诺考达唑治疗他的细胞导致(i) CDK2减少,NANOG coexpressing细胞(从99%到11%);(2)增加细胞表达CDK2没有NANOG表达式(从0.4%提高到81%,图1 (b));(3)增加细胞的数量没有NANOG CDK2表达式(从0.2%提高到7%,图1 (b))。从诺考达唑释放被捕后,进一步培养的新媒介,所有他细胞恢复CDK2的表达,细胞表达CDK2和NANOG的79%,和15%的细胞表达CDK2没有NANOG表达式(图1 (b))。NU6140代替诺考达唑时,CDK2和NANOG coexpressing细胞清除NU6140后从82%上升到98%,CDK2 + NANOG−分组人口从16%下降到0.9%。细胞没有CDK2表达为阴性SOX2表达的细胞出现这群只有诺考达唑治疗,而不是删除后(图1 (b))。

类似于他的细胞几乎所有未经处理的2102 ep CDK2表示。2102 ep细胞代理诺考达唑和NU6140下调CDK2表达相比,DMSO溶液治疗细胞(26 - 30%和5 - 7% CDK2−细胞诺考达唑或NU6140治疗后,分别地。,图2 (b))。CDK2表达式删除后恢复抑制代理诺考达唑(2 - 3% CDK2−细胞)或NU6140 (3 - 5% CDK2−细胞)。之间的相关性被发现CDK2的差别逐渐对这些基因的表达水平和NANOG和SOX2(图的表达水平2 (b))。诺考达唑和NU6140影响CDK2在hEC细胞中表达,这是不同于NU6140治疗他的细胞,没有发现CDK2表达的变化。

3.3。CDK2抑制剂NU6140积累hEC和他在G2期细胞

由于我们的研究结果显示的效果NU6140 CDK2表达式,我们分析了NU6140对细胞内的分布的影响在他和hEC细胞细胞周期不同阶段,具有不同的细胞周期的概要文件。在他细胞低浓度(1μNU6140 M)对细胞周期的影响最小。更高的浓度(5和10μ米)NU6140增加他的数量在G2 / M期细胞G1期,减少细胞(图3(一个))。更高浓度的NU6140也减少了他在S期细胞的数量。与诺考达唑治疗后,逮捕G2 / M期细胞通过干扰微管的聚合31日),大部分在G2 / M期细胞(图3(一个))。

类似的效果他细胞的细胞周期分布也发现2102 ep细胞NU6140和诺考达唑治疗(图3(一个))。NU6140和诺考达唑增加在G2 / M期细胞的数量和减少它在G1期,对S期的影响最小。

区分细胞属于G2或M阶段我们使用了组蛋白3 (H3)的磷酸化丝氨酸10作为一个特殊的标记细胞在有丝分裂期32]。诺考达唑增加他在有丝分裂期细胞的数量(17%的细胞具有磷酸化H3丝氨酸10诺考达唑治疗后2% DMSO溶液治疗后相比,数字3 (b))。没有增加的H3磷酸化Ser10 NU6140治疗后(1.9 - -2.5%),显示这些细胞G2积累最好,不是M阶段;这种效果是类似于hEC细胞(数据未显示)。

找出NU6140或诺考达唑是否影响CDK2在细胞在有丝分裂期的表达我们估计CDK2与磷酸化H3细胞中的表达水平。在他细胞接受诺考达唑CDK2的表达水平低在有丝分裂期细胞(CDK2和phospho-Ser10-histone)表达,在细胞明显高于其他细胞周期阶段(图3 (b))。类似的低水平的CDK2在M阶段检测通过应用NU6140浓度增加。当平均荧光值的两个细胞群(CDK2 +细胞有无磷酸化H3)相比,较低的表达CDK2在细胞在有丝分裂期细胞相比,在其他细胞周期阶段NU6140后检测到应用程序(图3 (c))。

3.4。NU6140凋亡他和hEC细胞的数量增加

自NU6140治疗减少附着他的数量细胞和多能性的表达下调表达标记NANOG OCT4, SOX2,我们问是否这些影响可能是由于他细胞的凋亡。裂解半胱天冬酶3被用作晚期凋亡标记检测粘附细胞内凋亡细胞数量表达NANOG多能性标志。NU6140治疗诱导半胱天冬酶3的乳沟他4.3%的细胞没有NANOG表达式和2.2%的细胞仍然表示NANOG(图4(一))。诺考达唑诱导细胞凋亡在他细胞(17.7%的裂解半胱天冬酶3阳性细胞,图4(一)),但NANOG表达不是在大多数细胞凋亡检测。

hEC细胞NU6140凋亡细胞的数量增加0.6%的裂解半胱天冬酶3阳性细胞不表达NANOG和7.8%的细胞仍然表达NANOG(图4 (b))。在诺考达唑治疗hEC细胞4.4% cleaved-caspase-3-positive没有表示NANOG NANOG表达式和9.8%的细胞。

自裂解半胱天冬酶3报道调解他细胞分化[33),我们分析了NU6140对待他细胞的表达GATA4早期分化的标志(34,35]。在我们的研究中发现少量GATA4表达细胞在DMSO和未经处理的他细胞治疗。NU6140治疗后细胞的数量表达GATA4略有增加(4.3%相比2.3% GATA4 +细胞NU6140或DMSO溶液处理后,分别地。,图4 (c))。大多数GATA4表达细胞也表达了NANOG在NU6140, DMSO,和未经处理的细胞,这表明表达多能性标记和分化标记中可以检测到相同的细胞在分化的早期阶段。

3.5。NU6140是有效地降低NANOG、OCT4、SOX2表达Nocodazole-Arrested他和hEC细胞

CDK2抑制剂已报告拥有逮捕G1期细胞的能力与nocodazole-induced有丝分裂块同步后8]。我们测试的影响NU6140 nocodazole-arrested细胞与诺考达唑缩短治疗周期后(10 h代替24 h)为了获得更高的存活细胞的数量。在他和hEC细胞细胞的数量coexpressing NANOG而OCT4有所下降由于诺考达唑被捕(图5)。经过仔细清洗用新鲜mTeSR1维护中细胞治疗进一步14 h中包含10μM NU6140。这进一步治疗的细胞与NU6140更有效地减少NANOG和OCT4的表达。与诺考达唑联合治疗紧随其后NU6140导致他25%和26% hEC细胞不表达任何三个助教(NANOG−OCT4−SOX2−细胞)中幸存的细胞。治疗与诺考达唑或独自NU6140没有有效地减少所有三个TFs的表情。与诺考达唑联合治疗紧随其后NU6140更有效地减少表达他的所有三个TFs细胞比hEC细胞,尽管倾向是相同的。我们还检测了复苏的细胞表达NANOG, OCT4、SOX2冲刷后诺考达唑或NU6140(图10 h后治疗5)和获得的结果类似于24小时治疗期(数字1(一),2(一个))。

图5 (e)显示了他在治疗后细胞群体结构的变化与诺考达唑和NU6140。诺考达唑治疗导致殖民地结构重大变化和幸存的细胞具有特定特征的细胞在有丝分裂期被捕(圆形大细胞)。删除后诺考达唑更少的圆形细胞被发现和新小殖民地的形成是公认的。NU6140诺考达唑治疗后治疗没有反向诺考达唑的影响,但圆形细胞检测和治疗后剩余的殖民地类似NU6140孤单。NU6140治疗仅删除殖民地的单细胞层边缘和细胞位于中心的多单元的层幸存了下来。后删除NU6140他细胞只殖民地由多单元的层。细胞治疗NU6140紧凑,结构紧密的殖民地,似乎保护他细胞和支持细胞生存(图5 (e))。

3.6。胚状体的身体他的形成与NU6140细胞治疗后发生

下一个重要的问题的回答是NU6140治疗和释放他细胞能否维持多能性,形成殖民地。众所周知,集落形成包括四个阶段:依恋,迁移、聚集,形成36]。删除NU6140,另有3天后文化没有进一步传播集落形成发现(图6(a))。当他细胞多能性因子的表达进行分析,42%的细胞表达NANOG OCT4、SOX2 NU6140治疗后3天。在未经处理的他细胞培养他同期60%的细胞表达了所有三个TFs(图6(b))。为了区分从已分化细胞的未分化细胞,分化标记GATA4(内胚层的血统),OTX-2(外胚层的血统),和HAND1(中层血统)。OTX-2表达细胞(13.2%)和一些GATA4表达细胞(1.8%)检测到从NU6140释放后,进一步文化3天,表明一些分化过程已经开始了。相比之下,在未经处理的细胞培养为同一时期12.8% OTX-2表达细胞被检测到,但是没有GATA4和HAND1表达细胞。在治疗和NU6140治疗细胞分化成外胚层的血统(OTX-2表达式)发现,当他细胞培养的条件支持多能性状态。

接下来,我们应用常见的拟胚体(EBs)形成协议为了描述NU6140治疗和释放他细胞的分化能力。NU6140治疗他的细胞没有影响EBs(图的形成6(a))。4天后,拟胚体进行分析的表达式外胚层(SOX1),中胚层(Brachyury)和内胚层(SOX17)标记和多能性标记OCT4同时利用流量仪的方法。我们可以检测到低数量的外胚层的标记SOX1表达细胞EBs由NU6140治疗细胞EBs由未经处理的他相比(39%比78%,图6(c))。中胚层标记Brachyury表达细胞的数量也在EBs由低NU6140治疗细胞治疗EBs(39%比71%)。内胚层的标记SOX17表达式中检测出4.5%的EBs由NU6140对待他细胞,但在未经处理的EBs SOX17表达式只发现在细胞的2.7%。OCT4表达细胞的数量在EBs由高NU6140对待他细胞(17 - 21%)比未经处理的他细胞(1.9 -2.8%)。OCT4表达式中没有检测到这些细胞,表达了Brachyury SOX1,还是SOX17(图6(c))。细胞在细胞周期阶段相似的分布在EBs由NU6140对待他从未经处理的细胞或细胞(62%,23%,15%和61%,18%,21%,G0G1,年代,G2 / M期,职责)。

4所示。讨论

CDK2的灵活性允许交互与不同的配体分子调节级数和适当的细胞周期动力学。在这项研究中,我们专注于小分子NU6140相竞争与ATP结合CDK2的复杂和细胞周期蛋白(11,12]。我们的实验使用NU6140治疗集中在细胞多能性标记的表达模式的变化对人类胚胎干细胞H9(他)和胚carcinoma-derived 2102 ep细胞(hEC)。我们发现他和hEC在抑制细胞敏感的表达NANOG和OCT4诺考达唑或NU6140,而影响SOX2诺考达唑治疗后表达更明显。切除后诺考达唑或NU6140 NANOG的表达,OCT4、和SOX2在他恢复细胞;类似的趋势中检测出hEC细胞诺考达唑治疗后和释放。CDK2抑制与NU6140影响他细胞分化的能力。分析拟胚体(EBs)透露,分化成外胚层和中胚层细胞系的影响在EBs由NU6140对待他细胞比EBs从未经处理的他。

几个CDK抑制剂已被证明有效的抑制增殖和诱导细胞凋亡在各种肿瘤细胞(37]。我们的发现应用NU6140也增加他和hEC细胞的凋亡和抑制增长预期。的影响NU6140 SOX2多能性标记的表达,NANOG, OCT4没有然而据报道在这项研究。癌的表达TFs被发现在许多癌症治疗结果差的(25]。因此重要的是要理解潜在的医疗人员的能力调节癌TFs使用的表达谱在体外测试。敏感性的差异在他和hEC细胞NU6140发现在这项研究中不同角色的CDK2-cyclin复杂的形成和它的重要性在调节三个转录因子的表达。

治疗NU6140有影响他细胞的分化能力。所有三个生殖细胞层被发现在拟胚体(EBs)由NU6140他治疗细胞形成;然而承诺到内胚层的血统有点高,外胚层和中胚层血统低相比EBs从未经处理的细胞。By应用流仪方法EBs的分析我们能够同时检测分化,在单个细胞多能性标记。EBs和启动前三天从NU6140释放后,他显示细胞倾向于区分NANOG表达的减少和OCT4与早期的表达增加(43%)和外胚层的标记OTX-2 (13%)。OTX-2表达式的增加在EBs报多能性的差别与对这些标记OCT4 [38]。我们在这项研究中发现,高达20%的EBs由NU6140治疗细胞表达OCT4到了第四天,虽然只有2 - 3% EBs OCT4从未经处理的细胞中表达。细胞表达SOX1(外胚层的标记),SOX17(内胚层的标记),或Brachyury(中层标记)并没有表达OCT4,表明EBs包含分化以及一些OCT4表达细胞。另一项研究发现一个长期持久的表达分化的多能性标记OCT4 EBs EBs的开始后12天(39]。我们发现分化多能性标记,检测在细胞分化的早期阶段符合我们之前的研究,揭示多能性标记的表达逐渐减少伴随着逐渐增加在内胚层的标记的表达(40]。的差异我们发现在细胞进入内胚层的承诺,未经处理的他细胞间的外胚层和中胚层的血统和那些接受NU6140表明抑制CDK2 NU6140可能会带来长期的后果。治疗他的细胞NU6140也可能诱导后生变化,但还需要进一步的研究来回答这个问题。

据报道,M细胞逮捕并释放阶段,以及在S期细胞,CDK2抑制剂(更敏感8,9]。我们的研究结果证实他细胞S期较长,治疗更敏感比hEC NU6140细胞。我们还测试了联合治疗,细胞首先接受诺考达唑(逮捕细胞在有丝分裂期),然后NU6140。诺考达唑联合治疗,然后NU6140 NANOG表达的减少更有效率,OCT4、SOX2在他和hEC细胞比单独治疗。然而他细胞具有更高的敏感性比hEC细胞治疗与个人代理或代理的总和。

有几个他和hEC细胞之间的差异可以解释他们的不同的敏感性。SOX2高表达水平和OCT4中发现了hEC细胞,表达的OCT4亚型(hEC OCT4A, OCT4B等)细胞(41,42),超表达SOX2在某些hEC细胞系(43),和低分化能力表明多能性因素的控制比他更复杂的hEC细胞细胞。302年他细胞371/372/373的microrna并模拟集群与多能性相关抑制心脏或neural-lineage感应(44]。在睾丸生殖细胞肿瘤的存在microrna - 372和microrna - 373据报道,而miRNA302集群是未被发现的45]。这些作者(45)也报道,microrna - 372和microrna - 373可以中和p53-mediated CDK抑制,使肿瘤细胞的生长。各级综合所有这些差异的调节hEC细胞多能性表明,TFs的表达是不像在他严格控制细胞。

在他和hEC细胞之间的关联的表达式CDK2 SOX2在治疗后存活的细胞被发现与NU6140和大多数细胞表达SOX2也表示CDK2。我们的研究结果认为CDK2表达式需要转录因子表达式和任何改变活动/表达式影响首先NANOG OCT4然后SOX2在他细胞中表达,指出可能的额外角色SOX2在细胞的自我更新和增殖能力。CDK2和差别逐渐对这些发现SOX2在诺考达唑或NU6140对待他和hEC细胞。另外只有少数GATA4表达细胞NU6140治疗后他发现细胞,这可能表明CDK2活动所需细胞生存和适当的分化。分析他细胞磷酸化的动力学在分化为胚胎外的血统(内胚层等)已经表明,转录因子的高表达和正常细胞周期配置文件启动他的关键细胞分化[19]。

在这项研究中,我们已经表明,CDK2在M阶段逮捕的表达细胞(诺考达唑治疗)低于正常循环细胞。在未经处理的细胞,在DMSO我们发现类似的表达水平CDK2独立于细胞周期的阶段。哺乳动物细胞可能可以忍受失去CDK2(通过从其他CDKs CDK1额外的支持,到,或CDK6),但CDK2活动需要细胞增殖(46]。CDK1 /细胞周期蛋白复合物被专门涉及衰减组蛋白基因的表达在S期的结束47]。然而,在实体肿瘤,包括乳腺癌、细胞周期素E和超表达的细胞周期蛋白的过度表达与[不良预后有关48]。它已经表明,紫杉醇(破坏微管动态和诱导有丝分裂逮捕)可以增加CDK1细胞特定的活动,尽管有些细胞耐药。基线CDK2活动也是高肿瘤敏感紫杉醇(49]。CDK1报道是重要的调节有丝分裂(50]。CDK1和CDK2因此可能需要适当的有丝分裂期条目。在我们的研究中有丝分裂期细胞被捕诺考达唑(应用程序)NANOG的表达减少,OCT4、SOX2在他和hEC细胞。然而释放nocodazole-arrest恢复所有三个TFs存活细胞的表达。没有增加的数量虽然幸存细胞,表明这些细胞,没有检测到CDK2 SOX2表达式,就无法生存。为什么NU6140治疗及其去除造成持久的影响减少TFs进一步集落形成的表达可以解释为CDK2的差别逐渐对这些基因的表达。NU6140抑制其他交互的影响各种CDKs也可能有助于抑制多能性因子的表达,需要进一步调查。

CDK2抑制剂NU6140增加细胞凋亡的影响,并积累细胞G2 / M期早些时候报道了海拉宫颈癌细胞(13]。小说我们的研究发现3组蛋白磷酸化后减少治疗NU6140高等商学院在他细胞和细胞,表明NU6140抑制进入有丝分裂期和逮捕在G2期细胞。作为NU6140抑制CDK2通过竞争的活动绑定到ATP站点(11,12),我们发现NU6140没有迅速下调CDK2表达式,CDK2活动而不是表达水平是重要的细胞从G2 M期细胞周期。另一个广谱CDK抑制剂(roscovitine)也已被证明能够降低有丝分裂控制基因的表达,并防止HT29人类结肠癌细胞进入有丝分裂(51]。

针对TF表达在肿瘤细胞是一种很有前途的和有吸引力的方法寻找新的治疗方法。已经表明,击倒OCT4、NANOG在胰腺癌细胞减少了增殖,迁移,入侵,药物抗性,肿瘤发生[52]。根据我们的研究结果的表达SOX2可以选择消除癌细胞和癌的目标属性。最近,它已被证明,抑制SOX2减少胃癌细胞的增殖和迁移,增加了细胞凋亡,诱导细胞周期的变化在体外,减少了在活的有机体内肿瘤发生的潜在的(53]。癌细胞和癌的有效消除属性代理的联合治疗可能更有效,与诺考达唑和NU6140成功显示在我们的研究中。我们也产生了一种筛选方法来检测表达模式的三个TFs通过使用多色仪分析流动。多色流仪结果可能是一个有用的工具为筛选不同的潜在的医疗人员和他们的组合治疗他的细胞和癌细胞在体外。通过应用本研究中描述的方法创建知识至关重要的新方法来消除癌细胞和干细胞特征可能获得。

5。结论

这项研究的结果指出CDK2-cyclin复杂的活动之间的联系和自我更新和多潜能维护他和hEC细胞。调制的活动与NU6140减少转录因子的表达,NANOG OCT4、SOX2。他细胞更敏感比hEC细胞抑制剂NU6140。在拟胚体由NU6140对待他外胚层和中胚层细胞承诺血统的影响相比拟胚体形成于未经处理的细胞。与诺考达唑联合治疗(细胞逮捕,然后处理NU6140)更有效地减少所有三个转录因子的表达比诺考达唑治疗或NU6140单独在他和hEC细胞。此外,应用多参数流量仪的方法同时检测单个细胞的多潜能分化标记可能是一个有用的工具在体外筛选以设计新颖的医疗人员调节癌癌细胞的属性。

利益冲突

作者没有利益冲突声明关于本文的发表。

作者的贡献

正面卡拉斯负责构思、设计和执行的实验,统计分析,解释公布的数据,准备和本文的编辑。安妮卡Trei培养他,hEC细胞和EBs的实验。Toivo Maimets和马丁普克编辑。最后论文阅读和批准所有的作者。

确认

这项工作是爱沙尼亚的研究经费支持的教育和研究(格兰特不,SF0180100s08),由爱沙尼亚格兰特研究委员会(374),和塔尔图大学(爱沙尼亚)。

补充材料

引用

1. 即Bartova、j . Koča和m . Otyepka”功能的灵活性人类细胞周期蛋白依赖性kinase-2及其进化的保护,”蛋白质科学,17卷,不。1,22-33,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j . bloom:阿库拉,n . Pattabiraman“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的选择性和效力。”aap日报,8卷,不。1,E204-E221, 2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. g·夏皮罗,“细胞周期蛋白依赖性激酶通路作为癌症治疗的目标,“临床肿瘤学杂志,24卷,不。11日,第1783 - 1770页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. m·p·托马斯和c .麦克因尼斯”,基于结构的发现和优化潜在的癌症疗法针对细胞周期,”IDrugs,9卷,不。4、273 - 278年,2006页。视图:谷歌学术搜索
5. 奥尔特加,普列托,j . Odajima et al .,“细胞周期蛋白依赖性激酶2是必不可少的的有丝分裂细胞分裂减数分裂而不是老鼠,”自然遗传学,35卷,不。1,25-31,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. c . Berthet e·阿利诉科波拉,l . Tessarollo p·卡尔迪,”Cdk2基因敲除小鼠是可行的,”当代生物学,13卷,不。20日,第1785 - 1775页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. o . Tetsu f·麦考密克,“尽管CDK2抑制癌细胞扩散,”癌症细胞,3卷,不。3、233 - 245年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. b . Hu j . Mitra S . van den Heuvel,和g·h·恩德斯”年代,G2期角色Cdk2揭示了诱导表达的显性负突变在人类细胞,”分子和细胞生物学,21卷,不。8,2755 - 2766年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c . b . Matranga和g·夏皮罗,“选择性敏感flavopiridol-induced转化细胞的凋亡招募s阶段后,“癌症研究,卷62,不。6,1707 - 1717年,2002页。视图:谷歌学术搜索
10. d . Etemadmoghadam g . au yeung m .墙et al .,“抵抗CDK2抑制剂与多倍体CCNE1-amplified卵巢癌细胞的选择,”临床癌症研究,19卷,不。21日,第5971 - 5960页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. t·g·戴维斯,j·本特利,c, e .棱et al .,“小有力purine-based细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的设计,“自然结构生物学,9卷,不。10日,745 - 749年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. t·g·戴维斯·d·j·普拉特,j·a·恩迪科特·l·n·约翰逊,和m . e . m .高贵,“小细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的设计,”药理学和治疗,卷93,不。2 - 3、125 - 133年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. m . Pennati a·j·坎贝尔,m . Curto et al .,“势差现象小说paclitaxel-induced凋亡的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂NU6140:一个可能的角色存活素下调,“分子癌症治疗,4卷,不。9日,第1337 - 1328页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r . m . s . Bhattacharya射线,l·r·约翰逊“细胞周期蛋白依赖性激酶调节肠道上皮细胞的凋亡,”细胞凋亡,19卷,不。3、451 - 466年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. m . Schuldiner o . Yanuka j . Itskovitz-Eldor d·a·梅尔顿和n . Benvenisty”八个生长因子对细胞分化的影响来自人类胚胎干细胞,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷97,不。21日,第11312 - 11307页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. j . Itskovitz-Eldor m . Schuldiner d Karsenti et al .,“人类胚胎干细胞分化成胚状体的身体损害三个胚胎胚芽层,”分子医学》第六卷,没有。2、88 - 95年,2000页。视图:谷歌学术搜索
17. j·a·汤姆森j . Itskovitz-Eldor s s·夏皮罗et al .,”来自人类囊胚的胚胎干细胞系。”科学,卷282,不。5391年,第1147 - 1145页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. k·a·贝克尔,p . n . Ghule j . a . Therrien et al .,“支持人类胚胎干细胞的自我更新细胞周期G1期缩短,“细胞生理学杂志,卷209,不。3、883 - 893年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j·d·范霍夫穆尼奥斯,s . r . Braam et al .,“磷酸化动力学在早期人类胚胎干细胞的分化,“细胞干细胞,5卷,不。2、214 - 226年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. a . a . Filipczyk a . l . Laslett c .哑剧演员和m . f .啤梨”分化是耦合的变化人类胚胎干细胞的细胞周期的监管机构,”干细胞研究,1卷,不。1、45 - 60,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. Neganova, x张、美国阿特金森和m . Lako”表达和G1年代管理组件的功能分析揭示了一个重要角色CDK2在人类胚胎干细胞细胞周期调控中,“致癌基因,28卷,不。1、20 - 30,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. t . Maimets Neganova, l·阿姆斯特朗和m . Lako”激活p53的nutlin导致快速分化人类胚胎干细胞,”致癌基因,27卷,不。40岁,5277 - 5287年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. a . Rizzino“转录因子,像主监管机构在哺乳动物胚胎发生函数作为分子可变电阻,”生物化学杂志2008年,卷411,pp. e5-e7。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. c .辛德雷和a·菲尔波特“细胞周期和多能性”,生物化学杂志,卷451,不。2、135 - 143年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. Ben-Porath, m·w·汤姆森诉j·凯里et al .,“胚胎干细胞的基因表达特征在人类肿瘤低分化咄咄逼人,“自然遗传学,40卷,不。5,499 - 507年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. 柴提,f·w·Pagliuca c·欧诺瑞A . Kweudjeu A . Rezania和d·A·梅尔顿”一个简单的工具来提高多能干细胞分化,“自然方法,10卷,不。6,553 - 556年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. r .朋友m . k . Mamidi a . k . Das和r . Bhonde“多样化的影响二甲亚砜(DMSO)在人类胚胎干细胞的分化潜能,”档案的毒理学,卷86,不。4、651 - 661年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. p . o . Krutzik g·p·诺兰,“细胞内phospho-protein染色流式细胞术的技术:监控单个细胞信号事件,“血细胞计数部分,55卷,不。2、61 - 70年,2003页。视图:谷歌学术搜索
29. p . o . Krutzik m . r .杂乱和g·p·诺兰,“协调分析小鼠免疫细胞表面标记流式细胞术和细胞内磷蛋白质,”免疫学杂志,卷175,不。4、2357 - 2365年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. a·卡拉斯,m·普克m . Maimets k·齐默尔曼,和t . Maimets,”诺考达唑治疗减少表达多能性标记Nanog在人类胚胎干细胞Oct4,”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。4篇文章ID e19114 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. m . j . de Brabander R . m . l . van de Veire f·e·m·Aerts m .风满楼,p·a·詹森的影响甲基氨基甲酸(5 - (2-thienylcarbonyl) 1 h-benzimidazol-2-yl), (R 17934;NSC 238159),一个新的合成antitumoral药物干扰微管,哺乳动物细胞体外培养的。”癌症研究,36卷,不。3、905 - 916年,1976页。视图:谷歌学术搜索
32. b . Perez-Cadahia b . Drobic和j·r·戴维”H3磷酸化:双重角色在有丝分裂间期,“生物化学和细胞生物学,卷87,不。5,695 - 709年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. j . Fujita a . m .起重机m . k . Souza et al .,“半胱天冬酶活性介导胚胎干细胞的分化,“细胞干细胞,卷2,不。6,595 - 601年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. m .理念,j。傅,p . Delgado-Olguin et al .,“直接重组成纤维细胞成心肌细胞功能的因素,定义”细胞,卷142,不。3、375 - 386年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. p .黄,z, s . et al。”功能hepatocyte-like细胞小鼠成纤维细胞的诱导因素,定义”自然,卷475,不。7356年,第391 - 386页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. j·m·金工程学系。月亮,S.-J。公园et al .,“百日咳毒素增强殖民地enzymatic-dissociated组织单一的人类胚胎干细胞,”干细胞与发展,22卷,不。2、307 - 319年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. 诉Kryštof和s . Uldrijan“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂作为抗癌药物,”目前的药物靶点,11卷,不。3、291 - 302年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. s . Malchenko j .谢m . de法蒂玛Bonaldo et al .,“玫瑰发作期间形成自发的神经分化hESC hiPSC殖民地,“基因,卷534,不。2、400 - 407年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. m . Pekkanen-Mattila m . Pelto-Huikko诉Kujala et al .,“时空表达模式的人类胚胎干细胞分化中胚层标记拟胚体,“组织化学和细胞生物学,卷133,不。5,595 - 606年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. a·卡拉斯,m·普克a Trei, t . Maimets”SOX2监管不同于NANOG OCT4在人类胚胎干细胞在分化早期启动与丁酸钠”干细胞国际文章ID 298163卷,2014年,12页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. m·A·Rijlaarsdam h·A·d·m·范·Herk A·j·m·吉利斯et al .,“具体检测OCT3/4同种型A / B / B1表达在固体(生殖细胞)肿瘤细胞系:确认OCT3/4生殖细胞肿瘤的特异性,”英国癌症杂志》上,卷105,不。6,854 - 863年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. m . h . Asadi s . j . Mowla f . Fathi a . Aleyasin j . Asadzadeh和y Atlasi”OCT4B1 OCT4的小说拼接的变体,是高度表达在胃癌和作为抗凋亡因子,”国际癌症杂志》上,卷128,不。11日,第2652 - 2645页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. b·布尔j .科普s Mallanna et al .,“提升Sox2在胚胎性癌的水平细胞和胚胎干细胞抑制Sox2的表达:Oct-3/4目标基因,”核酸的研究,35卷,不。6,1773 - 1786年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. x h·帕森斯,“微分析揭示了不同的机制调节心脏和神经lineage-specification多能人类胚胎干细胞,”干细胞研究与治疗》杂志上,卷2,不。3,第124条,2012年。视图:谷歌学术搜索
45. p . m . Voorhoeve c .鼠尾草,m . Schrier et al .,”蕴涵的遗传屏幕microrna的373 - 372和microrna -致癌基因在睾丸生殖细胞肿瘤,”细胞,卷124,不。6,1169 - 1181年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. k·a·梅里克l . Wohlbold c . Zhang et al .,“切换Cdk2打开或关闭与小分子揭示需求在人类细胞增殖,”分子细胞,42卷,不。5,624 - 636年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. m . m . Koseoglu l . m .坟墓,w . f . Marzluff”61年苏氨酸磷酸化通过细胞周期蛋白/ Cdk1触发茎环结构结合蛋白的降解在S期结束时,“分子和细胞生物学,28卷,不。14日,第4479 - 4469页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. k . Keyomarsi d孔蒂Jr . w . Toyofuku m·p·福克斯,“放松管制乳腺癌细胞周期素E的”致癌基因,11卷,不。5,941 - 950年,1995页。视图:谷歌学术搜索
49. s . Nakayama y Torikoshi, t .高桥et al .,“紫杉醇敏感性的预测CDK1和CDK2活动在人类乳腺癌细胞,”乳腺癌研究,11卷,不。1,文章R12, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. e·a·尼格”,有丝分裂激酶是细胞分裂的监管者和检查点,”自然评论分子细胞生物学,卷2,不。1,21-32,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. s r·维特克r·h . Te Poele陈f . et al .,“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂seliciclib (R-roscovitine;CYC202)有丝分裂控制基因的表达减少和防止进入有丝分裂,”细胞周期》第六卷,没有。24日,第3131 - 3114页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. y, h·朱,h . et al .,“Oct4击倒,Nanog具备干细胞表达抑制胰腺癌细胞,”癌症的信,卷340,不。1,第123 - 113页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. k .晚间r . Mejias-luque k Farsakova et al .,“干细胞因子SOX2调节人类胃癌细胞的致瘤的潜力,”致癌作用,35卷,不。4、942 - 950年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

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