的分布的变化α3 Na⁺/ K⁺atp酶亚基在杂合的骗子浦肯野细胞的遗传模型在开发过程中慢性去极化

文摘

excitotoxic机制在神经系统的一个共同的假设是,谷氨酸受体的过度刺激产生的离子失衡,增加了Na⁺和Ca^{+ +}涌入了细胞能量代谢系统导致细胞死亡。本研究的目的是考察慢性Na⁺通道泄漏电流在发展中浦肯野细胞杂合的骗子突变体(+ /信用证)影响的表达和分布α3亚基的Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶泵、体内平衡体系的重要组成部分,维护在神经元离子平衡。催化的表达模式α3 Na⁺/ K⁺atp酶亚基是由免疫组织化学分析、组织化学和西方的屁股在野生型(WT)和+ /信用证小脑在产后几天P10, P15 P25决定如果有活动Na的分布的变化⁺/ K⁺在退化浦肯野细胞atp酶亚基。结果表明,催化的表达α3亚单位在长期去极化的+ /改变信用证浦肯野细胞,尽管活跃Na的密度⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶泵不显著改变与WT在P15小脑皮层,然后下降从P15 P25 + /信用证小脑+ /信用证浦肯野细胞退化。

1。介绍

Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶泵(钠/钾泵)在神经元中发挥着关键作用在维持正常功能的跨膜电流梯度,是至关重要的。成熟的泵位于质膜和出口3 Na⁺每两个K离子⁺离子它进口的成本1 ATP分子,导致净出口,超极化电流(1]。在健康小脑浦肯野细胞,增加钠-钾泵的表达水平在产后发展与逐步超极化的浦肯野细胞的膜电位2,3]。钠-钾泵包含α(α)和β(β)单位,虽然在某些细胞类型泵包含额外FXYD蛋白(4,5]。至少有4个亚型α亚单位和3亚型的β亚基。的α亚基的催化单元和负责绑定Na⁺和K⁺离子、ATP和乌本苷(抑制剂)。的β亚基结构中扮演着关键角色和成熟的钠/钾泵,包括,例如,协助跟踪的α亚基从内质网到质膜的6]。小脑浦肯野细胞只表达α3和β1亚基,但其他一些小脑神经元(例如,篮子细胞)或结构(例如,颗粒细胞层肾小球)也表达了α3亚基(7]。FXYD家族蛋白质,FXYD1 (Phospholemman),也表示在小脑浦肯野细胞和分子层(8),但这种蛋白质并没有分析研究。

神经元钠/钾atp酶活动可能造成高达240 pA静止膜电位和泵活动增加神经元的功能活动(3]。钠-钾泵活动的变化也与适应性反应的神经元缺氧,缺血,细胞死亡(5,9]。然而,泵活动是否增加或减少,以应对严重的细胞损伤模型似乎依赖于细胞类型或损伤模型(10- - - - - -13]。有证据表明,钠/钾泵活动是直接受多种细胞第二信使信号系统。例如,一氧化氮(NO) / cGMP胞内信号可以下调钠-钾泵的活动(10]。相反,在小脑浦肯野细胞,一氧化碳(CO)和谷氨酸可以通过cGMP行动促进持续增加钠-钾泵的活动(14]。excitotoxic条件下、过氧亚硝基和活性氧反应与钠/钾泵停用它(15,16]。一般来说,excitotoxic机制相关的神经元谷氨酸受体的过度刺激导致增加Na⁺和Ca^{+ +}涌入,使得细胞能量代谢系统导致细胞死亡(17,18]。增加和减少钠/钾泵活动理论上可能与神经或细胞死亡相关推广活动。在长期的去极化的神经元,增加钠/钾减少细胞内钠泵的活动可以看到⁺帮助恢复细胞内稳态水平,但需求增加ATP可能是有害的。另外,减少钠/钾泵活动受伤的细胞可能允许增加细胞内Na⁺,但不活跃的ATP需求减少钠/钾泵可能是神经。

最近的一项研究HEK293细胞表达δ2谷氨酸受体(GluRδ2)与骗子突变,GluRδ2^信用证发现,突变体的异位表达培养细胞受体导致ATP水平下降(19]。的信用证突变GluRδ2受体变成一个既定的打开长期去偏光膜通道表达突变的细胞受体(20.]。在HEK293在体外研究中,作者推测,在激活钠-钾泵的应对慢性Na⁺泄漏可能消耗细胞ATP水平导致细胞死亡(19,21]。本研究的目的是检查慢性Na⁺泄漏电流的突变GluRδ2^信用证在发展中杂合的浦肯野细胞受体骗子(+ /信用证)老鼠突变影响的细胞分布α钠-钾泵3子单元和活跃。

GluR基因δ2受体是首次发现基于其同源性谷氨酸NMDA和AMPA受体,但受体不绑定到大多数谷氨酸受体激动剂或拮抗剂,似乎也不带膜电流在正常情况下。GluRδ2是优先小脑浦肯野细胞中表达,在+ /信用证突变,小脑浦肯野细胞成为长期的去极化的第一个当GluR产后一周δ2受体插入在浦肯野纤维cell-parallel突触。大多数的+ /信用证浦肯野细胞退化在产后生活开始的第一个月第一周结束时通过路径被称为凋亡,自噬或坏死(19,20.,22,23]。颗粒细胞的死亡是由于神经元的损失他们的主要目标人群,浦肯野细胞:在年底出生后的第二个月,几乎所有的浦肯野细胞和颗粒细胞的90% + /已经退化信用证小脑(24]。我们之前曾推测,在+ /细胞死亡通路被激活信用证浦肯野细胞,造成的慢性去极化本构阳离子GluR泄漏电流δ2^信用证通道强调了神经元的离子交换和能源生产系统(25,26]。支持这一假说,我们先前已经表明,细胞色素氧化酶活动在+ /大幅度增加信用证浦肯野细胞通过P25 [26在+ /)和钙水平升高信用证浦肯野细胞在体外(27]。此外,+ /远端树突信用证浦肯野细胞含有大量的线粒体扩张,表明线粒体功能障碍(28]。+ /信用证浦肯野细胞也含有更高水平的一氧化氮合酶(NOS)活性和蛋白质硝化(25]。在应对慢性去极化刺激线粒体活动可能会增加活性氧的生产(ROS)和增加细胞内钙^{+ +}不会刺激生产。没有和自由基反应形成过氧亚硝基,高活性氧化剂可以伤害和杀死细胞酪氨酸硝化的关键蛋白质和膜脂质过氧化作用[29日,30.]。这项研究的结果表明,钠/钾泵催化的表达α3亚基增加,或者至少更加集中,在单独的+ /信用证浦肯野细胞通过P25。然而,随着+ /信用证浦肯野细胞退化,P25总表达水平α3及其在+ / 40 kD分解产物信用证小脑与WT小脑相比下降。钠-钾泵化验的密度活跃体外不是改变P15,峰值附近的+ /信用证浦肯野细胞死亡,减少在P25当有剩余+ /相对较少信用证浦肯野细胞。我们的解释的结果是,尽管表达α在个人+ / 3亚基可能会增加信用证浦肯野细胞的慢性压力,潜在的增加整体泵ATP酶活性和ATP的消费将增加表达α3亚基可能会受到许多的失活和/或退化α3单元。

2。实验程序

2.1。动物

GluRδ2^{+ /信用证}突变和GluRδ2^{+ / +}野生型(WT)幼崽通过交配B6CBACa生成^w-J/ A-Grid2^信用证与WT / J雄性雌性(C57BL / 6 J),从杰克逊实验室。所有的动物都被安置在标准条件(14个小时光,10小时黑暗)在动物设施在马里兰精神病学研究中心和提供食物和水随意。男性是后宫一男两个雌性交配。出生的日子算作产后第0天(P0)。动物设施完全由美国认证协会认可的实验室动物保健(AAALAC)和研究按照指南进行护理和使用实验动物由美国国立卫生研究院提供。

小鼠安乐死通过心脏灌注0.9%盐水其次是4%多聚甲醛(虽然与Euthasol深麻醉,> 100μg / g)或斩首。后用4%多聚甲醛灌注,大脑从头骨,后缀为2小时,然后用20%蔗糖磷酸10毫米cryoprotected健壮的盐水(PBS)。至少48小时后,固定的大脑被嵌入在10月异戊烷和冷冻。斩首后,新鲜的大脑都是一分为二的解剖和冻结在铝箔钠-钾离子泵活性测定或小脑被隔离在碎干冰和冷冻免疫印迹分析。

2.2。免疫组织化学

固定的,冷冻的大脑被削减时12μ在徕卡m低温恒温器,直接在幻灯片,收集并存储在−70°C到彩色。免疫荧光研究在10毫米PBS的冲洗),其次是孵化0.1两个变化的甘氨酸为5分钟。内源性荧光降低了孵化的部分在50 mM氯化铵为1小时。的部分然后在10毫米PBS冲洗三次,然后孵化一个小时在屏蔽解决方案包含3%正常山羊血清和特里同x - 100年的0.3%。部分被孵化在一夜之间主要的抗体在4°C。部分与兔多克隆抗-双标记α1 (m·布劳斯汀博士的礼物)或兔多克隆抗α3钠/钾atp酶(北部,现在微孔,1/500:和鼠标单克隆anti-calbindin(σ,1/5000)或兔多克隆anti-activated caspase-3(研发、1/500)和单克隆鼠标反α3 Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶(ABR亲和力BioReagents,热科学皮尔斯抗体,1/250)。部分是在PBS冲洗3次,然后孵化2小时,使二次抗体(anti-mouse或anti-rabbit Alexa 594和Alexa 488,分子探针,1/200)。孵化后,他们在10毫米冲洗一次PBS和300海里DAPI孵化,然后在10毫米PBS冲洗3次,一次蒸馏水和盖玻片凝胶。完成的幻灯片被拍到使用奥林巴斯FV500激光扫描共焦显微镜或蔡司Axioplan荧光显微镜。共焦数码图像裁剪和调整使用Adobe Photoshop色彩平衡和强度。所有免疫荧光实验包括幻灯片(WT和+ /信用证),没有1抗体作为控制非特异性immunolabeling孵化。两个鼠标的特异性单克隆(ABR亲和力BioReagents)和兔多克隆(北部/微孔)反α3抗体还测试了与西方能够从WT和使用均质小脑组织+ /信用证突变小鼠(数据没有显示)。ABR鼠单克隆抗体标记一个110 kD乐队代表了释放,本地人α3同种型,而北部的兔多克隆抗体标记两个乐队,110 kDα3同种型和一个40 kD的乐队,已被证明是一个副产品α3同种型卵裂calpain活动(31日]。

钠/钾atp酶的半定量的比较immunolabeling WT + /信用证小脑,数字图像的α3同种型和calbindin immunolabeling浦肯野细胞被40 x与一个奥林巴斯蔡司Axioplan DP70 CCD相机在染色后的头两天的所有部分(避免不均匀的衰落工件)。原始的,未经加工的图片使用Metamorph r1 7.0版本进行分析。阈值和colocalization函数被用来选择性测量的强度α3同种型immunolabeling地区与calbindin-stained与浦肯野细胞在相同的部分。至少3分子层区域/小脑被选在每个WT或+ / vermal部分信用证小脑和每个小脑的平均值计算。WT的数量和+ /信用证在每个时间点P10,小脑分析WT、4 + /信用证;P15,WT, 5 + /信用证;P25、WT, 5 + /信用证。的强度α3同种型荧光信号P10, P15 P25表示为百分之一改变标签强度控制在P10浦肯野细胞。

2.2.1。免疫印迹分析

WT和+ /信用证从新鲜解剖大脑小脑收集,快速冻结在干冰和储存在−70°C到处理。每个小脑均质在缓冲区包含50毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0)液,150毫米氯化钠,5毫米EDTA, 1% sds, 10μL /毫升蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ),1毫米PMSF和1毫米衣饰归宿₄。匀浆离心机在15000 rpm 15分钟。上层清液中蛋白质浓度测定用BioRad蛋白质化验设备。蛋白质提取物在Laemmli稀释样品缓冲β巯基乙醇和变性37°C 5分钟和10μ每口井的g蛋白质是解决Tris-glycine凝胶。蛋白质被一夜之间在4°C到PVDF膜。膜清洗与5%脱脂奶粉溶解在1×TBS。然后在反孵化α三钠/钾atp酶(ABR 1/1000或北部的1/5000),稀释在TBS / 0.1%渐变(TBS-T)与1%牛奶一夜之间在4°C,然后冲洗3×10分钟PBS-T。样品膜在碱性孵化phosphatase-conjugated二级抗体(1/1000)稀释和蛋白质检测使用Bio-Rad immun-Star化学发光设备。电影暴露在化学发光信号数字化使用灯箱和Pixera Pro150ES数码相机连接到一个权力Macintosh。图像的光学密度校准使用摄影校准步骤平板电脑收集数据(柯达),这样介绍过o。d。邓肯的线性范围标记蛋白带的相对密度是决定使用与ImageJ光密度测量。在所有的研究中,一旦数据感兴趣的抗原被收集,膜被剥夺和总蛋白与印度墨水标记作为加载控制。的密度α3同种型蛋白质总量的乐队是修正计算的密度的比值α3同种型带和总蛋白。纠正的密度的变化α3同种型乐队表达的平均密度的百分之一α3同种型乐队P25控制在同一凝胶。

2.3。原位钠/钾atp酶活性测定

组织化学。活跃的钠-钾泵的密度测量在冰冻组织部分使用一个程序修改从以前公布的协议32,33]。WT和+ /信用证大脑被平分,迅速在干冰冷冻2分钟。大脑被削减同一天在旁矢状面的部分20μm。肾脏的野生型动物也冻和20μm的肾脏被放在每个幻灯片是一个积极的控制。两张幻灯片,每张幻灯片2部分从每个大脑用于试验。10分钟的部分被固定在2%多聚甲醛,在PBS冲洗3次,冲洗两次50毫米三羟甲基氨基甲烷/ 100毫米蔗糖液pH值(7.4),然后冲洗3次,持续15分钟每次三羟甲基氨基甲烷/蔗糖缓冲液。他们培养20分钟37°C的柠檬酸铅混合pH值8.8柠檬酸钾约4毫米,4毫米硝酸铅、250毫米甘氨酸,25毫米的氢氧化钾,20% DMSO, 10毫米para-Nitrophenylphosphate (p-NPP)、左旋咪唑和2.5毫米。部分然后在蒸馏水冲洗,冲洗10分钟三羟甲基氨基甲烷/蔗糖的缓冲液中,并在蒸馏水冲洗2次。部分是在1%的硫化铵2分钟,在蒸馏水冲洗2次,冲洗10分钟在PBS摇臂,蒸馏水冲洗,覆盖着水晶山,并允许在房间临时干。作为乌本苷的测定不敏感活动,每个幻灯片的大脑处理10毫米乌本苷在最后三羟甲基氨基甲烷/蔗糖液孵化和柠檬酸铅孵化。

量化的酶活性。彩色幻灯片拍摄在5 x的徕卡显微镜DMR 24-megapixel电源相位扫描相机(阶段1,Inc .)。减少变化背景照明,部分和相邻的图像幻灯片拍摄的空白区域。背景图像减去的部分使用MatLab图像。因为大量的部分在每个组织化学分析实验,数字图像采集连续超过三天。拍摄的图像校准对任何潜在的差异在不同会话(例如,光水平变化),所选部分的平均密度的变化,成像都三天减去从各自的一天。使用ImageJ,系统随机点集来测量光密度。分子层的密度和颗粒细胞层是平均为每个测量大脑的两个部分每大脑实验。ouabain-specific活动被减去的密度计算乌本苷治疗组织密度的未经处理的组织。

3所示。统计分析

统计进行了对比实验和对照组使用双向或单向方差分析(方差分析)和事后比较了使用Bonferroni /邓恩(Statview 5.01)。

4所示。结果

4.1。细胞的分布α钠-钾离子泵带3亚型在WT和+ /信用证浦肯野细胞

先前的研究表明,在成年小鼠小脑α钠-钾离子泵带1亚基表达在颗粒细胞和肾小球,α在星形胶质细胞2亚基表达,α3亚单位表达的浦肯野细胞、篮状细胞过程,和苔藓纤维肾小球(7]。因为在+ /浦肯野和颗粒细胞退化信用证突变体,α1,α3单元最初选择的研究,最可能的亚型表达模式改变。一个初步的免疫组织化学变化的调查没有显示任何证据或immunolabeling强度分布α1亚基(结果未显示),但有证据显示不同的immunolabeling的模式的变化α3 + /亚基信用证小脑P10 P25。Vermal小脑部分至少4 WT + /信用证小脑在P10, P15, P25 calbindin immunolabeled和的两倍α3单元使用北部兔多克隆抗体能识别110 kD全长α3同种型和40 kD的副产品α3在西方墨迹同种型乳沟。WT和+ /信用证小脑的P10 P25,α3单元似乎表达的浦肯野细胞,分子层、颗粒细胞层肾小球的模式被彭et al。7在成年大鼠的小脑。α3表达WT浦肯野细胞广泛分布于整个树突和胞体如图所示P15 WT浦肯野细胞数据1 (b)和1 (c)(绿色标记)。相比之下,immunolabelingα3是在所有三个年龄+ /定性不同信用证浦肯野细胞。从P10,α3同种型标签变得更强烈和更少的+ /内扩散信用证浦肯野细胞。如图所示为P15 + /信用证浦肯野细胞数据1 (e)和1 (f),immunolabelingα3亚基(绿色)更有小点的,集中在主树突和细胞体标签似乎更强烈,尽管不同的浦肯野细胞之间有一些差异。例如,α3标签是最+ /左两个特别强烈信用证浦肯野细胞数据1 (d)- - - - - -1 (f)(白色箭头),α3同种型似乎围绕着阻碍主要浦肯野细胞树突特别是低分子层的三分之二。α3 immunolabeling也见过在细胞内的浦肯野细胞的身体但身体与WT浦肯野细胞相比。α在颗粒细胞层3 immunolabeling肾小球白色星号表示的数据1 (e)和1 (f)。虽然我们不能排除一些增加的可能性α3 immunolabeling浦肯野细胞和分子层+ /信用证小脑皮质纤维可能在攀爬,很明显,强度和分布α3 immunolabeling + /改变信用证小脑皮质。

+ /信用证浦肯野细胞似乎退化的最后阶段表达激活caspase-3 [34,35]。来确定α3亚基表达坚持垂死的浦肯野细胞,从P15 P25 + /小脑部分信用证小脑是双标记抗体caspase-3和激活α用DAPI 3同种型和复染色。的分布α3激活caspase-3积极+ /同种型标签信用证浦肯野细胞是小脑部分从三个+ /检查信用证在P15突变体。两个这样的退化+ /共焦图像信用证浦肯野细胞数据所示2(一个)和2 (b),说明+ /信用证浦肯野细胞继续表达α3同种型甚至退化。发育不良的树突和胞体激活caspase-3积极(红色)+ /信用证浦肯野细胞图所示2(一个)显示点状的标签α3(绿色和黄色)在剩余的树树突和胞体。+ /信用证浦肯野细胞图所示2 (b)似乎是在退化的一个先进的阶段,只有少数收回剩余树突分离球形气泡或管(红色箭头)。然而其余的部分退化浦肯野细胞树突包围α3 immunolabeling。DAPI标记(紫色)的核激活caspase-3正显示了凝结核的神经元退化+ /信用证浦肯野细胞(白色箭头)。核邻国+ /找到DAPI标记信用证浦肯野细胞尚未开始表达激活caspase-3(白色箭头)。

定性描述immunolabeling发展变化的α3同种型表明,它是广泛地分布在整个浦肯野细胞树突树从P10 P25 WT小脑。相比之下,在+ /信用证浦肯野细胞,α3 immunolabeling变得更加激烈和点状的标签从P10 P25集中主要沿浦肯野细胞树突和细胞的身体。作为发展变化的分析α3 immunolabeling的强度α3(绿色)荧光信号重合在WT calbindin标签和+ /信用证浦肯野细胞用MetaMorph测量(图3)。双向方差分析荧光强度测量结果的分析表明,有明显的年龄和genotype-dependant效应α3亚基之间的免疫荧光WT + /信用证浦肯野细胞(图3:年龄:方差分析,;基因型:方差分析,),但是年龄基因型交互不达到意义(方差分析,)。事后完整数据集的分析表明,有显著的增加α3荧光强度之间的P10 P15和P10 - P25整体在+ /荧光强度之间的显著差异信用证邓恩和WT浦肯野细胞(Bonferroni /;)。进一步探索事后单向方差分析分析分离数据集按年龄表明之间的差异α在+ / 3同种型免疫荧光信用证和WT浦肯野细胞P10 P15可能导致主效应,他们不是单独分析时明显不同(P10单向方差分析,;P15单向方差分析,)。然而,有一个强度之间的显著差异α3同种型immunolabeling + /和WT浦肯野细胞在P25 + /水平较高信用证浦肯野细胞(方差分析,)。

4.2。分析α3同种型蛋白表达水平

的增加α3 + /免疫荧光信用证浦肯野细胞P10-P25可能是由于各种原因,包括重新分配现有的α3亚型的表达水平增加α3同种型。区分这些可能性,蛋白质提取的小脑组织准备从WT和+ /信用证小脑在P10, P15、P25的相对水平α3同种型表达式被免疫印迹(图量化4)。西方的屁股与鼠标进行单克隆(ABR亲和力BioReagents)和兔多克隆(北部/微孔)反α3抗体。ABR鼠单克隆抗体标记一个110 kD乐队代表了释放,本地人α3同种型,而北部的兔多克隆抗体标记两个乐队,110 kDα3同种型和一个40 kD的乐队,已被证明是一个副产品α3同种型卵裂calpain活动(31日]。北部的兔多克隆110 kD带显示背景比ABR鼠标单克隆,所以鼠标单克隆抗体是用来测量α3同种型水平和兔多克隆抗体被用来测量水平的40 kDα3同种型calpain降解产物。代表西方墨迹110 kD的图像α3同种型+ /所示信用证和WT小脑P10, P15 P25图4(一)。图4 (b)显示代表α3 40 kD降解产物为WT和+ /乐队信用证小脑在P10, P15、P25。

定量变化的相对光密度110 kDα3同种型蛋白质和40 kD降解产物曲线图在图所示4(一)和4 (b),分别。110 kD蛋白密度数据的双向方差分析表明,年龄(方差分析有显著的影响,),但没有显著的基因型(方差分析的影响,)或年龄基因型交互(方差分析,)。事后探索性的分析表明,在+ /信用证和WT小脑,α3同种型蛋白质含量在P25明显高于P10及P15 (Bonferroni /邓恩,)。一个单独的单向方差分析分析表明数据分离的时代α3同种型蛋白质含量只有WT与+ /之间明显不同信用证小脑在P25(方差分析,)。结果表明,α3 WT同种型水平和+ /信用证小脑P15后随年龄的增加而增加,但在P25的增加α3 + /水平信用证小脑在WT小脑不一样大。

40 kD的双向方差分析α蛋白质水平(图。3对碘氧基苯甲醚4 (b))表明,年龄(方差分析有重要的影响,),基因型(方差分析,),和年龄基因型交互(方差分析,)。事后分析表明,组织的水平α3 40 kD片段在P25相比之下,P10水平明显高于(Bonferroni /邓恩,),但不是P25和P15之间或P15和P10 (Bonferroni /邓恩,)。单向方差分析由年龄表明基因型效应主要是由于量之间的显著差异α3 40 kD片段P25(方差分析,),在+ /水平显著降低信用证小脑。之间没有显著差异水平的40 kD P10或P15片段。P25的结果表明,有一个戏剧性的增加40 kDα在WT小脑3片段,但这与年龄相关的增加在+ /不匹配信用证小脑。

4.3。积极的组织化学测量钠/钾泵密度

自从GluRδ2^信用证通道介导的Na⁺泄漏电流的密度我们假设活跃Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶泵将增加在+ / P10通过P25信用证浦肯野细胞增加了细胞内钠的反应⁺的水平。此外,催化的分布的变化α钠-钾离子泵带3亚基还表明,泵的分布和密度活动将在+ /改变信用证浦肯野细胞。分析分布的变化活跃在+ /钠/钾泵信用证小脑,p-NPP作为衬底原位组织化学分析检测ouabain-sensitive potassium-dependent钠-钾离子泵带活动的复杂。代表图像的组织化学标签WT和+ /钠/钾泵活动信用证小脑皮质P15 P25如图5。图像的野生型和+ /信用证小脑在同一放大,但+ /信用证小脑P15较小,相比大大缩小P25 WT因为正在进行的(P25,广泛)+ /信用证浦肯野和颗粒细胞死亡。定量分析的原位ouabain-sensitive钠-钾泵的活动组织部分野生型和+ /信用证小脑部分在P15 P25显示活跃的钠-钾泵的整体密度的分子和颗粒细胞层内WT水平P15 (ML;方差分析,;GCL;方差分析,),但减少P25在+ /信用证分子层(ML:方差分析,)和颗粒细胞层(GCL:方差分析,;数据5 (e)和5 (f))。原位钠-钾离子泵带活动密度表示为在P15或P25 WT值的百分之一。小脑WT和+ /片老鼠在P15 P25处理在分开的日子里这是不可能的光密度密度P15和P25之间进行比较。

在P15,相当数量的+ /信用证浦肯野细胞仍然存在,所以我们假设钠/钾泵活动测量分子层反映了泵浦肯野细胞树突除了其他活动细胞中的元素分子层。因此,在P15所有的测量是在叶的分子和颗粒细胞层III和IV代表地区。然而,大多数+ / P25信用证浦肯野细胞退化小叶前部和中部,但大约40 - 50%的+ /信用证浦肯野细胞坚持小节(36]。来确定是否有不同钠/钾泵小脑地区很少有浦肯野细胞之间的活动和地区幸存的浦肯野细胞,钠/钾泵活动测量在P25在小叶的分子和颗粒细胞层III和IV与X(小节)控制和+ /信用证突变的小脑(图5 (f))。后活动的测量,相同的部分是沾甲酚紫来验证+ /的存在信用证浦肯野细胞。虽然只有少数浦肯野细胞被发现在第三和第四小叶,幸存的浦肯野细胞的密度区域的小节分析了钠-钾泵活动明显更高的(数据未显示)。然而,优惠+ /的生存信用证浦肯野细胞小节似乎没有影响到总体钠-钾离子泵带下降活动观察在P25 + /信用证小脑分子和颗粒细胞层。

5。讨论

GluR骗子突变δ2将这个神秘的谷氨酸受体转化为一个既定的开放长期去偏光+ /阳离子通道信用证浦肯野细胞,成熟后的第一个星期产后发展(20.,22]。在+ /阳离子泄漏信用证浦肯野细胞被认为是启动excitotoxic细胞死亡通路(19]。假设excitotoxic机制之一是离子失衡造成过度刺激的谷氨酸受体和大量涌入的Na⁺和Ca^{+ +}离子的地方压倒性强调细胞能量代谢系统(17,18]。在+ /信用证浦肯野细胞,特别是线粒体细胞色素氧化酶活性明显增加,可能增加细胞能量的需求的响应(26]。本研究的目的是测试假设Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶α3同种型表达和活性的密度在+ /钠/钾泵增加信用证浦肯野细胞。增加将符合ATP生产需求增加和细胞色素氧化酶活动增加GluR抗衡δ2^信用证Na⁺和Ca^{+ +}泄漏电流。然而,结果表明,尽管催化的表达α3同种型可能是增加个人+ /信用证浦肯野细胞,活跃的钠-钾泵的密度没有显著增加高于野生型水平+ /年轻的小脑信用证突变体(P15 P10)。此外,25个,整体的表达水平α3 40 kD同种型及其分解产物减少+ /信用证小脑WT相比,以及活跃的密度减少钠/钾泵。小脑的表达水平越低α3同种型和降低密度的活跃钠/钾泵+ / P25的信用证小脑可能仅仅反映了重大损失+ /信用证浦肯野和颗粒细胞的年龄。而积极的结果表明,密度钠/钾泵单位+ /不显著增加信用证浦肯野细胞的泄漏电流,重要的是要注意,在这项研究中我们没有分析在活的有机体内单位活动的钠-钾泵+ /生活信用证浦肯野细胞。

5.1。钠-钾泵的表情α3在去极化的+ /亚基信用证浦肯野细胞

在这项研究中,最初的免疫组织化学表达模式的研究的主要单元钠/钾泵用小脑浦肯野细胞,表达α3,β1亚型建议只催化的表达α3亚基是在+ /改变信用证小脑皮质。表达的变化α3 + /同种型信用证浦肯野细胞随后分析了荧光immunolabeling提供本地化信息单元。的免疫荧光强度显著增加α3亚基通过P25 P10(图3)+ /信用证浦肯野细胞表明要么有增加密度的蛋白质或子单元的定位是在每个+ /改变信用证浦肯野细胞树突细胞的身体退化。免疫印迹数据显示,总小脑本机的水平α3亚基及其40 kD乳沟产品不显著改变P10 P15在+ /信用证随后小脑相比WT和水平不提高通过P25 WT小脑。虽然免疫荧光和免疫印迹技术提供重要的互补的定性和定量的蛋白表达模式的信息,结果进行解释时需要特别谨慎,这是由于其固有的局限性。的免疫荧光强度显著增加α3 + /亚基信用证浦肯野细胞表明,增加个体的浦肯野细胞内蛋白质的密度。然而,它是不可能区分的可能性的表达增加α3亚基或亚基的定位和+ /改变信用证浦肯野细胞不能分化(尤其是树突),最终退化。免疫印迹数据似乎支持后者假说以来唯一的显著差异α3表达是一个相对的减少在P25 + /信用证小脑70 + / - 90%信用证浦肯野细胞和颗粒细胞退化的60% (24,36]。同样重要的是要考虑+ /信用证浦肯野细胞退化从至少与大约50%的+ / P10开始信用证浦肯野细胞缺失,P13 P15 [24]。鉴于immunolabeling强度在每个子单元+ /信用证浦肯野细胞从P10 P25(图稳步增长3),它是可能的α3蛋白质含量在个人+ /会稳步增长信用证浦肯野细胞,但整体表达水平的小脑可能没有显著改变,因为持续的损失+ /浦肯野细胞。因此,即使在P25,α3亚基表达水平可能会显著增加在阻碍树突树+ /的特征信用证整体小脑浦肯野细胞,但是α3水平总体上有所下降,因为大多数浦肯野细胞死亡的时间。

而免疫组织化学和免疫印迹数据符合钠-钾泵的密度的变化在单独的浦肯野细胞,这些结果并不意味着这些变化如何转化为改变泵的活动。一项研究成人严重分离大鼠丘脑神经元去极化的接触藜芦定或莫能菌素发现,结果Na⁺涌入导致钠/钾泵增加密度和磷酸化水平的分子泵(暗示泵活动增加;(37])。在慢性Na⁺在发展中+ /泄漏信用证浦肯野细胞在这项研究中,有证据表明,积极的密度Na / K + /泵不改变信用证小脑皮质P15之前。P15,没有显著差异的密度测量结果,ouabain-sensitive活跃分子层之间的钠-钾泵的野生型和+ /信用证小脑。P25、分子的密度有明显降低层积极钠/钾泵,在前小叶几乎没有浦肯野细胞或小节与相对较高的存活数量+ /信用证浦肯野细胞。

钠-钾泵的扩散模式+ /活动信用证小脑皮层形成鲜明对比的分布细胞色素氧化酶(COX)组织化学染色在同一年龄(26]。个人+ /浦肯野细胞P15和考克斯P25污渍的口吻,填充整个浦肯野细胞和树突树。考克斯活动大幅增加表明,线粒体呼吸途径是调节生产更多ATP。如果活动钠-钾泵的密度增加的慢性Na⁺涌入+ /信用证浦肯野细胞似乎合理的期望,组织化学标签的强度会增加沿浦肯野细胞树突膜。然而,钠-钾泵的染色模式活动保持在+ /扩散信用证小脑皮质,没有证据表明离散补丁标签对应的标签α3单元中观察到荧光标记部分。的分布之间的差异α3单元检测到免疫荧光和钠-钾泵的模式组织化学活动可能是由于空间分辨率的局限性组织化学染色或一些α3 immunolabeling标签可以代表停用钠/钾泵,包括40 kDα3裂解同种型。在小鼠局灶性脑缺血模型,没有变化被发现在蛋白质或mRNA水平钠/钾泵亚型(12),但钠/钾泵活动水平降低与乌本苷敏感性的变化,表明活动的减少是由于内在的腺苷三磷酸酶泵的修改。

有许多机制,可以减少或不可逆块钠-钾泵的活动。钠-钾泵亚型通常回收和内化在溶酶体的降解溶酶体组织蛋白酶D [31日,38]。然而,膜结合钠/钾泵复杂也可以灭活calpain-mediated乳沟的支架蛋白,锚蛋白,结合钠/钾泵膜骨架(39钠-钾离子泵带]或退化的亚型自己(31日]。钠-钾离子泵带氧化时,胞内蛋白酶亚型变得更加敏感和激活calpain会裂开α3同种型成一个40 kD降解产物(31日]。在这项研究中,110 kD的本地α3单元和40 kD降解产物增加WT小脑通过P25表明本机的一个重要部分α3亚基的氧化和降解calpain在正常小脑组织。Calpain最近被证明是活跃在个体,孤立的+ /信用证浦肯野细胞好基于immunolabeling 136 kD的片段α血影蛋白裂解calpain [19]。在这项研究中,尽管失去了相当数量的+ /信用证浦肯野细胞P15,没有显著减少的水平在+ / 40 kD乐队信用证小脑在P25之前,当大多数浦肯野和颗粒细胞退化。如110 kD本地的情况下α3亚单位,有可能是40 kD退化的数量增加个人+ /信用证浦肯野细胞P15 P25,但总金额内控制水平在P25 P15并显著降低,因为持续的+ /信用证浦肯野细胞损失。+ /信用证浦肯野细胞变性与氧化应激增加有关,包括线粒体细胞色素氧化酶活性的增加,它可能会产生更多的活性氧增加呼吸活动的副产品。结果并不表明有显著增加的氧化形式α3单元P15在+ /信用证小脑以来没有显著增加水平的40 kD的副产品,但持续的蛋白水解作用的结果是一致的α3单元calpain + /信用证浦肯野细胞,直到大部分已经退化。

钠-钾泵的活动也是由一氧化氮(NO) cgmp [10)或NO-PKG通路(40)和抑制通过过氧硝酸盐的形成硝基酪氨酸或半胱氨酸残基的修改15,16]。+ /的先前的研究信用证浦肯野细胞表明其变性与增加神经元一氧化氮合酶的表达和硝基酪氨酸(25]。由于钠/钾泵过氧硝酸盐敏感不,我们假设而阳离子泄漏增加催化的表达α3同种型,与过氧亚硝基的互动,没有/包裹,和/或没有/ cGMP减少活动钠-钾泵的密度。减少活动的密度在+ /钠/钾泵信用证浦肯野细胞可能导致Na⁺超载在这些神经元和加剧细胞死亡过程,因为细胞内钠的增加⁺与诱导细胞凋亡相关(5,41]。

6。结论

分析钠-钾离子泵带的分布和活动在这个研究退化+ /信用证浦肯野细胞表明的表达和/或分布α3单元+ /小脑皮层的中断信用证突变,没有证据表明积极的泵的密度增加,以应对本构的涌入Na⁺通过突变GluR离子δ2^信用证频道。我们假设钠/钾泵活动会刺激作为一个稳态响应Na⁺离子流入。缺乏证据的功能密度增加钠/钾泵不排除个别泵的活动增加的可能性在每个+ /信用证浦肯野细胞,从而刺激需求增加ATP最终会导致细胞能量资源的枯竭。钠-钾泵估计使用多达50%的神经元产生的ATP (42]。Na⁺钠-钾泵通常是病原因素活动(43- - - - - -45),海拔在钠的浓度⁺在+ /信用证浦肯野细胞可能会增加个体泵由于更多的活动完全饱和的Na⁺结合位点。因此,虽然可能会有增加ATP在+ /消费信用证浦肯野细胞因为个别泵的活动增加,这项研究表明,增加钠/钾泵活动和ATP消费并不是因为一个总体密度的增加活跃的腺苷三磷酸酶泵长期去极化的浦肯野细胞。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突与本文有关。

确认

这项工作是由国家卫生研究院授予NS 34309 -迈克尔·w·沃格尔。作者要感谢亚当Puche博士为他的援助与显微镜的采集和分析数据。作者还要感谢卡罗尔·阿姆斯特朗Michisuke Yuzaki,和小君他有用的评论论文的准备。本文准备在大型的马里兰大学医学院。本文的观点是作者自己的,并不能反映美国国立卫生研究院的观点,美国卫生与公众服务部,或美国政府。

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