Cysteine-10 17日β-Hydroxysteroid脱氢酶1在代数余子式绑定地区稳定的相互作用,使灵敏度巯基修饰的化学物质

文摘

17β-Hydroxysteroid脱氢酶1型(17β-HSD1)雌激素酮的催化转化的雌性激素雌二醇。17β-HSD1乳房和卵巢组织中高度表达,代表一个预后标记肿瘤恶化和生存的乳腺癌患者和其他estrogen-dependent肿瘤。因此,酶对estrogen-dependent癌症被认为是一种很有前途的药物目标。小说发展的抑制剂,结构关系的一种改进的理解是至关重要的。在目前的研究中,我们审查的角色半胱氨酸残基,半胱氨酸¹⁰Rossmann-fold NADPH绑定地区,17岁β-HSD1函数和测试灵敏度对巯基修饰的化学物质。三维结构建模显示半胱氨酸的重要作用¹⁰参与氨基酸的稳定与残留NADPH绑定的口袋里。酶活性分析显示,17β-HSD1不可逆地抑制了巯基改性剂N-ethylmaleimide (NEM)和硫代氨基甲酸。预培养和增加浓度的NADPH保护17β从抑制-HSD1这些化学物质。半胱氨酸¹⁰Ser突变17β-HSD1被NEM部分受抑制,硫代氨基甲酸,强调半胱氨酸的重要性¹⁰在代数余子式绑定。替换的半胱氨酸¹⁰有丝氨酸导致减少蛋白半衰期,没有显著改变动力学属性。尽管半胱氨酸¹⁰17日β-HSD1似乎已经有限的潜在的新酶抑制剂作为目标,目前的研究提供了新的见解这种酶的结构关系。

1。介绍

17β-Hydroxysteroid脱氢酶(17βhsd)酶是参与互变现象的动态和静态性类固醇激素,从而发挥重要作用在intracrine调节雌激素、雄激素和progesterone-dependent生理功能(1]。17β-HSD1负责转换雌激素酮雌二醇,最有效的天然雌激素。的最高表达这种酶在乳腺癌和卵巢组织。重要的是,17β-HSD1表达呈负相关与乳腺癌进展和被确认为一个独立的预后标记为乳腺癌患者的无病和总生存期(2,3]。的表达升高17β-HSD1观察子宫内膜癌(4和nonsmall细胞肺癌5]。此外,表情比17岁β-HSD1和17β-HSD2被发现能够预测的响应他莫昔芬在绝经后的乳腺癌患者6]。

具体管理的17岁β-HSD1抑制剂导致显著降低肿瘤生长在乳腺癌细胞异种移植肿瘤小鼠模型(7,8)和逆转estrogen-dependent在转基因小鼠子宫内膜增生9),这表明这种酶是一种很有前途的药物目标对estrogen-dependent疾病,如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和乳腺癌和卵巢癌肿瘤。几类化学物质抑制17β-HSD1测试在体外,包括人工催分子、非甾体类化合物和嵌合分子,作用于活性中心和酶的辅助因子结合位点(8,10- - - - - -16]。然而,只有有限数量的抑制剂已经被测试在活的有机体内到目前为止,这还需要进一步的研究。为了开发有效和选择性17β-HSD1抑制剂、酶的结构关系的深刻理解是至关重要的。

17β-HSD1属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)家庭和包含核苷酸的守恒Rossmann-fold绑定,催化与残留Ser三和弦^142年,酪氨酸^155年和赖氨酸^159年(17)和一个二聚作用区域。利斯河^149年是一个关键的残渣C-18之间的歧视和C-19类固醇基质(18]。

针对功能必不可少的半胱氨酸残基的蛋白质建议是一种很有前途的新型药物制剂的设计方法(19]。17β-HSD1包含六个半胱氨酸。在先前的研究中,我们证明了在结构上相关的酶11β-hydroxysteroid脱氢酶2型(11β-HSD2)包含一个半胱氨酸残基在90位置,类似于半胱氨酸¹⁰17日β-HSD1 [20.]。突变的半胱氨酸^90年11日β-HSD2导致几乎完全失活的酶。因此,我们推测,半胱氨酸¹⁰17日β-HSD1可能代表新型抑制剂的目标站点。在目前的研究中,我们应用三维结构建模和酶活性测量半胱氨酸的生化性质进行调查¹⁰Ser突变17β-HSD1并比较其灵敏度对巯基改性剂与野生型17β-HSD1。

2。材料和方法

细胞培养基从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德和(2、4、6、7³从Amersham H]雌激素酮法玛西亚(美国新泽西州皮斯卡塔韦)。所有其他化学物质来自丙烯酰胺AG(书、瑞士)和可用的最高等级。

2.1。建筑的表达质粒和定点诱变

为了便于检测,一个octahistidine标记添加到人类17的糖β-HSD1通过使用包含tag-coding寡核苷酸引物PCR扩增序列(正向引物5′-TAAACCCTGAGGAGGTGGCGGAGGTCTTC-3′,反向引物5′-TGCTCTAGAAGCTTAATGATGATGATGATGATGATGATGCTGCGGGGCGGCCGGAGGATCG-3′)。的活动标记17β-HSD1的区别,未加标签的酶。半胱氨酸的替换¹⁰丝氨酸是引入c端histidine-tagged 17β-HSD1 cDNA Bluescript向量的定点诱变使用正向引物5′-TCATCACCGGCTCTTCCTCG-3′和反向引物5′-GAGGAAGAGCCGGTGATGAG-3′根据快速变化诱变工具包(Stratagene,阿姆斯特丹,荷兰),其次是后续recloning到质粒pcDNA3.1表达式。

2.2。细胞培养、转染和免疫印迹

hek - 293细胞增长到60 - 70%融合在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清,4.5 g / L葡萄糖,青霉素和链霉素50单位/毫升、谷氨酰胺和2毫米,使用磷酸钙沉淀方法转染紧随其后。转染效率是%。检查过表达蛋白质的表达水平,我们进行了sds - page (30μg细胞总蛋白质的加载/ lane)其次是免疫印迹和检测使用tetra-His histidine-tagged蛋白抗体(试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国;猫。不,11561526)。加载控制β使用一个反的肌动蛋白微丝β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA;猫。不。B1204)。

2.3。17β-HSD1活动测量

确定17β-HSD1活动,hek - 293细胞转染的磷酸钙沉淀的方法。收获细胞转染后48小时,洗两次磷酸盐(PBS)和离心机在150×g 4分钟。上层清液被移除和细胞颗粒被速冻干燥ice-ethanol浴和存储在−80°C。17的还原酶活性β-HSD1被孵化的细胞溶解产物测定10分钟37°C的200 nM放射性标记的雌激素酮和400年μM NADPH在反应缓冲区包含20%的甘油,EDTA 1毫米,和50毫米磷酸钾,pH值7.4。抑制剂被稀释股票的解决方案在二甲亚砜(DMSO)并立即用于化验。DMSO浓度不超过0.1%,没有对酶活性的影响。

在完整细胞,酶活性测定hek - 293细胞生长在10厘米文化菜肴,与质粒转染histidine-tagged野生型17β-HSD1或半胱氨酸¹⁰Ser突变体,分离后24 h转染和分布在96孔板的密度10000细胞。16 h后,细胞培养,前者血清培养基中,和转换的放射性标记的雌激素酮与雌二醇决心在孵化为30分钟37°C总量的50μ包含200海里雌激素酮L。通过添加甲醇反应是停止包含2毫米无标号雌激素酮和雌二醇,其次是类固醇的薄层色谱分离和闪烁计数。

测定酶动力学,雌激素酮浓度从10到800海里。数据(均值±SD)从三个独立的实验和计算获得使用数据分析工具箱(爱思唯尔MDL、Allschwil、瑞士)。

2.4。蛋白质稳定性的分析野生型17β-HSD1和突变体半胱氨酸¹⁰爵士

野生型和突变体17的稳定性β-HSD1蛋白质分析基本上如前所述[21]。简单地说,调查野生型蛋白半衰期的17β-HSD1和突变体半胱氨酸¹⁰Ser hek - 293细胞生长在six-well板块与质粒转染对突变体和野生型酶,与PBS转染后24小时清洗一次,孵化用新鲜培养基含有50μ克/毫升环己酰亚胺。在0、12、24、48 h,整除的细胞被收获,其次是immunodetection使用tetra-His抗体。长孵化项目与环己酰亚胺不合适由于hek - 293细胞的毒性作用。

另外,细胞转染质粒突变体和野生型酶洗一次16 h转染后,紧随其后的是孵化在leucine-free DMEM (MP生物医学,Illkirch、法国)45分钟内生亮氨酸耗尽。中,取代它的是1毫升leucine-free DMEM补充20μCi /毫升L-leucine - [3、4、5³H (N)),其次是孵化3 H。标记被添加5毫米无标号亮氨酸终止,与DMEM洗涤两次,在DMEM孵化。在0、12、24、48 h,整除的细胞snap-frozen histidine-tagged蛋白质纯化之前通过使用Ni-NTA琼脂糖装备根据制造商(试剂盒AG)、Hombrechtikon、瑞士)。洗脱后,蛋白质受到sds - page凝胶干燥和暴露于tritium-sensitive屏幕(TR裸BaFBr:欧盟^{2 +}屏幕)16 h,其次是分析使用一个气旋Phosphor-Imager (PerkinElmer生活和分析科学,谢尔顿,CT,美国)。

2.5。多序列比对

17的蛋白质序列β从不同的物种和不同人的特别提款权-HSD1使用ClustalW算法相比,运行http://www.ebi.ac.uk/,使用默认的程序参数。

2.6。结构建模

调查17对结构的影响β-HSD1变异的半胱氨酸¹⁰爵士,我们提取1 fdt的蛋白质数据库(PDB)。1 fdt包含人类17β-HSD1 cocrystalized雌二醇和辅酶ii⁺(22]。半胱氨酸¹⁰使用生物高聚物选项转换为丝氨酸的洞察力II软件包。Ser的结构¹⁰突变体17β-HSD1精制发现3 10000次迭代,使用一个遥远的依赖介电常数2。

3所示。结果

3.1。多重序列比对和三维结构建模

人类17肽序列的分析β-HSD1使用Clustal W算法(23半胱氨酸)透露,残渣¹⁰中是高度保守的物种,包括啮齿动物和斑马鱼(图1),暗示作用残留在稳定性和/或蛋白质的功能。半胱氨酸¹⁰位于前两个之间的三个高度保守的甘氨酸残基的Rossmann-fold核苷酸结合域。有趣的是,半胱氨酸和两个下游丝氨酸残基也出现在all-trans视黄醇脱氢酶RDH8,就像17岁β-HSD1属于SDR28C家族。此外,在这个位置是守恒的半胱氨酸残基的所有成员SDR9C家庭,除了17β-HSD2,下游由两个半胱氨酸残基的位置。

开始了解半胱氨酸的角色¹⁰17β-HSD1函数,我们分析了半胱氨酸的交互¹⁰与相邻的氨基酸17β-HSD1 cocrystalized雌二醇和辅酶ii⁺(22]。1的晶体结构fdt表明,半胱氨酸¹⁰范德瓦耳斯接触Ile吗⁷,通用电气⁹,通用电气¹⁵阿拉巴马州³⁴,用力推³⁵。通用电气⁹,通用电气¹⁵,用力推³⁵直接稳定代数余子式辅酶ii的绑定⁺(图2(一个))。半胱氨酸的无数的密切接触者¹⁰与氨基酸是nad (H)绑定网站显示,替换的巯基与一个更大的化学破坏这个网站,可能改变NADP (H)绑定和催化活性

开始研究这个半胱氨酸残基的函数,我们代替半胱氨酸¹⁰丝氨酸、生化反应最相似的氨基酸。显示的3 d模型(图2 (b)),半胱氨酸突变¹⁰丝氨酸不会导致重大变化Ser之间的联系¹⁰和Ile⁷,通用电气⁹和阿拉巴马州³⁴。然而,所有三个Ser之间的联系¹⁰和通用电气¹⁵比半胱氨酸之间的短吗¹⁰和通用电气¹⁵,通用电气¹⁵更远离磷酸氧辅酶ii⁺(图2 (b))。此外,爵士¹⁰更遥远的骨干氧气刺³⁵,用力推³⁵是磷酸腺苷的氧气。通用电气的骨干氮⁹是从同一磷酸氧辅酶ii⁺(图2 (b))。

3.2。抑制17β-HSD1巯基改性剂

在先前的研究中,巯基修饰的化学物质被发现11日起到有效的抑制作用β-HSD2和半胱氨酸的替代^90年由丝氨酸废除酶活性(20.]。测试半胱氨酸的假设¹⁰17日β-HSD1 NADPH绑定地区也有类似的基本稳定的相互作用,我们评估了抑制半胱氨酸改性剂的潜力N-ethylmaleimide (NEM)和硫代氨基甲酸的化学物质。NEM似乎弱抑制剂IC₅₀的μ米17同时孵化的溶解产物β-HSD1表达hek - 293细胞200海里雌激素酮和NEM浓度增加。与不可逆的抑制方式,预培养与NEM导致时间的方式抑制作用更明显。预培养的溶解产物20μM NEM 1 h添加雌激素酮完全废除前17β-HSD1活动(数据未显示)。

接下来,我们测试了二硫代氨基甲酸的化学物质抑制17β-HSD1。相比以前观察到的有力抑制11β-HSD2,硫代氨基甲酸17日,而适度的抑制效果β-HSD1。的集成电路₅₀福美双值(μ米),戒酒硫(μ米)、代森锰(μ米)、代森锌(μ17米)在同时孵化β-HSD1酶制剂与底物和抑制剂约两个数量级高于获得11β-HSD2,表明17所示β-HSD1更容易抑制巯基改性。

重要的是,如图3,预培养和NADPH 15分钟NEM受抑制,浓度依赖的产生影响。预培养和NADPH也受抑制硫代氨基甲酸(数据未显示),这表明绑定的NADPH防止半胱氨酸的共价修饰¹⁰在代数余子式绑定。

3.3。替换的半胱氨酸¹⁰与丝氨酸导致减少蛋白质的稳定性

研究半胱氨酸的角色¹⁰17β-HSD1函数,我们生成的半胱氨酸突变¹⁰爵士和比较histidine-tagged野生型和突变体酶的表达在瞬态表达式hek - 293细胞,而缺乏内生17β-HSD1表达式。尽管类似的转染效率,突变体半胱氨酸¹⁰Ser表达约两个水平低于野生型17β-HSD1(图4)。此外,一些低分了体重乐队被检测到,表明半胱氨酸的稳定性较低¹⁰Ser突变蛋白。

接下来,我们进行转染hek - 293细胞实验用环己酰亚胺以块新创蛋白质合成和评估蛋白半衰期。histidine-tagged 17的信号检测β-HSD1蛋白质没有明显减少阻塞翻译与环己酰亚胺(图48 h后5(一个)),表明蛋白半衰期大于48 h。长孵化项目并不适合由于环己酰亚胺的细胞毒性。相比之下,突变体半胱氨酸¹⁰Ser不稳定的蛋白质突变酶的半衰期估计h(平均数±标准差)。一个脉冲追踪实验使用³H-leucine标签确认了减少突变蛋白的稳定性(估计蛋白的半衰期h)与野生型相比17β-HSD1(估计蛋白的半衰期h)(图5 (b))。差异蛋白的半衰期估计脉冲追踪和环己酰亚胺方法可以解释为不完全抑制蛋白质合成后一种方法。

3.4。突变体半胱氨酸¹⁰Ser保留催化活性巯基改性剂和不受抑制

比较溶菌产物的酶活性表达野生型17β-HSD1或突变体半胱氨酸¹⁰Ser活动大约低50%的突变(数据没有显示)。然而,在修正使用anti-histidine-tag抗体蛋白表达野生型和突变体酶没有明显区别。酶动力学分析显示明显略高最大速度(但无显著变化为减少雌激素酮(表)1)。在完整细胞突变半胱氨酸的活动¹⁰Ser的区别,野生型酶(数据未显示)。

接下来,我们比较了不同的硫代氨基甲酸的化学物质对野生型的活动的影响17β-HSD1和突变体半胱氨酸¹⁰爵士。突变体半胱氨酸¹⁰爵士被所有的受抑制硫代氨基甲酸(图进行测试6)。同样,cysteine-modifying代理NEM抑制野生型酶的活动大约两倍的突变体半胱氨酸¹⁰爵士,确认这对17个半胱氨酸的角色β-HSD1功能(数据未显示)。

4所示。讨论

分析了17β-HSD1不同物种的蛋白质序列显示半胱氨酸在位置10在人类酶是高度保守的。蛋白质序列比对进一步透露,这个位置的半胱氨酸Rossmann-fold核苷酸结合区特别提款权亚科SDR28C和SDR9C是守恒的。17岁的三维结构β-HSD1预测几个半胱氨酸之间的范德华接触¹⁰直接在绑定的NADPH和残留物。Ser的3 d模型¹⁰突变体17β-HSD1发现,尽管大多数接触守恒有变化,可能是重要的。例如,爵士¹⁰更接近于通用电气¹⁵,通用电气¹⁵更远离磷酸氧辅酶ii⁺。同时,在爵士¹⁰突变体17β在用力推-HSD1,骨干氧气³⁵在通用电气和骨干氮⁹搬到4.7和4.5分别从氧磷酸腺苷。在野生型17β在用力推-HSD1,骨干氧气³⁵在通用电气和骨干氮⁹3.3和3.8分别从这氧气辅酶ii⁺。的损失这两个稳定的接触可以减少的亲和力NADP (H) Ser¹⁰突变体17β-HSD1。另一个可能的贡献降低NADP (H) Ser的稳定性¹⁰突变可能是不同的化学性质的硫醇基半胱氨酸¹⁰和酒精在Ser¹⁰。例如,只有部分的硫醇基预计deprotonated中性pH值,可以更好的稳定网站半胱氨酸¹⁰。值NADPH在后续的研究中确认的需要解决这个问题。

然而,我们的预测是由黄等人,他们的结果表明,插入带正电的赖氨酸残基的半胱氨酸的社区¹⁰和爵士¹²导致超过20倍的偏好增加17β-HSD1是NAD (H)对NAD (H) (24]。在先前的研究中,我们发现有关特别提款权酶11β-HSD2还包含一个半胱氨酸残基的位置对应于半胱氨酸¹⁰17日β代数余子式绑定地区-HSD1 [20.]。11β-HSD2半胱氨酸^90年Ser变异几乎完全失去了酶活性,由于受损的蛋白质折叠和突变蛋白的定位错觉。

有趣的是,半胱氨酸突变的类似的残渣^69年在人类(R) 3-hydroxybutyrate脱氢酶导致轻微的增加明显是NAD (H)和NAD (H) (25]。半胱氨酸的^69年Ser (R) 3-hydroxybutyrate脱氢酶的突变体,类似于17β-HSD1半胱氨酸¹⁰爵士,表现出双重的明显降低与野生型相比酶。轻微的增加明显17β-HSD1突变半胱氨酸¹⁰Ser雌激素酮,观察到在我们的测量细胞溶解产物,表明底物的亲和力降低由于干扰与代数余子式的交互NADPH。仔细结构对比残留代数余子式和底物的相互作用17β-HSD1 11β-HSD2和(R) 3-hydroxybutyrate脱氢酶应该提供一个解释的不同的效果修改类似的半胱氨酸残基的三个特别提款权。在人类视黄醇脱氢酶的功能类似的半胱氨酸³⁸不是详细研究;然而,Boerman和那不勒斯表明蛋白质含有半胱氨酸残基在附近,这是必不可少的催化活性(26]。

在我们的实验中,预培养和NADPH浓度的增加能够保护17β-HSD1从抑制巯基改性剂NEM和硫代氨基甲酸,表明半胱氨酸的间接作用¹⁰在稳定的代数余子式的绑定。

硫代氨基甲酸和NEM能够抑制17的活动β-HSD1,尽管在抑制所需浓度显著高于11β-HSD2。11的高灵敏度β-HSD2向含巯基的化学修改最近被证明是依赖于衬底绑定地区存在半胱氨酸残基(27]。一个类似的半胱氨酸残基底物结合地区的17个缺席β-HSD1。我们的免疫印迹实验检测到17个低分了乐队β-HSD1半胱氨酸¹⁰Ser变异,表明增加突变酶的降解。更快速退化可能是因为蛋白质构象的变化,从而暴露氨基酸残基通常埋在蛋白质内部,紧随其后的是蛋白酶体的激活。本研究的局限性包括野生型和突变体酶过表达和表达水平高于内生的水平。因此,估计半衰期的蛋白质可能是不同的在一个内生的情况。然而,结果显示与野生型相比,突变体酶的稳定性降低。

目前的工作提供了新颖的信息构效关系的17岁β-HSD1和表明,半胱氨酸¹⁰参与在代数余子式绑定地区基本稳定的相互作用。此外,我们表明,半胱氨酸¹⁰对巯基改性剂是目标。未来的研究使用蛋白酶消化纯化17β-HSD1野生型和半胱氨酸¹⁰Ser突变蛋白质应该提供进一步的机械的洞察这个残留的稳定的相互作用。

利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益冲突。

承认

这项工作是由瑞士国家科学基金会(31003 a_140961)亚历克斯Odermatt导演。亚历克斯Odermatt导演有一个椅子分子和诺华制药系统毒理学的研究基础。

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