基于基因抗体朊病毒疾病的策略

文摘

朊病毒疾病或传染性海绵状脑病(TSE)是一组神经退行性和传染性疾病的特点是一个正常的细胞蛋白质PrP的转换^C成一个病理异常折叠形式,称为PrP^Sc。有可用的治疗和诊断工具的早期识别个体受这些疾病影响。新的基于基因抗体策略成为有价值的治疗工具。其中,intrabodies嵌合分子由重组抗体片段融合细胞内贩卖序列,旨在抑制,在活的有机体内,具体的治疗目标的功能。intrabodies的优点是,他们可以选择一个精确的抗原决定基的目标蛋白质,包括网站和细胞毒性矫形器(例如蛋白质间交互作用寡聚和纤维组件)。在此,我们地址和讨论在体外和在活的有机体内应用程序的intrabodies朊病毒疾病,关注他们的治疗潜力。

1。介绍

朊病毒疾病或传染性海绵状脑病(TSE)致命的神经退行性疾病是一组由克雅氏病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合症(GSS)致命性家族失眠症(FFI)和“库鲁”的人类,在cervids慢性消耗性疾病,牛海绵状脑病牛,羊搔痒症的发病率(1]。朊病毒疾病与他人在一起,如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和亨廷顿氏舞蹈症(HD),也称为构象或错误折叠的疾病,因为他们的特点是蛋白质错误折叠和胞内积累和/或胞外聚合物(2]。的谢霆锋,实验证据指出,正常细胞的朊蛋白(PrP的转换^C),进入错误折叠和致病性(PrP)^Sc),发病机制中的关键事件(3,4]。基于模板的自动传输的过程中突显出一代感染朊病毒。因此,分子干扰PrP^C/ PrP^Sc转换和/或中和作为潜在的治疗候选人朊病毒疾病。此外,细胞代数余子式,末端监护人或RNA,可能扮演着重要的角色在感染朊病毒的产生和可能被认为是额外的治疗靶点5]。

谢霆锋有还没有有效的治疗方法,和immunobased方法正在成为重要的治疗策略对这些疾病(6,7]。抗体的一个特点是,他们可以专门选择对构象的蛋白质种类包括病理构象(错误折叠单体、低聚物和/或纤维),代表错误折叠疾病的主要治疗目标。这独特的性质使抗体对朊病毒疾病和有前途的分子构象的障碍。在免疫治疗方法中,基于基因的胞内抗体或intrabody技术可能是一个有用的平台,用于治疗神经退行性疾病(8]。

这种方法是基于嵌合分子组成的特定的表达重组抗体或抗体片段融合细胞内贩卖序列不仅活跃在不同亚细胞的隔间也在细胞外环境9]。这允许一个目标各种毒害神经的矫形器来自misfolding-prone蛋白质在细胞质中(即生成。τ,α-核蛋白),细胞核(即。,huntingtin), or the secretory compartment, inside or outside the cell (i.e., APP,β淀粉样肽,朊病毒10- - - - - -14])。由于这个定义,我们认为intrabodies所有重组抗体片段,设计一种基于基因免疫治疗协议。许多intrabodies反对蛋白质参与阿尔茨海默氏症的发病机理,朊病毒,杭丁顿氏症和帕金森疾病已经生成并成功地应用于细胞和这些疾病的动物模型8,15]。有效的可用性在活的有机体内基因运载系统进入大脑仍然是一个主要障碍的临床应用intrabodies,但新基因携带者的生长发育和交付系统拥有更大的潜力为下一个未来。

2。Intrabodies

Intrabodies嵌合抗体片断重组工程块或调节目标蛋白质的功能。抑制方法是一个有价值的工具,在活的有机体内,广泛的功能选择抗原在细胞内和细胞外水平(9]。第一份报告后,在哺乳动物细胞(16],intrabodies发现应用程序作为治疗传染性疾病,癌症和神经退行性疾病(8,17,18]。与其他基于基因的技术,他们在一个转译后的水平,可以选择一个精确的抗原决定基的目标蛋白质,包括蛋白质构象,蛋白质交互网站,转译后的修改,也非蛋白质抗原。

抗体,因为大多数分泌蛋白质,有一个短暂的疏水性领袖序列指导他们通过分泌隔间。通过与细胞内贩卖序列帧融合,抗体针对细胞质,细胞核,内质网(ER),质膜(19,20.),最近,还向趋向下降的隔间(21]。针对信号成功地用于intrabody应用程序的例子如下。intrabodies的细胞质表达是通过删除分泌的领袖序列(leader-less)和核目标通过添加leader-less抗体片段一个或多个核本地化序列(NLS) [22]。11个氨基酸的信号肽,来自十字的homeoprotein,使细胞质单链可变片段(scFvs)分泌缺乏古典分泌信号,最近发现(23]。融合这样的非传统分泌反序列α-核蛋白scFv使分泌的细胞内目标抗原(24]。Intrabody目标趋向下降的途径是通过添加蛋白酶体目标信号,如害虫主题的鸟氨酸脱羧酶(21,25]。

为了防止出现质膜上的受体或居民蛋白质或抑制选定的分泌蛋白,ER-retained intrabodies设计一个领导者在n端序列和保留肽KDEL,糖基(22]。保留在实现trans-Golgi trans-Golgi保留信号(26]。Intrabodies目标可以通过质膜融合单链抗体与受体片段跨膜域(27]。

2.1。选择一个Intrabody格式

重组抗体格式更广泛用于intrabodies单链阵线片段(scFv)和由变量域的免疫球蛋白重(VH)和光(重要的)链与灵活的多肽防止离解。其他类型的抗体片段已经成功地改造和用作intrabodies。这些重组双特异性和四价抗体片段(intradiabodies)和单一域片段(28,29日]。intradiabodies由两个scFvs联系通过第二和第三重链恒域(30.]。单极碎片组成的一个变量域(如六世或VH链)和最小的功能性抗体片断被表示为intrabodies [31日,32]。他们来自天然homodimeric重链抗体(vhh)出现在骆驼科的免疫系统并且有很出色的溶解度的性质,稳定性和哺乳动物细胞中表达。这些分子很容易生产,规模要小得多,可以改造成新的试剂,增强治疗效果。由于其规模较小,他们可能目标含糊不清的抗原表位。最近的研究证明,通过intracarotid和静脉注入小鼠生活,基本vhh(等电点≥9)能够穿过大脑血液屏障(BBB)在活的有机体内并扩散到大脑组织(33]。有趣的是,废除PrP的骆驼科antiprion抗体^Sc复制在朊病毒感染神经母细胞瘤细胞,能够轮回在BBB和交叉神经元的质膜,展示朊病毒疾病的潜在治疗使用(34]。另一个有趣的新重组scFv格式而专门设计的交叉BBB和针对朊病毒的病理形式生成。在这个scFv,链接器肽取代了cell-penetrating肽(CPP)来自penetratin。大部分的纯化antiprion scFv-CPP静脉注射局部脑细胞,证明其能力进入中枢神经系统(35]。

临床应用intrabodies,代人性化和/或来自人体的抗体领域提供了明显的潜在优势。改进的策略在体外选择完全人性化的重组抗体直接从人类antibody-display库通过创建大型天然或合成体验抗体片段逐步发展的36,37]。

3所示。针对Prionoses Intrabodies

Intrabodies可以专门选择对构象的抗原表位amyloidogenic蛋白质错误折叠疾病的发病机理。这些构象intrabodies可以抑制聚合过程的不同阶段(i)原生状态的稳定分子,(ii)齐聚反应的抑制过程,(3)可能有毒的低聚物的物种,中和(iv)原纤维形成的抑制,(v)破坏和清除的总量。

人们普遍认为朊病毒疾病的原因是细胞的朊蛋白的构象变化,PrP^C从protease-resistant球状β表丰富形式,PrP^Sc。这两个物种之间的相互作用提高了转化率,导致代潜在感染性粒子(4]。因此,阻断PrP^C/ PrP^Sc互动是一个主要的治疗目标。Intrabodies可以用来停止这种病态的交互动作的不同模式:(a)直接绑定到一个两种分子(38,39),(b)捕获PrP^C在ER (14),(c)重排PrP^C蛋白酶体降解途径(40]。特别是,重路由本地在精确的细胞内蛋白质intrabodies的位置是一个独特的性质。错误折叠的抗原,转移amyloidogenic等离子体膜蛋白的聚合或转移他们的降解通路是一个有吸引力的方式来阻止细胞毒性(41]。值得注意的是,37 kDa层粘连蛋白受体(含LR)是另一个潜在的朊病毒疾病的治疗目标。因此,含LR已被证明是一个致病朊病毒PrP的受体^Sc和朊病毒传播和发病机制中发挥重要作用[42]。

3.1。在体外研究

Intrabody应用程序对朊病毒疾病已报告的几组朊病毒感染细胞培养系统。我们组生成并稳定表达ER-retained antiprion KDEL-8H4 scFv碎片在神经细胞株容易痒病感染。朊病毒的细胞内的表达造成明显损伤成熟和易位对膜室,与一个强大的膜PrP的减少^C的水平。因此,形成和积累的致病性痒病物种,PrP^Sc139年,朊病毒毒株感染细胞受损(14]。随后在活的有机体内研究表明,老鼠,鼠脑内注射溶菌产物来自KDEL-8H4表达细胞感染痒病,发达痒病临床症状和脑损伤,展示有效的治疗(43]。的分泌版本相同intrabody (Sec-8H4),能够识别PrP^C在分泌通路,强烈抑制PrP^Sc积累139年痒病病毒感染的细胞。通过分析其作用方式,发现PrP^C总体水平明显下降是由于PrP的选择性重路由^C蛋白酶体途径。值得注意的是,Sec-8H4 intrabody损害的分泌内源性朊病毒相关分子exosomes-like囊泡,一个潜在的传播途径朊病毒传染性(40]。PrP的急剧下降^Sc人类积累也报道了coculturing横纹肌肉瘤细胞系分泌antiprion scFv (6 h4)碎片与慢性痒病感染的神经母细胞瘤细胞(44]。最近,其他研究证明细胞分泌的抑制作用antiprion scFv碎片。的antiPrP^CscFvT2,来自一个新的鼠标单克隆抗体识别不连续朊蛋白的抗原决定基,据报道,抑制痒病积累通过培养神经母细胞瘤scFvT2-secreting细胞株与朊病毒感染细胞45]。重组antiprion 3 s9scfv分泌转染HEK293T防止朊病毒积累在22 l朊病毒感染N2aC24L1-3和钱德勒朊病毒感染N2aC24Chm细胞剂量依赖性的方式(46]。

另一种被动免疫治疗方法治疗朊病毒疾病一直试图通过在细胞培养测试单价版本的antiprion D18scFv通过直接除了scrapie-infected细胞或通过慢病毒感染或重组腺相关病毒(rAAV)向量。直接添加D18scFv scrapie-infected GT1细胞减少导致蛋白酶K - PrP (PK)的抵抗力^Sc浓度的方式。通过比较两种病毒转导系统,慢病毒载体比rAAV更有效的转移anti-PrP D18scFv基因和与PrP干扰^Sc积累ScGT1和ScN2a细胞(47]。

3.2。在活的有机体内应用程序

评价治疗效果的antiprion intrabodies在活的有机体内,重组腺相关病毒载体scFvs已经应用于预防谢霆锋范例。rAAV被认为是理想的交货向量在基因治疗,尤其是对转导神经元在大脑的不同区域(48]。rAAV的安全性配置文件及其高效的基因转导呈现这个向量有价值的运载工具治疗大脑疾病,包括神经退行性疾病。血清型2的rAAV (rAAV2)是一种最常用的向量大脑交付和目前正在评估rAAV-based I / II期临床试验的帕金森症和阿尔茨海默疾病(49- - - - - -51]。这个向量已经运作了在活的有机体内intrabodies朊病毒疾病的应用。通过使用组合phagemid人类scFvs图书馆Wuertzer等人发现了四种不同PrP-specific scFv片段,评估他们的亲和力通过表面等离子体共振分析,评估在活的有机体内他们的治疗潜力38]。老鼠最初鼠脑内双边注入花托和striata rAAV2 antiprion scFvs, 1个月后,接受腹腔内接种RML朊病毒。疾病严重程度的分析表明,rAAV2 D18scFv,抗体片段PrP的特定的地区^Cprp^Sc最高的互动和PrP的亲和力^C其他scFvs相比,是最有效和显著延迟出现临床症状而被感染的老鼠在对照组。尽管所有的老鼠注射antiprion intrabodies死,rAAV2 D18scFv表达小鼠显示出了明显延长潜伏期控制老鼠相比199天(250天±8 SD和±1 SD)。PK-resistant PrP的明显降低^Sc负担也观察到在灰质和白质束实质的大脑区域注入这个intrabody, 27周后感染,当所有参数的疾病的严重程度进行评估。还必须建立以来的积累是否错误折叠朊病毒与病理变化和生存,正如前面说(52),分析PK-resistant PrP的数量^Sc在终端阶段疾病的信息。分析其他antiprion scFvs用于这项研究表明他们的亲和力和之间没有相关性在活的有机体内功效。然而,PrP的特异性^C抗原决定基认可这些scFvs也应该被考虑。

最近,D18scFv被改造为颅内注射到老鼠scrapie-infected rAAV9向量(39]。rAAV9血清型有关于rAAV2主要优势包括神经传导效率更高,颅内扩散,trans-BBB神经亲和力(53- - - - - -55]。一个月后rAAV9 D18scFv注入,小鼠腹腔接种RML朊病毒毒株。行为分析受感染的老鼠显示双边政府的rAAV9 D18scFv到下丘脑,丘脑和海马神经症状的发作与未经处理的小鼠(187±7天与166±5天)。评价存活时间显示一段时间对控制老鼠,尽管这个结果没有统计学意义。此外,神经病理学评估在疾病的早期阶段发现老鼠表达antiprion scFv较低水平的海绵状结构和神经胶质过多症与控制,以及PK-resistant PrP^Sc,主要是在丘脑、海马和尾状核/壳核。这减少了PrP的水平^Sc老鼠也明显在疾病晚期的牺牲,当不同,神经病理变化类似在rAAV9 D18scFv和sham-injected老鼠。这个结果证实了假设的严重神经病理学和存活时间不与痒病的负担,已经建议(52]。

如前所述,含LR的朊病毒受体和被动immunotransfer anti-LRP / LR scFv部分减少痒病负担在脾脏56]。显微镜下注射rAAV scrapie-infected小鼠的血清型2向量编码anti-LRP scFv-N3和-S18导致外围PrP的减少^Sc传播,没有孵化时间和生存的一个重要延伸(57]。目前还不清楚结果之间的差异rAAV研究描述Wuertzer et al . 200838),本研究将目标(PrP的不同的选择^C与含LR)或(腹腔内与颅内)感染不同的路线。事实上,Zuber等人观察PrP的减少^Sc水平与孵化时间的延长和生存是一个积累进一步证明痒病并不会自动与疾病进展和传染性。

另一个有趣的研究报告生成,通过慢病毒感染向量,一个稳定的红警2小胶质细胞系分泌antiprion 3 s9scfv / GFP (46]。为了评估的预防性antiprion效果体外3 s9scfv的基因转移,使用brain-engraftable小胶质细胞,红警2细胞系是鼠脑内注射1和3周之前大脑mouse-adapted钱德勒朊病毒菌株的接种。存活时间的分析表明,小鼠注射3 s9scfv / GFP-Ra2小胶质细胞存活时间比相应的控制仅表达GFP,虽然效果轻微(~ 10天)。评估PK-resistant PrP^Sc的水平并没有发现差异antiprion scFv表达小鼠和控制。在治疗的角度来看,3 s9scfv / GFP-Ra2小胶质细胞也鼠脑内注入7或感染钱德勒13周后22 l痒病朊病毒。在钱德勒scrapie-infected小鼠生存时间在两个实验组,每组相似,而在小鼠接种22 l朊病毒,有一种效应当3 s9scfv / GFP-Ra2细胞被注射7周而不是13周后感染。在这种情况下,PK-resistant PrP的数量^Sc没有影响的表达antiprion scFv。值得注意的是作者未能发现注射3 s9scfv / GFP-Ra2细胞在小鼠的大脑疾病末期,认为低antiprion效果报道可以归因于寿命很短的细胞系和/或低scFv表达水平。

4所示。结论

在过去的20年里,几个抗体进入生物制药市场的各种疾病的治疗和诊断,包括神经退行性疾病。不同的在体外研究表明,antiprion抗体片断防止朊病毒传播和痒病积累。尽管这一事实,在活的有机体内这些抗体的应用,既被动免疫和基于基因的策略(intrabodies),未能证明痒病感染动物模型的完整保护,即使他们能够降低脑PK-resistant PrP^Sc和延缓疾病的发生。一个担忧是治疗的选择目标分子(朊病毒单体、低聚物、PK-sensitive或PK-resistant PrP^Sc或含LR)。到目前为止,虽然不同的PrP intrabodies执导^Sc和特定的寡聚物种已经生成,在活的有机体内治疗效果仍有待证明。另一个问题是在活的有机体内稳定的病毒载体重组抗体片段抗体表达的差别和/或对这些由于PrP的神经毒性效应^Sc在antibody-expressing神经元。这两个因素会显著减少的治疗疗效antiprion intrabodies。

更有效和安全的要求在活的有机体内基因运载系统进入大脑仍然是一个关键问题intrabodies对神经退行性疾病的临床应用。目前,病毒载体(rAAV)是主要的选择在活的有机体内intrabodies的交付,但合成基因携带者的生长发育(纳米材料)或新的木马方法发展的良好前景对朊病毒疾病有效的治疗性抗体交付策略。

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