三聚物的τ是有毒对人体神经细胞在低摩尔浓度

文摘

在阿尔茨海默病(AD),τ聚合成纤维和高阶神经原纤维缠结,广告的一个关键的组织病理学特征。然而,可溶性寡聚τ物种可能在广告发展发挥更重要作用,因为这些τ物种更好地与相关神经元丧失和认知功能障碍。最近的研究表明,细胞外低聚物的τ可以抑制记忆形成和突触功能并传播病理学邻近的神经元。然而,低聚物的τ的具体形式参与毒性仍未知。在这里,我们使用了两个拼接的变种重组人类τ和单体的生成,每个同种型的二聚的,三聚物的分数。每个分数的构成由原子力显微镜证实色谱也。每个分数的毒性对人类神经母细胞瘤细胞和神经元cholinergic-like评估。三聚物的,但不是单体的或二聚的,τ寡聚物的剪接变体都是毒害神经的摩尔浓度较低。τ低聚物的进一步描述物种特异的修改和形态有必要确定最好的目标发展的生物标志物和治疗发展广告和相关tauopathies。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆症,以进行性认知障碍、脑萎缩,神经损失,死亡一般四到八年后发生诊断(1]。两个病理特点的广告,细胞外主要由β淀粉样蛋白(一种神经炎的斑块β神经原纤维缠结)和细胞内(非功能性测试)主要由tau蛋白,最初于1907年确定阿尔茨海默(博士2]。虽然已经取得了巨大的成就在理解的机制,促进聚合β和τ标志斑块和神经元纤维缠结,相对小的进展在停止或治愈疾病。家族性广告案例的分析与生产的β作为广告的发展的主要因素,导致淀粉样蛋白级联假说即的崛起β错误折叠和聚集启动AD发病机制和触发器等影响τ磷酸化,聚合和缠结形成(3]。淀粉样蛋白假说统治了十多年的领域,推动众多临床研究治疗干预措施包括几个免疫研究的目标β(4- - - - - -6]。然而临床试验失败的几个目标β对其产生了怀疑与治疗目标相关性(7]。越来越多的证据表明,τ在广告的发展也起着重要的作用。τ形成淀粉样蛋白的错误折叠和聚集可单独发生(8),在许多情况下存在的τ病变与广告不存在相关β总量(9]。间隙的β斑块不降低可溶性τ水平不足以在双重转基因小鼠overexpressing改善认知能力下降β和τP301L10]。这些结果和其他很多表明低聚物的τ可能是一个重要的治疗目标广告。

τ以单体的形式是一种microtubule-associated蛋白微管装配的关键(11,12和稳定13]。六大τ亚型可以生成替代转录后的拼接的外显子2和外显子3外显子的氨基端投影域和10(重复2)装配域(图1)。τ包含三个或四个类似的重复microtubule-binding域(MBD)结合,帮助促进微管稳定和功能。例如,重复2和重复3包含hexapeptide PHF6 *和PHF6图案,分别(图1)。这些图案增加的趋势β表结构可以与微管蛋白相互作用,形成微管并促进生成低聚物的自组装和高阶总量(14,15]。τ亚型有或没有第二个microtubule-binding重复可以聚合,但只有亚型与第二个重复扩展可以形成低聚物的形式由二硫化联系由于额外的半胱氨酸在第二个重复(数字1和2)。因此,在这项研究中,我们利用τ亚型包含第二个重复单元研究τ聚合在神经毒性的作用。

Hyperphosphorylationτ的释放需要τ的微管及其定位错觉somatodendritic隔间使τself-associate成低聚物和高阶聚集。然而,τ的hyperphosphorylation是其毒性没有直接关系,而是一种机制来调节其与微管蛋白稳定微管,沿着微管调节运输。表达外源τ在成熟的海马神经元导致沿着微管堵塞的交通和退化的突触获救τ的磷酸化激酶MARK2为微管跟踪(16]。值得注意的是,据报道,τ在细胞外空间更少比细胞内磷酸化τ(17,18)和国家更多的有毒的脱去磷酸(17]。细胞外低聚物的重组完整的人类τ蛋白被证明是小鼠的神经毒性,损害记忆的巩固19),和类似的其他实验室的工作展示了类似的效果与重组τ寡聚物和τ寡聚物组成的大脑从广告过度磷酸化τ。因此,hyperphosphorylationτ与疾病可能是一个因素在τself-association寡聚物,但τ的hyperphosphorylation本身可能不是细胞外τ寡聚物的毒性的基础。

神经原纤维缠结(非功能性测试)历来与神经元损失(20.),被认为是广告的关键细胞内的指标。方法针对τ聚合主要集中在抑制hyperphosphorylation和原纤维形成,减少总τ的水平,或稳定微管(21]。然而,越来越多的证据表明,可溶性寡聚而不是不可溶性纤维τ物种是神经毒素和发挥重要作用的发病和进展的广告21- - - - - -24]。虽然非功能性测试广告的特征特性,它们可以存在于广告神经元20到30年(25)前后期确认,因此不太可能引起直接的毒性在大脑广告(26]。tauopathy动物模型,非功能性测试的存在并不相关的神经元丧失和记忆缺陷(27]。减少神经元损失和内存性能的改善是观察到尽管增加非功能性测试(28]。此外,非功能性测试的存在病理不定位与区域的神经元损失(29日- - - - - -31日),海马的突触丢失或功能障碍以及小胶质激活发生在非功能性测试的存在(32]。相比之下,低聚物的τ是涉及大量研究中发挥关键作用的广告发展(33- - - - - -35)和神经毒性和神经退化的主要发起人36]。寡聚τ已被确定在早期阶段的神经细胞病理学在广告和密切与hyperphosphorylation microtubule-binding网站(24]。τ寡聚物可以传播内生τ病理学在整个大脑朊病毒类似,展示他们的神经毒性37]。的存在和浓度两个τ寡聚物(140 kDa和170 kDa)与各年龄rTg4510老鼠[记忆丧失33]。低聚物的τ也诱发突触和线粒体功能障碍(19]。虽然τ主要是细胞内、细胞外的角色τ是作为细胞外低聚物的获得注意τ可以严重影响长期势差在海马切片,可以传递神经元病理健康(37]。人工脑脊液和血液中检测低聚物的τ水平也是一个有前途的广告诊断生物标记物总量和过度磷酸化τ水平(38]。由于广告的低聚物的τ的重要作用和识别细胞外τ在疾病的重要性,关键是确定有毒τ物种疾病病因的关键。这里我们展示我们的研究细胞外神经毒性的单体的二聚的,三聚物的形式的两个four-repeat重组人类τ变异来帮助识别关键τ物种参与广告的发病和进展。

2。材料和方法

2.1。重组体人τ(rhTau)准备和净化

从细菌rhTau纯化是单体(BL21 DE3)克隆与τpET21B构造和pET29a向量。标准方法被用来生长,与1毫米IPTG诱导蛋白质。颗粒状细胞细胞溶解CelLytic B细胞溶解缓冲区,溶菌酶,benzonase,蛋白酶抑制剂根据制造商的协议(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)。阳离子交换(通用电气医疗集团生命科学)是用于净化的第一步SP-Sepharose树脂为τ构造,在25毫米和300毫米氯化钠Tris-HCl pH值7.4是用来洗提tau蛋白质。Amicon超离心设备(微孔)被用来buffer-exchange蛋白质制剂为50毫米Tris-HCl pH值7.4。蛋白质浓度测定用BCA分析(热费希尔科学)。τ寡聚物被孵化τ生成单体浓度的5μ米50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值7.4和100毫米氯化钠在一夜之间37°C。6%的单体和低聚物的物种是解决页面中,筛选了,buffer-exchanged Tris-HCl 50毫米。分数被nonreducing sds - page分析最小化寡聚蛋白质的降解和银染色增强信号,验证τ变异的纯洁性。蛋白质浓度测定用BCA化验。

2.2。高度分布分析

AFM样品制备和成像像前面描述的那样进行39- - - - - -44]。整除的10µL 0.50µM纯化τ变体在50 mM Tris-HCl缓冲区被沉积在单独的云母片使用多模成像AFM毫微秒示波器iii a系统(Veeco /数字仪器、圣芭芭拉分校CA)在开发模式设置和配备硅AFM探针(VISTA探针、纳米科学仪器)。高度分布的分析不同τ样品是符合正态分布概率模型使用Gwyddion 2.20。可检测蛋白质分子都假定为球形和高度值近似直径。

2.3。细胞培养和治疗

SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系(美国组织培养收集)是在组织培养瓶培养实验室的器具正欲(Falcon)。细胞生长在一个中等含44% v / v火腿F-12 (IrvineScientific), v / v MEM厄尔44%的盐(IrvineScientific), v / v变性10%胎牛血清的边后卫(西格玛奥德里奇),1% v / v MEM不必要的氨基酸(表达载体),和1% v / v /抗真菌的抗生素(表达载体)。媒体再次每隔两到三天。细胞是通过一个新的瓶瓶当他们汇合的。SH-SY5Y细胞毒性研究被播种在集群48-well细胞培养板(由康宁合并合演)细胞/在300μL新鲜培养基。每个实验进行了一式三份。细胞密度估计血细胞计数器通过阅读一个固定的体积。37°C孵化器的增长后24小时内,组织文化媒体取代新鲜血清媒体的神经毒性测试nondifferentiated细胞。调查τ毒性对胆碱能神经元,培养细胞的复制集被孵化与维甲酸诱导成cholinergic-like表现型的最终浓度10μ米(3到5天43,45- - - - - -47]。种植nondifferentiated和cholinergic-like神经元与单体的治疗,二聚的,和三聚物的变体1 n4r和2 n4r的最终浓度为2.26 nM, 4.50 nM, 11.15 nM和15.50海里。PBS -控制被用作标准后续LDH测定分析。文化是孵化与τ物种在37°C和取样3,18日24和48小时时间点收集30μ上层清液L /整除的文化。

2.4。LDH测定

LDH协议是改编自一个商业工具(西格玛奥德里奇)通用方案的基础上,德克和Lohmann-Matthes48]。如前所述执行LDH测定(40]。吸光度测量在490 nm(参考波长690 nm)。相对吸光度值的计算是通过减去参考价值的价值获得490海里。LDH %值大于150被认为是有毒的。

2.5。统计分析

所有样本的相对吸光度值归一化的控制,为每个独立的实验设置为100%。组平均值分析单向方差分析标准和LSD事后显著差异测试。所有与SPSS 21.0分析(、IBM公司,纽约Armonk)。

3所示。结果

3.1。rhTau聚合分析

我们表达了重组人类τ在细菌宿主系统中消除任何τ的转译后的磷酸化,因此删除任何潜在影响磷酸化可能在τ聚合或失去功能。结果nonphosphorylated人类重组τ(NPrhTau)单体含有活性半胱氨酸组与自由硫醇,促进分子内二硫键的形成稳定的不反应的单体和分子间二硫键的形成产生τ寡聚物和摘要聚集(图2)。聚合反应是由培养时间和蛋白质浓度。不反应的单体、二聚的和三聚物的形式的1和2 n4r n4r拼接变异生成稳定的聚合形态与大小配置文件定义依赖齐聚反应的程度和长度的剪接变体就是明证sds - page(图3(图)和AFM高度分布分析4)。每个额外的低聚物高度增加单体的τ单元固定在一定同种型、0.5 nm 1 n4r变种和2 n4r变体(图1.0海里4)。每个各自的大小2 n4r物种也比相应的1 n4r物种(数据3和4)如预期鉴于τ2 n4r包含额外的氨基端插入而n4r变体。

3.2。细胞外rhTau诱导神经毒性测试

虽然无论是单体的或二聚的形式的τ1 n或者2 n拼接变异显示检测毒性、两个变量的三聚物的形式施加显著的毒性对nondifferentiated(图5(一个)(图)和维甲酸诱导cholinergic-like神经元5 (b))与LDH值远高于150年的毒性阈值在低摩尔浓度(11.15 nM, 15.50海里)。全长2 n4r三聚物的τ形式显示毒性显著高于1 n4r三聚物的形式向nondifferentiated神经元(图5(一个)),尽管cholinergic-like神经元(图中的效果减弱5 (b))。三聚物的τ时添加到nondifferentiated SH-SY5Y细胞,增加毒性观察随时间在最高浓度为1 n4r(图6(一)),和2 n4r(图6 (b))三聚物的变体。然而,当三聚物的τ是添加到cholinergic-like神经元的毒性1 n(图6 (c)),2 n(图6 (d))变异相对一致的第一个24小时,但增加了48小时后。两变种三聚物的τ显示增加毒性向cholinergic-like神经元相比nondifferentiated神经元在潜伏期短的时间(图7(一)),但是相反的是观察到更长的潜伏期时间(图7 (b))。

4所示。讨论

而淀粉样蛋白级联假说49)为主的病因研究广告在过去十年或更长时间,τ的重要性的广告发展稳步变得更加明显。τ病理学观察在缺乏β存款在儿童和年轻成人病例,τ骨料entorhinal-hippocampal地区爆发之前β病理学(8,9]。众多研究表明,各种低聚物的形式β有毒的神经元,会损害人的认知能力(50,51),从而暗示作为诊断有价值的生物标志物的潜在作用的广告(42,52,53]。类似于各种可溶性低聚物的的重要作用β物种在广告中,不同的可溶性低聚物的形式(τ)可能在广告也起到了重要作用,也导致神经元丧失和认知功能障碍(19,54,55]。因此,便于诊断和治疗AD的治疗方法,重要的是识别关键τ物种参与疾病的发生和进展。鉴于τ有多个接头变异和转译后的修改网站,我们试图简化τ的复杂多样性形式通过关注人类重组两个nonphosphorylatedτ亚型,1 n4r和2 n4r。这两个four-repeat (4 r)亚型microtubule-associatedτ都有四个重复的领域和更容易形成聚集容易大脑蛋白质磷酸化的激酶比那些只有三个重复(3 r) [56)由于存在的重复2 microtubule-affinity增强hexapeptide主题(14,15)和一个额外的半胱氨酸二硫化形成联系稳定聚合。

最disease-relevantτ材料用于研究细胞外毒性τ形式将τ寡聚物净化特点从广告脑脊液(CSF)使用方法来保存他们的转译后的修改,包括磷酸化,糖化,泛素化,聚合和截断。准备几个non-AD和广告的情况下会有必要理解结果的重要性。我们最初的研究特别关注执行修改的τ蛋白寡聚物和控制单体具体理解细胞外毒性低聚物结构的相关性。

我们确定不同τ的毒性变异使用nondifferentiated和cholinergic-like神经母细胞瘤细胞系来确定骨料粒度和细胞表型的毒性影响。胆碱能细胞特别脆弱与重要广告下橄榄核的神经元丧失Meynert(现),也就是说,海马体和大脑皮层57]。现是富含胆碱能细胞发生变性和显著降低乙酰胆碱生产的广告58]。乙酰胆碱水平的降低和其他一些皮层胆碱能标记导致临床痴呆和认知功能障碍(58),这表明胆碱能细胞在广告特别脆弱。在这里,我们表明,三聚物的,但不是单体的或二聚的,τ是有毒的神经元细胞在低摩尔浓度,全长2 nτ变体更比短1 n的毒性变异nondifferentiated神经元(图5)。都三聚物的τ变异导致毒性都nondifferentiated SH-SY5Y细胞和维甲酸诱导神经元cholinergic-likeτ时应用细胞外地摩尔水平(图6)。然而,培养cholinergic-like神经元易感性增加展示三聚物的τ诱导毒性在短的孵化时间相比具有类似nondifferentiated神经元(图7(一)),也许部分占cholinergic-like神经元的脆弱性增加广告。自从nondifferentiated细胞同样容易受到三聚物的τ诱导毒性更长的潜伏期时间(图7 (b)),这些结果表明,细胞外三聚物的毒性τ不依赖于具体或蛋白质与胆碱能受体细胞,但毒性可能促进。我们的结果是一致的最近的一项研究表明,低分子量(流明瓦)错误折叠τ物种独家的单体的τ可以通过神经元内源性和运输顺行和逆行诱导内源性τ病理学体内纤维τ和脑源性丝状τ不能内源性(59]。这表明τ毒性可能通过细胞内吞作用在某些大脑区域的传播三聚物的τ的和更大的低聚物的形式,这种吸收促进在胆碱能神经元。

低聚物的τ的神经毒性可能相似属性的低聚物的β参与神经毒性的关键特性是蛋白质的聚合状态超过转译后的修改(23,60]。虽然有各种各样的τ体内发生变异,包括不同的转译后的修改,拼接变体,和聚合的物种,这项研究开始更系统地调查选定的τ变体在广告的作用。还需要进一步的研究来确定拼接变异的贡献和AD-specific转译后的修改在细胞外发现ττ的毒性变异,这些τ变异如何影响其他神经元模型包括主神经元或诱导多能干细胞。好试剂可以选择性地识别特定τ变异特征和形态将用于进一步的研究。

利益冲突

艾略特•大卫德维茨帕特里夏·洛佩兹和詹姆斯Moe Oligomerix员工,Inc .) 3960年百老汇,纽约,纽约10032,美国。由Oligomerix提供部分赞助工作,公司没有其他利益冲突。

确认

作者诚恳地感谢博士黛布拉页面俾路支凯克Bioimaging实验室的博士使用AFM设施和Srinath Kasturirangan建议和帮助的AFM想象高度分布分析。这部分工作是由国家卫生研究院,NIA批准号AG029777。

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