小分子Theranostic调查:一个有前途的未来在神经退行性疾病

文摘

朊病毒疾病是致命的神经退行性疾病,包括克雅二氏症在人类和痒病、慢性消耗性疾病,牛海绵状脑病的动物。他们组成主要是由非常规传染性病原体引起的错误折叠的聚合,β-sheet-rich亚型,表示朊病毒的生理细胞的朊病毒蛋白()。许多证据表明朊病毒()法作为这种转换的模板和作为神经毒性剂导致神经功能障碍和细胞死亡。因此,可能被视为疾病和治疗目标神经病理学的标志。几个诊断成像探针开发监测脑淀粉样病变患者的神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病和朊病毒疾病)。这些探针刚果红的例子,thioflavin T,及其衍生品。我们合成一系列苯乙烯基衍生品来开展,和研究他们的治疗和/或诊断的潜力。这里我们回顾这些小分子的突出特征能够检测和调节聚合形式的几个参与蛋白质错误折叠蛋白质的疾病。然后我们强调的重要性进一步研究的实际意义治疗和诊断。

1。介绍

神经退行性疾病是一个医学、社会和经济发达国家至关重要的问题。除了他们的病因通常是未知的,开发治疗和诊断疾病的干预中枢神经系统(CNS)进一步复杂化的不渗透性血脑屏障(BBB)。因此,阿尔茨海默病(AD)和朊病毒疾病仍没有药物可以治愈的,而且只有在2012年(1- - - - - -3)正电子发射断层扫描(PET)成像探测器已经包含在广告诊断医疗设备。

近年来,药物之间的密切合作交付/治疗和分子成像导致了一个相对较新的学科分支的知识,开展。开展这个术语是表示伴随治疗和诊断的属性在一个单一的代理。开展的目的是为了优化治疗的有效性和安全性,以及简化整个药物研发过程。一些激动人心的例子theranostic系统现在已经在文献中报道治疗癌症的4),动脉粥样硬化(5),和基因传递6),但很少有例子是报道在神经病理学领域,尤其是在朊病毒。在我们最近的研究(7我们详细的开发小分子与荧光性质能够同时检测和抑制β和斑块的在体外研究。进展到目前为止在设计和讨论了这些化合物的利用率。

2。人类朊病毒疾病

朊病毒(发音“pree-on”)一词的缩写是蛋白质的感染性粒子。朊病毒假说提出了1982年来解释这个令人惊奇的传导机制非常规蛋白(13,14]。发现蛋白质可以像传染性病原体传播疾病是生物学的一个里程碑。事实上,朊病毒之间的区别,提出Prusiner [14),实际的传染性原则仅仅是由蛋白质和能够复制和传播感染不需要信息核酸。在过去的十年里,已经有新的兴趣蛋白引起神经退化,因为他们可能充当朊病毒(即。淀粉样蛋白-β,α-核蛋白)。这一假说的发展深刻地影响了诊断方法和有效治疗相应的疾病。

朊病毒疾病,也称为传染性海绵状脑病(tse),发生在人类和动物。朊病毒疾病是一组快速进行性疾病临床异常定义光谱的特征。被认为是人类和动物疾病的传染性海绵状脑病的数量近年来稳步增加。他们都有着类似的特征,如大脑和变量的海绵状变性淀粉样斑块的形成()。事实上,从内部的变异同种型朊蛋白表达(),这可能存在淀粉样蛋白沉积。第一个人类朊病毒疾病的情况下,克雅氏病(CJD),据报道在1920年代(15,16]。从那时起,描述了不同形式的人类的传染性海绵状脑病可出现零星的,遗传的,或医源性疾病;包括库贾氏症,Gerstmann-Straussler-Scheinker综合症(GSS),致命的家族性失眠(FFI)和库鲁病。在动物中,几个tse已报告,包括在山羊和绵羊痒病,牛海绵状脑病(BSE)在牛、鹿和麋鹿慢性消耗性疾病,传染性貂脑病。

这里我们回顾人类朊病毒疾病的一些关键的问题。

2.1。库贾氏症

库贾氏症表现为零星的,遗传(家族),或获得(医源性或BSE-related)疾病。大约85%的所有库贾氏症病例发生零星,地理,和无所不在地,发病率每年每一百万人0.5 2例。发病的年龄中位数是第七个十年(64年)同样影响男性和女性17]。临床进展通常发生在几个星期。大约70%的这些折磨死在不到6个月。通常,库贾氏症呈现进步的痴呆和小脑变性,特点是海绵状结构,神经损失,astrogliosis,和临床综合征伴有痴呆、记忆丧失、共济失调、肌阵挛。早期症状,出现在大约三分之一的情况下,包括疲劳、失眠、抑郁、体重减轻、头痛、全身不适和不明确的疼痛感觉。除了精神恶化和肌阵挛,频繁的额外的神经功能包括锥体束外的迹象,小脑性共济失调,锥体迹象,皮质盲18]。纯合性为蛋氨酸(遇到)或缬氨酸(Val)位置129人类PrP的基因(含有朊)已被确定为一个诱发因素在大多数零星和医源性库贾氏症病例(19,20.]。

2.2。家族性库贾氏症

家族库贾氏症(fCJD),代表5 - 15%的所有库贾氏症病例,分为基于许多单体型含有朊突变出现在开放阅读框和密码子129突变等位基因(21]。大多数fCJD病例(> 70%)与密码子200突变(E200K) [22- - - - - -24)或178密码子突变(D178N)含有朊基因(25- - - - - -27]。家庭形式的库贾氏症的症状取决于所涉及的PrP突变类型(28]。

2.3。医源性库贾氏症

医源性库贾氏症(iCJD)是一种非常罕见的疾病导致的神经外科,角膜移植、人工硬脑膜移植和使用人体生长激素(hGH)和垂体促性腺激素(hGNH)派生而来。医源性库贾氏症在1974年首次承认在美国接受了角膜移植手术的病人从捐赠者后来被证实死于库贾氏症(29日]。iCJD全球至少226例,包括26个美国的情况下,与政府有关的人体生长激素(hGH)从尸体污染。74年英国病例报道从1979年到2011年,65人收到来自人体的生长激素,其他8个人收到感染硬脑膜移植,和报道一例iCJD人类促性腺激素在收到。2013年4月的一个案例中可能iCJD报道(http://www.cdc.gov/eid)与商业尸体hGH 23个月治疗后病人6岁的时候。33岁,26.5年(范围-28 - 25.5年)后的中点商业尸体hGH治疗眩晕和步态不平衡发展,导致下降。七个月后,他进入状态无着丝粒的缄默症;9个月出现症状后去世。少量的额外的情况下,被称为变异型克雅氏病,是由继发感染引起的输血的血液制品传播。没有疾病已确定的新来源,当前的实践,结合改进的识别可能受到感染的人新的脆弱的手术器械消毒方法和生物制品,应当继续减少医源性疾病的风险,直到血液筛检试验对临床感染的检测验证人类使用(30.]。

2.4。变异型克雅氏病

在1995年和1996年初,少量的非常年轻的库贾氏症患者诊断在英国。sCJD由于其相似性,这人类疾病被称为新变种库贾氏症(vCJD) [31日]。sCJD相比,该病的发病的年龄中位数vCJD症患者是28年(sCJD 64年)和临床病程延长(平均14个月,sCJD 6个月)。vCJD症的出现在英国和vCJD症的实验证据是由相同的朊病毒引起的应变负责疯牛病上调的可能性vCJD流行[32,33]。实验室传播在转基因小鼠的研究表明,vCJD症的特点,包括潜伏期和神经病理变化,非常类似疯牛病和vCJD症(34]。疯牛病的传播给人类的青睐假说是一种膳食暴露prion-contaminated牛组织(可能是中枢神经系统)在1980年代35]。变异型克雅氏病很难区分从其他神经系统疾病,因此最终依赖于神经病理学诊断。它已经表明,vCJD可以诊断疣状扁桃体活检(36]。大多数vCJD症病例在个人纯合子在密码子129年相遇含有朊基因(37]。然而,Peden等人报道的一个病人是杂合子的密码子129 PRNP表明感染易感性vCJD症并不只局限于满足纯合子PRNP基因型(38]。人类的基因型在129的密码子含有朊基因是人类的传染性海绵状脑病的关键因素。这种多态性调节表型和疾病易感性收购或零星的朊病毒感染(39]。个人受朊病毒疾病的大多数纯合子在密码子129遇到或Val [19,20.,40]。遇见/见到只有39%的患病率在正常的白人人口,而遇到/ Val的频率约为50%,对于Val / Val 11%19]。在一些报道的保护作用含有朊密码子129年的一些杂合性被继承的朊病毒疾病(41,42]。

2.5。GSS

GSS是一种罕见的朊病毒疾病和发生在全世界每年每1亿人(43]。库贾氏症相比,GSS几乎总是在家庭环境中描述。只有少数散在病例类似GSS迄今已报告(44]。奥地利于1928年第一次描述了综合症神经学家乔瑟夫•(1887 - 1969),紧随其后的是一份更加详细的报告与他的同事合作恩斯特Straussler和Ilya Scheinker45]。大多数病人显示第一个症状在第四或第五个十年的生活。调查表明,错义突变存在含有朊GSS病人的基因。到目前为止,各种突变已确定,最常见的是密码子102 (P102L) [46];其他报告105 (P105L) (47)、114 (G114V), 117 (A117V) [48),131 (G131V) (49)、180 (V180I), 187 (H187R), 198 (F198S) [50)、202 (D202N), 212 (Q212P)和217年(Q217R) [42]。停止报道突变是y145stop - 129米(51,52),Q160STOP、Y226STOP Y227STOP [53)(图1)。此外,描述了插入突变发生在氨基八肽重复区域PRNP [54,55]。

2.6。FFI

致命的家族性失眠(FFI)于1986年第一次描述了在一个53岁的男人56]。从那时起,据报道在一些欧洲国家57- - - - - -59),澳大利亚(60),日本(61年]。FFI的发生与相同的密码子178突变(D178N)也观察到在一个亚型家族库贾氏症(62年]。造成的表型D178N突变取决于129密码子多态性。129 - asn 178等位基因将会见的FFI,而Val 129 - asn 178等位基因将fCJD [25]。最近,第一个病例,一种零星的致命的失眠(sFI)已报告在一个44岁的男人和一个58岁的女人63年- - - - - -65年]。FFI和你有相似的疾病表型。中断睡眠障碍都有临床特征(失去睡眠纺锤波、慢波睡眠和rem睡眠期间颁布的梦想),自主hyperactivation和运动异常(肌阵挛、共济失调、构音障碍、吞咽困难、和锥体迹象)。宠物显示明显的丘脑和边缘代谢减退,越来越广泛的在以后的阶段。神经病理学评估揭示了严重神经损失和astrogliosis前内侧丘脑伪劣的橄榄,与后来的脑皮质和小脑参与66年]。

2.7。库鲁病

“库鲁”(“恐惧而发抖”)是人类海绵状脑病的原型。限制的人们生活在新几内亚的东部高地,朊病毒在传播仪式的同类相食(67年]。该病主要发生在妇女和儿童,因为他们的大脑消耗死去的家庭成员。1959年,当地政府禁止食人肉的做法。

3所示。朊病毒转换:“Protein-Only”假说

中央分子事件的自动传输的构象转换是哺乳动物朊病毒的复制错误折叠的的形式。这种假设被称为“protein-only假说”(14]。近几十年来几个一直在努力理解的机制来转换。提出了两个模型,即(i) template-directed重折叠模型和(2)seeded-nucleation模型。(我)template-directed折叠模型假设之间的直接交互和,这是诱导转换成更多。高能障碍可能预防的自然转换来。在这个模型中的关键步骤之间的转换是一个二聚体的形成和或部分折叠中间的不稳定用PrP *。最终作为一个模板催化重折叠的一个热力学更稳定构象(图2(一个))。(2)“播种”或州nucleation-polymerization模型和在一个可逆热力学平衡。所以,只有几个单体的分子(更不稳定)是安装在一个高度有序的种子可以更多的单体的被招募并最终聚合形成淀粉样蛋白。在这样一个晶莹的种子,变得稳定。这种机制的病原反应步骤不是构象转换本身而是成核的步骤。碎片化的总量增加核的数量,可以招募更多的因此似乎复制代理。在零星的朊病毒疾病,波动在当地浓度可能很少(异常)触发自发播种和自动传输的朊病毒复制(图2 (b))。

在这个转变过程中,PrP的主要结构不会改变,但二级和三级结构是明显不同于那些。

3.1。的生理功能

它仍然是不清楚的毒性代表一个增益函数(68年)或者损失的函数负责朊病毒引起的神经病理变化(69年]。有一件事是肯定的-表达在中枢神经系统,允许转换成吗,因为PrP-deficient小鼠的感染,含有朊^0/0(苏黎世我][70年]或含有朊^−−/(爱丁堡)(71年),是不成功的。protein-only预测的假设,这些老鼠完全抗朊病毒感染(72年]。无处不在的存在支持这一概念,PrP广义脑组织细胞功能。一些实验研究[73年- - - - - -75年)表明,可能发挥作用在突触的结构、功能、和维护。定义的功能仍然是朊病毒生物学的主要挑战之一,它是绝对也是为了理解tse归因于转译后的要求来转换。

本文的重点不是生理的PrP形式,而病理痒病同种型。

4所示。的传染性海绵状脑病的诊断

不幸的是,确认tse历来的临床诊断困难,常规实验室检测在检测无效。例如,脑脊液最常出现正常,除了τ和14-3-3蛋白的增加。这两种生物标记支持库贾氏症诊断的敏感性为92%,特异性为71% (76年]。在确定sCJD情况下大脑核磁共振是越来越有用。高信号异常在基底神经节和/或皮质扩散加权成像(驾车)和液体衰减反转恢复序列(天赋)最近被添加到可能sCJD诊断标准(数据3(一个)和3 (b))[77年]。此外,神经影像学MRI有助于排除其他原因的亚急性神经疾病。一般来说,很少有成像异常,例如,在某些情况下广义萎缩;sCJD不到10%的情况下,基底神经节的hyperintensity可能在t2加权图像。在vCJD putaminal hyperintensity在t2加权像上是一种常见的发现(78年]。在FFI,宠物可能会检测到丘脑代谢减退虽然在其他朊病毒疾病的宠物通常显示非特异性皮质代谢减退。一个有用的测试是脑电图(EEG),衡量脑波活动(图3 (c))。脑电图往往显示了一个异常特征模式,通常在疾病的后期,但这种技术并不证实谢霆锋的诊断。朊病毒疾病的明确诊断,可以与任何痴呆一样,只有通过病理活检或尸检后确认。因为最终临死前的检测在活检标本是沮丧,因为它是侵入性和卫生保健人员构成风险,不幸的是最后一个选项是解剖结果和分析组织的感染患者(79年]。

朊病毒疾病通常表现为广泛的神经退化,因此表现出认知和运动功能障碍的临床症状和体征。此外,感染朊病毒传播,形成淀粉样斑块,这被认为是为主要特征的疾病和作为主要诊断标准。自部分耐药与蛋白酶K消化(PK),这个特征被用于识别感染样本。其他有用的生化特征来区分从中不溶性非离子去污剂和高的内容吗β表二次结构。的化验检测测试脑组织,朊病毒的最大浓度被发现在疾病的晚期阶段。标准组织病理学和免疫组织化学技术是用来查看组织显微镜下和识别特征液泡,斑块或其他异常特征和染色与朊病毒疾病相关。标准的验证性测试是PK消化后的免疫印迹。

4.1。免疫印迹

这种技术利用部分PK阻力的痒病形式。治疗PK的去除结果只有90个氨基酸的n端(图1)。剩下的PrP“核心”用抗蛋白酶(PrP)。有限的蛋白酶消化经常会产生较小的,protease-resistant分子约142个氨基酸,称为PrP的观众。在相同的条件下,和某些形式的完全水解。尽管抗蛋白水解作用有限检测已被证明是一个方便的工具,并不是所有的分子抗蛋白酶消化(用敏感,年代)[80年- - - - - -84年]。图4显示了典型的免疫印迹的感染/未感染和PK消化/ PK不消化脑匀浆。

4.2。Conformation-Dependent免疫测定(CDI)

另一个测试用于检测朊病毒是conformation-dependent免疫测定(CDI)。这个诊断测试同时措施特殊抗体结合变性和原生形式的PrP (82年]。1998年,Prusiner等人形容这种分析不仅能够测量非常低的水平但也能区分各种朊病毒菌株。2002年,同一作者85年CDI)报道,能够测量(致病对碘氧基苯甲醚)在牛脑干灵敏度类似终点滴定的转基因小鼠(Tg)表达牛PrP (BoPrP)。朊病毒滴度~ 10⁷ID₅₀单位每克牛脑干时以Tg BoPrP老鼠,一个图~ 10倍,由生物测定牛和~ 10000倍,由野生型老鼠的生物测定。这个免疫测定提供了重要的三级和二级结构信息,这是依赖于应变。CDI的结果应该与那些来自光学时间分辨荧光光谱等光谱技术(FRT)和圆二色性(CD)光谱。分析能力的三级和二级结构的特性原油匀浆打开几个新领域的调查,包括测定各组织结构以及在不同地区的中枢神经系统多种朊病毒株。2005年,测定的灵敏度提高了选择性沉淀与钠₂H (PW₁₂O₄₀][86年]。

4.3。蛋白质错误折叠循环放大(PMCA)

据几组,持续传播在中枢神经系统(主要)导致致病蛋白的积累和沉淀。因此,转换成也可以复制在体外使用一个叫蛋白质错误折叠的技术循环放大(PMCA)索托和他的同事们(是这方面的先驱87年]。PMCA允许传播在体外从非常少量的察觉播种材料数量足够的供免疫印迹检测或plate-based免疫测定。例如,使用脑源性作为衬底,1μ克/毫升可以检测到88年]。这之前超灵敏的方法应用于识别朊病毒在一个广泛的组织和体液从scrapie-infected羊(血液、粪便、唾液和牛奶),只有少量的传染病驻留89年- - - - - -93年]。鉴于其独特的能力来检测朊病毒在易接近的组织和临床前阶段的疾病,PMCA朊病毒疾病是一个可行的临床前试验。

4.4。淀粉样蛋白播种试验(ASA)

早在2004年,Legname et al。94年]报道的生产合成朊病毒通过在体外转换recPrP [94年]。在不同条件下他们能够获得两种不同形式的β表丰富结构(β低聚物式和recPrP聚集在纤维形成淀粉样蛋白)。聚合过程是由简单的监控应用thioflavin(阻)反应混合物。这个染料显示强烈的荧光增加绑定β-sheet-rich结构像淀粉样蛋白聚集。重要的是,在这本书中作者发现,添加种子新鲜prefolded淀粉样蛋白的反应大大缩短了颤过程(称为迟滞期)。这个实验表明,recPrP纤维可以由播种,将技术定义为淀粉样播种试验(ASA)。在2007年晚些时候,作者报道,亚撒朊病毒的唯一组成部分,人类的大脑样本与零星的克雅二氏症以及啮齿动物实验朊病毒疾病(95年]。使用阻试验时,他们发现许多朊病毒菌株能够播种recPrP成淀粉样蛋白的聚合,证明这个播种属性可以作为分析检测朊病毒在生物样品(95年]。

4.5。实时Quaking-Induced转换试验(RT-QUIC)

的发展在体外技术,如PMCA ASA,产生了潜在的敏感检测朊病毒。Quaking-induced转换试验(QUIC)是另一个放大试验与ASA (96年]。这在体外 放大技术采用可溶性重组PrP (rPrP-sen)作为底物,这是播种然后进行间歇自动震动。这种技术可以比PMCA更容易执行,需要反复声波降解法。以前的研究已经表明QUIC化验正确区分正常和scrapie-infected脑脊液样本仓鼠和羊朊病毒疾病模型(97年,98年]。最近,更精制QUIC测定,称为实时quaking-induced转换试验(RT-QUIC)、设计(99年]。RT-QUIC提供敏感性相似在活的有机体内仓鼠生物测定,但大约是50 - 200倍和便宜得多。RT-QUIC允许≥1成品的检测在稀释的克雅氏病(CJD)脑匀浆(99年]。这些发现表明承诺提高诊断能力的RT-QUIC临死前的评估怀疑库贾氏症(One hundred.]。此外,Gmitterova等人报道,ELISA试验,衡量所有14-3-3亚型,是非常有用的检测(101年];然而,这个系统不是商用。因此,根据世界卫生组织,朊病毒疾病的诊断通常是根据病史、症状(肌阵挛、抑郁),诊断测试,例如,MRI扫描和脑电图。

5。目标化合物

的存在存款朊病毒疾病被认为是一个标志,作为主要的诊断标准。同时它代表药理干预的治疗目标。事实上,治疗主要调查目标的积累在大脑中。许多药物候选tse已报告,到目前为止,只有很少被证明是有效的在活的有机体内研究。这两个最有前途的化合物,奎纳克林和戊聚糖polysulphate,在很大程度上被认为是无效的患者(102年,103年]。大量的化合物在大量研究表明antiprion活动使用朊病毒在细胞培养中抑制化验[104年- - - - - -107年]。例如,这些化合物包括硫酸多糖、多缩戊糖polysulphate [108年)、刚果红等偶氮染料(109年),两性霉素B和类似物110年),蒽环霉素(111年),酞菁、卟啉(112年],菲啶衍生物[113年)、无机离子、分支多胺,n -甲基- d受体的拮抗剂,如美金刚胺(114年)和吖啶衍生物,如奎纳克林(115年- - - - - -117年]。为朊病毒感染,免疫治疗方法也正在尝试成功的不同层次(106年,118年,119年]。此外,进一步筛选方法最近被报道的大型复合集合在体外(113年,120年,121年]。

6。阿尔茨海默病的诊断

而朊病毒疾病是一种罕见的神经退行性疾病导致痴呆、阿尔茨海默病(AD)是最常见的一个。

广告包括神经炎的斑块的病理特性由淀粉样蛋白-β肽(β)纤维,神经原纤维缠结的过度磷酸化τ(非功能性测试)的蛋白质,和神经递质赤字。虽然有快速增长对病因的理解,遗传学,和潜在的病理生理机制近年来广告,仍然没有治疗这种疾病的方法。治疗主要是症状,因为它的目标是取代神经递质赤字。在寻求疾病修饰治疗,许多药物开发项目追求战略直接相关的淀粉样蛋白或τ。实际上,这些细胞外的斑块和存款β和细胞内非功能性测试成为多年来广告的病理特点和药物靶点。尽管一个健壮的支持的重要性,大多数努力都集中到目前为止发展antiamyloid代理用于疾病的早期阶段。疾病的早期治疗的先决条件是广告斑块的早期检测。因此,几个策略开发淀粉样蛋白的成像,即放射性标记的淀粉样蛋白-β肽(β)抗体和多肽片段,小分子为PET和SPECT成像、核磁共振和化合物。

几个研究小组采用小分子方法来开发适合淀粉样物质成像。刚果的一些最有前途的化合物衍生品红色,thioflavin T,对称二苯代乙烯,FDDNP。他们中的一些人,就像[¹⁸F] FDDNP和[¹⁸F] TZDM,已报告为弥漫性斑块或有亲和力β_1-42艾滋病患者斑块(122年,123年]。值得注意的是,FDDNP报道标签也PrP斑块在大脑的部分(124年]。然而,这些化合物在实际使用的探针有一些限制在活的有机体内成像,因为他们的延迟冲刷和非特异性积累在大脑白质(125年]。非特异性结合的成像探测导致高背景活动和低对比度图像的目标结构,导致困难的早期检测菌斑存款。因此,需要遵循一些基本标准为淀粉样斑块(表获得小分子探针1)。表1列出了标准的理想成像化合物检测淀粉样蛋白在大脑的患者的生活。

大脑中的淀粉样蛋白斑块的可视化生活广告将极大地帮助患者评估antiamyloid疗法的疗效。到目前为止,一些团体从事磁共振成像(126年,127年和宠物12,128年,129年淀粉样斑块]探测。值得注意的是,宠物配体匹兹堡化合物B ([¹¹C -]加以或6-OH-BTA-1)表明承诺在早期的临床试验,目前使用的人类研究[130年,131年]。其他团体报道的发展新的近红外荧光(NIRF)配体β(132年,133年]。由于物理半衰期短carbon-11(20.4分钟),最近,努力专注于发展β斑块示踪剂与氟18放射性标记的放射性同位素的半衰期(109.4分钟)的长得多。他们中的一些人,比如4 - (N-methylamino) 4′- (2 - (2 - (2 - (¹⁸F] fluoroethoxy)乙氧基)乙氧基的对称二苯代乙烯([¹⁸F] bay94 - 9172, florbetaben Ki(= 2.22±0.54海里)1,2)和2 - (3 - (¹⁸benzothiazol-6-ol ([F] fluoro-4-methylaminophenyl)¹⁸F] ge - 067、flutemetamol Ki(= 0.74±0.38海里)3),已经在临床试验报告。2012年4月,(E) 4 - (2 - (6 - (2 - (2 - (2 - (¹⁸F] fluoroethoxy)乙氧基)乙氧基的)pyridin-3-yl)乙烯基)-N-methylaniline ([¹⁸F] AV-45 florbetapir Ki =(2.87±0.17海里)134年,135年)已通过美国食品和药物管理局(FDA)的放射性脑成像诊断代理表示β斑块的患者正在接受广告和其他认知障碍的原因。尽管解剖仍然唯一积极的方式诊断阿尔茨海默氏症,能够识别β斑块在活的有机体内是一个主要的进步。

因为生物的作用β淀粉样肽是不确定的,研究人员还在研究的替代目标干预在发展的不同阶段。持续不断的努力研究团体资格生物标志物在临床试验的设计和浓缩方法研究人口与早期阿尔茨海默氏症患者反映重要FDA的优先事项。尽管我们不断增长的各种疾病生物标记物之间的关系的理解和阿尔茨海默病的临床过程,目前尚不清楚是否药物的影响等一个或多个生物标志物可以预测一个有意义的临床受益。

7所示。淀粉样蛋白染料及其衍生品

正如上面提到的,候选人探测器主要是来源于淀粉样蛋白染料刚果红等(CR)和thioflavin T(阻)125年]。在所有amyloid-staining化合物,CR提供了历史上最标准化的方法染色淀粉样斑块和仍在使用后期组织学分析广告的大脑,作为绑定特定的(136年]。这里我们回顾刚果红的几方面,thioflavin T,及其衍生品。

7.1。刚果红(CR)

刚果红(计划1)在1884年发明的,年轻的德国化学家保罗Bottiger (Bottiger p .德意志帝国专利28753年8月20日,1884)。他还创造了第一个“直接”染料,不需要额外的物质固定纺织纤维(137年]。CR与淀粉样原纤维的相互作用机制还不是很清楚。一些研究表明,淀粉样蛋白的特定绑定的CR的起源β总量是由于带负电荷之间的静电相互作用结合CR的磺酸盐组与带正电的氨基酸残基β表结构(138年,139年]。然而,甚至普遍认为,CR的绑定依赖于二次纤维的配置,主要包括交叉-β表(140年]。出人意料的,最近的一项调查表明,染料也有能力干扰蛋白质的错误折叠和聚集的过程。这是可能的,稳定本地蛋白质单体或部分折叠中间体,同时减少更多的有毒蛋白质寡聚物的浓度(141年]。事实上,CR能够阻止β聚合和毒性在鼠海马神经元文化(142年,143年),在海拉和PC12细胞(144年文化,在人类巨噬细胞(145年]。尽管CR在转基因小鼠模型的影响的广告没有调查到目前为止,CR在其他实验模型产生了积极的影响,如黑腹果蝇。喂食5% w / v CR的胚胎阶段导致显著延长生存,并进一步组织学分析显示减少的数量β大脑和视网膜组织的聚集和保存(146年]。早在1992年,令和种族(147年)报道,CR抑制积累和抑制痒病代理复制(在间隔从1.4μ米到42μ米)在细胞培养的研究(在老鼠的神经母细胞瘤细胞,N2a),表明的积累一直压抑甚至CR后删除。在在活的有机体内研究CR已经观察到产生的改善作用在动物实验感染两种不同朊病毒株(263 k和139 h) (148年,149年]。0.1和10毫克的剂量CR (i.p)没有任何影响,而高铬用量(10毫克一周一次或每周两次5毫克)诱导培养时间增加一个小智能卡scrapie-infected老鼠。每周累计剂量75毫克的CR分布在六天(12.5毫克)有相当大的影响,几乎与孵化时间延长至14天。ip受感染动物,低剂量的1毫克,10毫克的CR产生类似的延长培养时间。在第二个试验相同的研究中,CR在25毫克/天的剂量超过6天,接种前1 - 2周,每天的感染,或1、2、3、4周后。取得的最大影响是如果在同一天开始治疗是痒病的感染。治疗开始前2周或2周后感染几乎不太有效和无效如果开始在3和4周后感染。因此,CR治疗的时机对有益的影响是至关重要的。另一方面,其他在体外实验中,用β(150年]或(151年),表明在低浓度CR能促进蛋白质聚合。因此,CR原纤维形成的影响可以抑制或刺激取决于它的浓度。在低浓度,CR绑定填充代部分折叠,aggregation-prone形式的蛋白质(低聚物和原丝中间体)导致加速原纤维形成。在更高的浓度,然而,CR抑制原纤维排列支持变性状态,这是更容易聚合。因为CR是有毒的(高致癌因其对二氨基联苯结构),不能穿过BBB,衍生品开发,适合临死前的和在活的有机体内大脑淀粉的可视化和量化。在这里,我们报告的一些例子CR衍生品能够抑制这些聚合的蛋白质。Chrysamine-G X-34,后街男孩是CR染料的最有前途的衍生品。

7.2。Chrysamine-G

Chrysamine-G (CG)是最集中研究化合物结构类似物的CR之一。在这个导数,naphthalenesulfonic酸组交换水杨酸团体的保留interdistance 19日至20日。规模较小的尺寸,与CR,亲油性越高让它穿过完整的BBB当注射剂量小鼠(1毫克/公斤的139年]。最重要的是,CG似乎不如铬有毒,因为政府在活的有机体内(10 mg / kg - 100毫克/公斤通过i.p。)没有引起任何显著的行为影响小鼠观察期间72 h (139年]。当孵化与人类死亡的脑组织匀浆,¹¹C] CG的标签显示淀粉样血管造影术和明显高于绑定在额叶,颞叶和顶叶皮层的AD患者相比年龄组(152年]。CG似乎更有效β比CR抑制剂,后者的有效浓度在2 - 20的范围μm高的这一发现是在协议绑定的CG比CR合成上的相似之处β(Ki的0.37μM和2.8μ米,职责)。甚至Chrysamine-G减毒β_{25 - 35})全身毒性在PC12细胞中验证,降低肝癌和减少0.2 - 2的浓度范围μ米(153年]。

7.3。X-34

4-bis X-34 (1——(3-carboxy-4-hydroxyphenylethenyl)苯)是一种高荧光CG导数,其结构由一个中央苯环,两债券重氮(N = N)取而代之的是烯烃债券(C = C)。最重要的是,naphthalenesulfonic CR是由水杨酸的取代酸的酸;至于CG,这种变化导致更高的亲油性和更好的BBB渗透能力。这种化合物所承诺的染色性能β表结构的淀粉样斑块和脑血管淀粉样蛋白在广告的脑组织解剖154年]。

7.4。后街男孩

Skovronsky和他的同事报道,在2000年的合成另一个CR微分,后街男孩[(反式、反式)1-bromo-2 5-bis——(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy) styrylbenzene],展示其高亲和力β聚合在体外(Ki = 0.4μ米)(155年]。像X-34和CG,后街男孩专门标签老年斑在大脑后期广告部分。作者甚至注意到,后街男孩渗透活细胞在文化和具体结合细胞内β骨料。智能卡注射后生活的转基因小鼠模型的广告淀粉样变,后街男孩标签斑块组成的β具有高敏感性和特异性。最后,后街男孩穿过BBB和标签无数广告在转基因小鼠的大脑斑块后静脉输液针。因此,作者得出结论,后街男孩是一个合适的起点为未来努力生成一个临死前的诊断工具广告。2004年,石川et al。156年)假设BSB朊病毒领域的应用。作者发现后街男孩会紧凑的斑块,不仅在某些类型的人类的传染性海绵状脑病的大脑标本也TSE-infected老鼠的大脑中,当探针注射静脉注射。化合物也能抑制异常形成与IC谢霆锋的细胞模型₅₀值为1.4μm .此外,在额外的实验小鼠模型,静脉注射1毫克BSB潜伏期延长了14%156年]。功效只是观察RML应变。因此,这种化合物是有前途的不仅是成像探针还在tse某些菌株引起的,治疗的目的。

8。Thioflavin T(阻)

Thioflavin T(这)是另一种染料用于聚合淀粉样蛋白(方案的分析2),甚至是广泛使用的检查颤动力学原位。1959年,瓦萨尔和扑杀第一次描述了使用benzathiole染料thioflavin T作为一个强大的淀粉样蛋白荧光标记在组织学157年),显示了潜在的荧光显微镜诊断淀粉样原纤维。他们指出,这是淀粉样蛋白选择性地本地化存款,于是表现出荧光亮度急剧增加。事实上,绑定淀粉样沉积与CR (Ki略弱于子任务和低μ米范围内),但是将会呈现出一种绿色荧光变得亮1000倍在绑定淀粉样斑块(158年]。后来,Naiki等人,莱文158年- - - - - -163年)是最早的荧光光谱和绑定的属性。他们表明,在绑定的纤维,这显示一个戏剧性的转变激发最大的(从385纳米到450纳米)和发射最大(从445纳米到482纳米),这荧光仅仅源自染料绑定到淀粉样原纤维(159年- - - - - -161年]。这些研究表明,染料绑定与十字架——的存在β纤维的结构。然而,缺乏一个原子分辨率的淀粉样原纤维结构复杂的说明绑定模式。不幸的是,这包含带电集团拥有的缺点,带正电的第四纪氮benzothiazolium集团的计划2),这可能会限制这种化合物的BBB的渗透。然而,能力的具体识别和结合适度的淀粉样蛋白的亲和力使得它作为一个很好的起始脚手架衍生化和细化生成大量的淀粉样蛋白染色和临床试剂,包括用于医学成像住患者的淀粉样蛋白(12,164年,165年]。

8.1。6-Me-BTA-0、6-Me-BTA-1 6-Me-BTA-2

2001年,Klunk et al。165年]表明,把费用从年中影响amyloid-binding属性的衍生品。作者报道的合成工作三年中衍生品,6-Me-BTA-0, 6-Me-BTA-1 6-Me-BTA-2,所有的600倍,比这更亲脂性的。他们发现,绑定到一个β_1-40原纤维亲和力(Ki = 20.2海里)提出高于年中(Ki = 890海里)。这些卸货吗,衍生品彩色斑块和神经纤维缠结(非功能性测试)在大脑后期广告,显示出一些偏爱菌斑染色。此外,他们检查是否一个卸货,亲脂性的导数的将进入数量足够的大脑成像的宠物。化合物,设计为[N-methyl -¹¹C] 6-Me-BTA-1,进入大脑的水平与常用的神经受体显像剂(0.223% ID-kg / g或ID / g(2分钟注射后7.61%),显示良好的自由间隙和是非放射性物质在大脑正常啮齿动物脑组织(间隙_1/2= 20分钟)。相比之下,6-Me-BTA化合物没有显示典型的转变激发和发射光谱时,绑定到一个β这已经被很好的记录。

8.2。BTA-1和6-OH-BTA-1

一年后,同一组(166年]表明,导数的位置6甲基苯并噻唑基,用BTA-1或(2 - (4′- (methylamino)苯基)苯并噻唑(计划2),更有前途的特点,比之前报道的化合物。这个分子呈现高度的亲和力的淀粉样斑块(Ki = 11海里β_1-40),静脉注射的¹¹C -]标记BTA-1在野生型小鼠大脑导致高吸收(ID / g(2分钟注射后12.9%)。重要的是,¹¹C] BTA-1特点是相对快速出口的放射性物质从正常脑组织。淀粉样蛋白沉积多光子显微镜成像的大脑中生活PS1 / APP转基因小鼠系统性注射后标记BTA-1。作者得出结论,(¹¹C] BTA-1进一步发展是一个有前途的放射性配体作为宠物体测代理广告。

在2004年,这种无电荷的导数是也考虑,石川等人抑制剂和分子能够标签PrP沉积在谢霆锋的大脑156年]。使用一个著名的ScN2a抑制试验在细胞培养中,作者发现BTA-1承诺抑制活动(IC₅₀= 4海里)和低毒性,因为没有明显的变化观察到10μM的治疗。接下来,他们评估其效用PrP斑块的诊断成像工具使用人类谢霆锋情况下组织病理学标本。他们发现它能够荧光标记的PrP斑块的脑皮层GSS病例和变异型克雅氏病的情况下,而这是无法染色PrP斑块的零星库贾氏症病例。类似的结果观察当后期Tg7老鼠的大脑感染了263 k应变被使用,考虑到它玷污了斑块类型的PrP在大脑皮层和海马之间的白质。由于没有正电荷和穿过BBB的能力,他们甚至执行在活的有机体内实验使用Tg7小鼠感染263 k的压力。注入丸BTA-1标记PrP斑块之间的白质影响大脑皮层和海马。微弱的脑血管标签是偶尔观察到在注射后4小时,但不是在18 h或更高版本。此外,没有观察到显著的标签未感染的转基因小鼠。也观察到类似的结果Tga20小鼠感染RML,尽管标记PrP斑块较少。甚至连6-hydroxy BTA-1导数(也称为加以或6-OH-BTA-1)抑制ScN2a细胞形成集成电路₅₀在摩尔范围;更重要的是,它已被选为第一个人体试验的苯并噻唑体测代理(131年]。后者的报告,罗等人分析了16个诊断轻度AD患者和9所控制。他们的研究结果表明,PET成像与[¹¹C -]加以示踪提供定量信息生活的淀粉样变患者的广告。由于有利的放射性示踪剂资料,加以已成为最常用的宠物淀粉样蛋白剂,采用全球40多个研究中心(图5)。然而,最近的一项研究强调,(¹¹C -]加以宠物不检测PrP-amyloid朊病毒疾病患者,包括克雅二氏病(167年]。

8.3。NIAD-4

另一个新兴的方法在活的有机体内聚合蛋白的检测是通过特殊的近红外(NIR)荧光光学成像造影剂。2005年,随着报道在表的规则1,Nesterov等人设计了一个小分子被称为[[5′- (4-hydroxyphenyl) [2, 2′-bithiophen] 5-yl]亚甲基]-propanedinitrile,或者只是NIAD-4(计划3)[133年]。绑定研究人工聚合淀粉样蛋白化验显示NIAD-4绑定到相同的网站BTA-1 Ki为10纳米。这种亲和力的高于(Ki = 580海里),接近的高亲和性amyloid-binding化合物如加以(Ki = 4.3海里)(168年]。Nesterov et al。133年]研究NIAD-4绑定的特异性β通过原位从转基因小鼠大脑组织化学染色的固定部分。大脑部分来源于年龄与广告病理学应用转基因老鼠。大脑部分被贴上NIAD-4 (10μ米)的解决方案在DMSO /丙二醇在室温下15分钟。在体外NIAD-4荧光成像技术显示较高的特异性标记,显示聚合的确切位置和大小β存款。作者(133年)也显示在活的有机体内一个β绑定的NIAD-4岁APP转基因老鼠。老鼠准备与颅windows允许直接监测大脑表面,然后接种10μ米2毫克/公斤NIAD-4输液注射方案。红色荧光成像技术利用多光子显微镜显示代理容易穿过BBB,标示明确斑块和脑血管淀粉样血管病。NIAD-4的放射性标记的版本也可能是有利的PET和SPECT成像。

8.4。bf - 168

几个对称二苯代乙烯衍生物合成的化合物淀粉样斑块的探索169年]。对称二苯代乙烯显示绑定到一个β聚合物的摩尔范围(170年]。类似的一系列成像探测器被报道在171年),描述在体外和在活的有机体内属性的styryl-based衍生品的。最有前途的一个是6 - (2-fluoroethoxy) 2 - [2 - (4-methylaminophenyl)乙烯基)苯并恶唑(bf - 168)(计划3)。在广告的大脑部分,bf - 168选择性地结合老年斑和识别β_1-42艾滋病患者弥漫性斑块以及神经炎的斑块。静脉注射PS1 / bf - 168的应用,导致特定APP23转基因老鼠在活的有机体内标签紧凑和扩散大脑中的淀粉样蛋白沉积。此外,¹⁸F-radiolabeled bf - 168静脉注射正常小鼠显示丰富的初始大脑吸收(3.9% ID / g在注射后2分钟,足够水平的大脑成像探测器)和快速间隙(_1/2= 24.7分钟,表明大脑快速冲刷)足够的复合PET成像探针。此外,放射自显影图的大脑部分APP23转基因老鼠在静脉注射后180分钟¹⁸F] bf - 168显示大脑淀粉样蛋白沉积的选择性标记非特异性结合。这些发现强烈建议styrylbenzoxazole衍生品有前途的候选人为PET和SPECT成像探测早期检测淀粉样蛋白斑块的形成在高危AD患者在舞台上发生前症状171年]。此外,这个新的styrylbenzoxazole化合物明显标记斑块的大脑标本人类的传染性海绵状脑病(sCJD和vCJD) (172年]。bf - 168也抑制异常PrP形成与IC TSE-infected细胞₅₀= 0.4 nM ScN2a细胞系模型和长期的生活(~ 11.4%)小鼠感染鼠脑内与谢霆锋复合管理静脉注射时处于临床前阶段。尽管他们的功效取决于病原体应变,这些衍生品是一类新的化合物与潜在的传染性海绵状脑病的治疗药物和成像探针。

8.5。八国集团

与此同时,其他研究了苯乙烯基衍生品(129年,169年,173年,174年]。李等人。175年)测试一组styryl-based中性化合物作为潜在的在活的有机体内显像剂的β淀粉样蛋白斑块。在这工作是最有前途的一个设计成STB-8(图6(一)),它的使用体外和在活的有机体内成像实验广告转基因小鼠模型显示优秀的BBB通透性和特定的染色β淀粉样斑块(图6(b))175年]。

类似的化学支架是我们最近的工作报告(7]。复合(E) 6-methyl-4-amino-2-styryl-quinoline或八国集团是一个小分子(图6)用适当的特性可能诊断,提供治疗,在蛋白质错误折叠和监控反应治疗的疾病。这些特性包括化合物荧光发射的近红外光谱区域和与一个的能力β与高选择性和朊病毒原纤维,染色。此外,该化合物具有反对antiaggregation属性β_1-42使用知名ThT-based荧光的测定(176年)和延长的滞后阶段形成纤维性颤动试验(177年]。在一个集中的50μM,八国集团推迟原纤维形成,延长迟滞期≥70 h(控制:59 h)。类似的配置文件被发现GN8, antiprion药物候选人(图6)的一个特定的绑定与PrP已被实验证明(178年]。有了这样一个好在体外概要文件,我们对待ScGT1 ScN2a细胞系的化合物,和生存能力还是很不错的。在1μM浓度,G8显示非常低的毒性,细胞生存能力高于90%如果相比之下,参与细胞,而在10μM它仍然显示一个可容忍的毒性浓度,剩余60%细胞生存能力不不同于药物GN8候选人。从这些无毒浓度,我们把细胞来评估其抑制活动,我们发现这种化合物具有抑制submicromolar能力(EC₅₀= 0.5±0.1μ米),大于GN8 (EC₅₀= 1.5±0.1μ米)在我们的系统。确认的标签聚集在活细胞荧光染色法和八国集团进行了使用相同的ScGT1 ScN2a细胞模型。我们发现0.025%的盐酸G8·(0.84毫米)足以观察到许多治疗细胞的荧光斑点检查荧光显微镜(图6(c))。重要的是,没有观察到细胞无毒性,点确定一个特定的绑定。此外,观察到的染色模式符合0.025% thioflavin年代(黑色),一个共同的染料。进一步实验证明,G8·盐酸(0.25毫米)区分异常,聚合,PK-resistant同种型的正常,PK-sensitive同种型。因此,消除后通过PK消化步骤中,前面的观察fluorescence-staining模式。我们主要用FITC过滤器设置为这些研究,但我们证实了染色采用黑色的,这是在近红外光学窗口。八国集团交叉的BBB在体外模型,如并行人工膜透性试验(南美大草原、Pe 23.1±1.9十⁻⁶厘米⁻¹)。

从药物化学的角度来看,八国集团提供了独特的优点:(1)较低的分子量比先前的传感器(179年)和(2)一个小分子的支架上,很容易操纵经得起进一步改善荧光响应和amyloid-binding属性。最重要的是,关于之前报道近红外传感器(淀粉样蛋白132年,133年,180年- - - - - -182年)提供相应的优势承诺antifibrillar概要文件(在体外和在细胞环境中),加上较低的毒性。如果这些独特的属性是证实在活的有机体内,八国集团可能会成为第一个故意设计的朊病毒疾病的治疗和诊断(theranostic)工具和广告。

9。结论

所有的努力到目前为止发展快速,准确,高度敏感临死前的测试来检测朊病毒疾病早期过程中失败了。大多数测试仍然涉及PK消化,特异性和灵敏度的测试不使用PK需要进一步验证。然而,神经影像学显示承诺作为一个未来的神经退行性疾病的临床诊断工具。持续扩张的科学成像工具已经基本建立新标准战略链接在体外和细胞培养实验化验成像研究生活主题。事实上,在过去的几年里不同化合物的快速发展适合可视化聚合β-sheet-rich蛋白质导致第一个承诺在活的有机体内淀粉样蛋白配体的研究,如加以[12]。Florbetapir是第一个放射性脑成像的染料是FDA批准的淀粉样蛋白斑块。引入到临床实践,我们现在有效地进入神经退行性疾病成像的时代。

我们希望我们的八国集团分子(7)将确认在活的有机体内获得的结果在体外。分子成像的生活主题提供了独特的优势与传统相比在体外在生物学和细胞培养的研究技术。因此进一步研究前途的成像化合物访问是必要的在活的有机体内研究。使用这些化合物可能是一个好的方法来检测和治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和朊病毒疾病。作为开展一词来源于治疗和诊断,最后开展结合疾病诊断和治疗中的应用。这个组合在一个分子可以实时反馈biodistribution和目标站点上积累的化合物。并发交付和读出的功效可以利用调整为特定的治疗组治疗方案。

有效治疗严重疾病如阿尔茨海默氏症和朊病毒疾病急需,随着世界人口的年龄。我们相信,特意设计开展可能很快成为强大的工具来对付他们。

承认

EU-COST行动TD1004被公认的支持。

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