配方变化影响HA-Based水凝胶材料特性和细胞行为

文摘

开发和优化新的组织工程支架材料应用,重要的是要了解如何改变脚手架影响相互作用的细胞支架。在这项研究中,我们使用一个透明质酸(HA)为基础的水凝胶合成细胞外基质,包含修改哈(CMHA-S)改性明胶(Gtn-S)和交联剂(PEGda)。通过不同浓度的这些组件,我们可以改变胶凝时间,酶促降解和水凝胶的压缩模量。这些变化也会影响成纤维细胞水凝胶中的扩散和不同影响成纤维细胞的增殖和代谢活动和间充质干细胞(msc)。特别是,PEGda浓度对凝胶时间的影响最大,抗压模量、和细胞扩散。msc似乎需要更长一段调整到新的水凝胶比成纤维细胞的微环境。成纤维细胞能够增殖在所有配方在过去的两周,但是msc没有。代谢活动改变了每个细胞类型在两周内根据配方。这些结果强调的重要性判断矩阵组成变化的影响在特定的细胞类型的利益为了优化配方对于一个给定的应用程序。

1。介绍

组织工程继续成长为一个字段,和潜在支架的数量也在增长。过多的合成和天然支架可用合成细胞外基质(ECM),支架一般是多个组件的混合物,是为了模仿天然ECM的各种功能。这些功能包括支撑结构和细胞信号,从而影响细胞的形状,命运,和新陈代谢。因此,优化合成ECM的目标应该是直接向概括一种天然ECM的细胞功能,因此自然组织。

透明质酸(HA)是一个组件,用于合成ecm由于HA提供了对身体的好处,包括水体内平衡,关节润滑,及其发展和伤口愈合过程中作用[1- - - - - -7]。交联水凝胶基于哈仍然是一个有前途的工具,广泛应用(8]。例如,HA-based水凝胶已被用于皮肤和角膜伤口愈合,预防手术后的附着力,作为组织工程的支架和体外三维细胞培养应用程序(9- - - - - -13]。

有许多方法可用于交联HA创建水凝胶支架,包括交联与二乙烯砜或1,较大影响缩水甘油醚,和(甲基)丙烯酸酯photocrosslinking公顷(14- - - - - -17]。然而,这个方法我们都集中在共价交联高度硫醇组HA,然后用二硫键直接链接到另一个1公顷或使用交联分子包含thiol-reactive组,如聚(乙二醇)丙烯酸(PEGda)制成。为组织工程支架,硫醇盐凝胶经常被添加到这个混合,以使细胞附件(9,18- - - - - -21),虽然细胞粘附肽或蛋白质片段也可以使用(22,23]。系统灵活地修改物理和化学性质(生物)改变脚手架的类型和程度的交联,HA的分子量和交联剂,每个组件的浓度。

先前的研究有时基于一个配方,尽管被用于不同的应用,如骨或骨软骨修复和肿瘤工程(19- - - - - -21]。尽管这样一个简单的方法会使生产更容易,不可能是一个放之四海而皆准的制定最适合不同的细胞和/或组织。至此,改变这些水凝胶的合成的影响对整个水凝胶特性和细胞上播种在水凝胶中尚未得到充分的研究。尽管一项研究检查HA-based水凝胶的流变特性只有配方使用的范围不包括那些在前面提到的文章(24]。

这里我们有不同这些HA-based水凝胶来创建一个家庭的组成配方和检查对凝胶时间的影响,酶促降解和压缩模量。我们也播种成纤维细胞和间充质干细胞在水凝胶中确定改变成分对细胞的影响蔓延,细胞数量和代谢活动。我们希望利用这个信息,加上信息从未来的研究在细胞内信号对于给定的细胞类型,为了更加系统优化这些HA-based水凝胶为特定的应用程序。

2。材料和方法

2.1。CMHA-S合成

医疗device-grade公顷(900 kDa;丹麦诺维信生物聚合物,Inc ., Bagsvaerd)溶解在45%氢氧化钠和在室温下搅拌2.5小时。这被放置在异丙醇混合物,氯乙酸溶解在异丙醇反应并允许添加了1小时,然后解决的解决方案30分钟。液体提供了和合成羧甲基公顷(CMHA)溶解在去离子的(DI) H₂o . pH值调整到7.0,CMHA使用切向流过滤净化(TFF)。

3、3′-Dithiobis(丙肼)(DTP);Arke有机物、Fornacette、意大利)添加到纯化CMHA解决方案和pH值调整到4.75。N乙基-N^”——(3-dimethylaminopropyl)碳化二亚胺(EDAC;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)然后添加和pH值维持在4.75直到凝胶形成时,这是允许的总反应4小时。二硫苏糖醇(DTT;金生物科技,圣路易斯,密苏里州)补充说,pH值调整到8.5,搅拌过夜。结果硫醇盐CMHA (CMHA-S)与TFF纯化。CMHA-S冻干,然后储存在−80°C。千瓦(305 kDa)。利用GPC和动态光散射。硫醇修饰的水平(更易与硫醇/毫克CMHA-S)评估使用5、5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic酸)(Ellman试剂;Sigma-Aldrich)。

2.2。Gtn-S合成

Endotoxin-free porcine-derived类型明胶(250 Bloom, Gelita苏城,IA)是溶解在DI H₂O和硫醇盐使用相同的协议对于thiolating CMHA上面描述使用DTP, EDAC,德勤。结果硫醇盐凝胶(Gtn-S)也使用TFF纯化,冻干,储存在−80°C。硫醇修饰是评估使用Ellman试剂和决心Gtn-S更易与硫醇/毫克。

2.3。PEGda合成

挂钩(3350兆瓦;如前所述Sigma-Aldrich)丙烯酸酯(25),除了合成PEGda被透析纯化。Acrylation验证使用¹核磁共振(26]。

2.4。形成水凝胶,凝胶化时间

六水凝胶配方,创建组件的最终浓度为给定的表1。要创建水凝胶,CMHA-S和Gtn-S磷酸盐溶解在一起(PBS, pH值7.4)。在PBS PEGda溶解。一旦溶解,然后PEGda的解决方案是添加到CMHA-S / Gtn-S解决方案和混合轻轻倒置。当细胞被播种在水凝胶中,每一个解决方案是使用0.2过滤消毒μm过滤器之前使用。凝胶时间测定,凝胶体积的1毫升是放置在一个2毫升微型离心机管。管是封顶,每分钟倒一次混合,并检查凝胶。凝胶时间是决定混合的时间将不再与重力流26,27]。六个复制被用于每个配方。

2.5。酶促降解

水凝胶是准备以上,除了CMHA-S / Gtn-S PEGda解决方案是放置在一个5厘米×5厘米×2毫米硅胶模具和允许凝胶为1小时37°C在湿润环境中。磁盘(8毫米直径)穿孔的水凝胶和放置在一个24-well板。水凝胶被安置在PBS为24小时37°C膨胀他们的平衡状态。PBS是然后换成新鲜的PBS或PBS包含5,10,或50 U /毫升透明质酸酶(牛睾丸,Sigma-Aldrich);0.2、0.5或2.0毫克/毫升胶原酶(细菌、Sigma-Aldrich);或5 U /毫升透明质酸酶和胶原酶0.2毫克/毫升。六个复制的每个水凝胶配方与酶浓度。样本期间37°C的孵化实验,直到每个水凝胶已经完全退化或直到814小时实验时停止。在每个计算,酶解了,水凝胶被涂抹去除多余液体,体重,和新鲜的酶解决方案是补充道。时间点是:每10分钟到第一个小时; 3, 5, 8, and 24 hrs; every 24 hrs after that up to 408 hrs; every 72 hrs after that. Hydrogels were deemed to be fully degraded when a single complete piece could no longer be detected in or removed from the solution.

2.6。压缩模量

水凝胶是准备为酶促降解,除了他们准备在35毫米直径聚苯乙烯培养皿。水凝胶测试1小时后2小时内凝胶。英斯特朗3342抗压模量决定使用一个(Instron,诺伍德,MA)在压缩。使用一个定制的主轴符合培养皿的内径,并可以固定在上夹测试装置。材料与十字头时速200压缩μ米/分钟。5每个配方进行测试的样品。抗压模量确定了应力-应变曲线的线性部分。

2.7。细胞播种

人真皮成纤维细胞(HDFs;Lonza Walkersville, MD)保持在低杜尔贝科的修改鹰中补充10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,500 U青霉素,100 mg / L链霉素(DMEM完成)。人类间充质干细胞(msc);Lonza)保持在间充质干细胞生长培养基(MSCGM;Lonza)。细胞在37°C / 5%孵化有限公司₂每周和通道。HDFs被用于实验在章节5 - 10;msc在段落使用3 - 5。细胞被播种在resuspending细胞颗粒的水凝胶filter-sterilized CMHA-S / Gtn-S解决方案。Filter-sterilized PEGda的解决方案是添加,结果cell-polymer悬挂整除成96孔板(50μ信用证)。最后的水凝胶的细胞播种密度细胞/毫升HDFs,除了如下显示,细胞/毫升msc。凝胶后,DMEM完全或MSCGM放置在凝胶适合细胞类型和改变每2 - 3天。

2.8。细胞分析

照片拍摄HDFs的水凝胶在天1和7定性评估细胞的差异在配方中蔓延。两种类型的细胞,DNA凝胶内确定使用CyQuant NF化验设备(表达载体,卡尔斯巴德,CA),和代谢活动决心使用CellTiter96水一个解决方案工具包(Promega,麦迪逊,WI)。六个复制每个每个测定水凝胶配方(除了MTS试验与msc有八个复制)在每个计算(1、4、7、8、14 (HDFs)或15 (msc)天之后播种)进行了分析。凝胶没有细胞被用作背景控件。

水凝胶中细胞数量比较所根据的相对荧光CyQuant化验。此处表示每细胞代谢活动的相对吸光度的MTS试验从CyQuant除以平均相对荧光测定。

为了确定细胞播种密度影响水凝胶内的代谢活动,HDFs的实验是重复使用单一配方(F表1)和播种密度,,,细胞/毫升。

2.9。统计分析

未配对,双尾测试被用来确定统计学意义,、配方和播种密度之间的关系。细胞数量和比较不同配方之间的代谢活动都是在特定的计算。细胞密度的研究,比较了播种在每个计算密度之间和每个播种密度之间的时间点。报道所有值是平均值±标准偏差。

3所示。结果与讨论

3.1。胶凝时间

这里的六水凝胶配方的凝胶时间测试范围从15分钟(参见图26分钟1)。四个配方(A、B、D和F)也有类似的凝胶时间,而E明显更快和C明显慢于他人。的主要影响因素之一凝胶化时间的浓度PEGda,展示了明显的交联配方E比别人快。这是可以预料到的由于浓度的增加可用的丙烯酸酯组与硫醇反应组。有趣的是,C稠化显著低于A或B,尽管同样的硫醇:丙烯比例。这可能是由于浓度的差异CMHA-S与Gtn-S其中三个配方,加上兆瓦的CMHA-S Gtn-S相比的差异。组件的浓度在桌子上1在重量的基础上,提供的MW CMHA-S Gtn-S高出6倍。因此,基于摩尔,CMHA-S和Gtn-S C的浓度是0.04和0.16μ摩尔/毫升,分别在0.03和0.24μ摩尔/毫升尽管保持硫醇:丙烯比例相同,生物聚合物的摩尔浓度的差异可能会导致不同的可访问性硫醇的丙烯酸酯组,从而影响了凝胶化时间。

3.2。酶促降解

所有六个水凝胶配方能够降解的透明质酸酶和/或胶原酶(图2)。他们遵循一个典型的水凝胶的降解(28)中凝胶的重量增加了在初始阶段更多的水进入凝胶,然后下降直到最后凝胶完全退化(数据未显示)。在这项研究中,这些配方显示重要的水解降解(即。,没有酶存在)。两个配方,D和E,不完全降解的研究(814小时)和两个胶原酶的浓度最低。

正如所料,酶浓度的增加导致了减少所需的时间完成水凝胶的降解。在透明质酸酶,降解时间增加PEGda浓度增加,由于增加交联凝胶内,而降解时间随CMHA-S浓度增加而降低。因此,E(最高PEGda)降解最慢和C(最高CMHA-S)在透明质酸酶降解最快。

在胶原酶,降解时间增加PEGda浓度增加,降解时间随着Gtn-S浓度的增加而减少。因此,E(最高PEGda)降解最慢和B(最高Gtn-S加上最低PEGda)在胶原酶降解最快。

与酶的存在,尽管他们在最低浓度,显著协同效应导致更快的退化的所有配方。这对凝胶效果尤其显著C, D, E, F。

3.3。压缩模量

每个配方的抗压模量在图给出3。制定C, Gtn-S CMHA-S浓度和较低的浓度,有抗压模量要明显高于a或b .尽管交联应该是一样的数量由于拥有相同的硫醇:丙烯比,这些结果表明,单个组件的属性会影响整体模量。在一项研究也发现了类似的结果,越来越多的Gtn-S,不改变CMHA-S的数量,并没有改变整个剪切模量的水凝胶24]。换句话说,明胶的存在与否不影响整体性能的水凝胶比CMHA-S的存在。在这种情况下,通过更换一些CMHA-S Gtn-S,抗压模量减少。此外,在这项研究中增加PEGda(比较公式D和E)导致抗压模量的增加,这可能是因为两者的结合增加交联(低硫醇:丙烯比)以及更多PEGda的存在。

3.4。细胞扩散

成纤维细胞种子在水凝胶能够传播。这个传播随着时间的增加,他们传播的程度依赖于配方。图4显示的图像细胞1和7天,在配方A, B,和大肠这些配方代表初始配方,最高的Gtn-S浓度,和最高的PEGda浓度,分别说明了极端的低和高程度的水凝胶中扩散。

Gtn-S水凝胶的浓度增加,成纤维细胞传播更迅速和更大程度,最有可能是因为更多的细胞粘附网站的存在。另一方面,随着PEGda在水凝胶的浓度的增加,成纤维细胞减少传播。增加数量的交联的凝胶,收紧网络形成和细胞可能会使它更难以扩展过程和细胞粘附网站的访问。此外,配方E抗压模量明显大于a或B,这凝胶的物理特性也影响细胞传播,作为种子细胞已被证明在水凝胶(25,29日]。

3.5。HDF增殖和代谢活动

为了评估配方的变化可能会影响细胞的功能的,我们决定细胞数量(相对荧光CyQuant试验)和每个细胞代谢活动(相对吸光度的MTS试验除以相对荧光)。虽然播种在每个配方与相同数量的细胞,已经有变化在细胞数量(请参见图15(一个))。细胞数量的各种配方,一般来说,增加在过去的2周。然而,也有一些配方之间的显著差异。值得注意的是,有一个重要的细胞数量下降每天1和4之间制定大肠召回,这是最高的配方PEGda浓度,导致最低的硫醇:丙烯比,从而最高的交联度和抗压模量最高。也是制定的细胞扩散。最初,到第四天,细胞数量明显高于凝胶B和F,这两个有高浓度的Gtn-S。到了14天,细胞数量的其他公式等于或超过B和f .这些结果表明,交联密度、细胞粘附网站,和压缩模量都可能影响细胞增殖的能力在一个三维水凝胶。

成纤维细胞的代谢活动也明显变化时放入不同的水凝胶配方。如图5 (b),活动每个细胞中不同配方的历史时刻。最高活动每个细胞在凝胶在第一天,但最高的凝胶在第14天F。在凝胶B和F,每个细胞的代谢活动稳步增加了14天。其他配方中,每个细胞活动显著增加,从1到4天,然后从4到7和水平降低(凝胶A、D和E),或者只是从天1到4然后水平增加。这些结果表明,Gtn-S可能如何影响最大的水凝胶中细胞新陈代谢活跃。

我们接下来想确定初始播种密度会影响细胞的代谢活动。为此,我们选择公式F和播种成纤维细胞在四个播种密度:0.4,0.8,1.5,和细胞/毫升。如图6(一)凝胶内细胞数量的增加,以预期的方式基于播种密度。细胞数量继续增加在过去的14天与所有四个播种密度。然而,在第14天,细胞的数量在凝胶播种播种密度最高的两个没有显著的不同。这可能表明存在一个最大数量的细胞凝胶将支持。每个细胞的代谢活动非常类似在所有播种密度在所有时间点(见图6 (b)),这表明播种密度并不影响细胞的代谢活动。

3.6。MSC增殖和代谢活动

我们也想调查制定的影响在不同的细胞类型。我们选择了间充质干细胞作为他们越来越被研究用于组织工程和再生医学应用。见图7(一)再次,细胞数量取决于凝胶配方。然而,不同于HDFs,增加细胞数量不一致的实验2周。事实上,配方C, Gtn-S CMHA-S最高,最低的是唯一的细胞数量明显高于14天比第一天。可能的msc需要更多时间恢复从2 d到3 d环境或任何新的微环境。也有可能这些水凝胶配方不适合支持msc、扩散,例如,一个柔软的材料或提供其他信号可能更合适。还有更多的变化在细胞数量比HDFs msc,反映在较大的标准差。一个可能的解释是,msc没有分布均匀的cell-polymer混合物整除,导致复制与最初不同的细胞密度。这样的不均匀分布可能是由于低得多的播种密度用于msc HDFs相比,或可能是因为强大的信息之间的附着力msc、使他们更难以独立,因此分发的混合物。

每个细胞的代谢活动对msc还在配方(见图之间存在着显著的差异7 (b))。在第一天,最高的活动每个细胞在凝胶被发现和C,最低的两个手机号码。不同于HDFs,每个细胞的代谢活动大幅下降从第一天到第四天的msc配方除了D和E,每个细胞的活动减少,但由于高可变性之间复制不显著。这种低活动每个细胞持续7天,然后稍微增加了14天。这些结果表明,msc可能需要调整他们的新微环境的不同时期HDFs,至少在这些水凝胶。

当细胞,HDFs还是msc,在标准组织培养维护和扩张,细胞是在一个非常僵硬material-polystyrene-and附件表面细胞的一侧(2 d)。本例中的整合蛋白的结扎可能占主导地位的,连接到RGD纤连蛋白(30.,31日)的表面吸附的血清培养基(32]。这些细胞被搬到更柔软材料hydrogel-where他们可以附件形式在许多方面(3 d)和整合蛋白的结扎可能连接到一个RGD凝胶(33,34]。虽然在这两种环境中附件RGD站点,不同的整合蛋白主要是使用不同的蛋白质由于不同周围氨基酸或协同网站(35]。改变从硬软材料,改变从2 d到3 d,和细胞粘附的变化可以导致细胞经历一个适应阶段,他们必须适应新的微环境,导致细胞内信号变化(36]。尽管发现了其他细胞利用为了连接到明胶(37,38)(这是不同于对胶原蛋白我33,34]),并不清楚msc。一组没有发现表达了msc (39另一组发现它表达,但只有20%的细胞(40]。如果它确实是只在低水平表达,这可能占细胞数量的下降通过msc在水凝胶在第一周。剩下的细胞可能做出某种程度的复苏表示自己的纤连蛋白,胚胎干细胞可以(41]。先前的研究已经表明,msc要求结扎对于某些细胞功能(40,42),和损失的时候将他们从2 d细胞培养这些3 d水凝胶可能导致增殖和代谢活性变化观察到这里。

从这些结果,制定可能最好的扩散可能不是最佳代谢活动;制定最好出现在第一天在第14天可能不是最好的。在某种程度上,这可能是由于装修方面。HDFs和msc是可能产生不同数量的基质金属蛋白酶等酶能降解凝胶,从而导致微分改造环境的能力。此外,系统比它最初看起来更复杂。例如,Gtn-S和共价交联到网络空间问题和影响运动的分子通过凝胶,压缩模量、细胞粘附。结扎后一种序列的粘合剂,整合素用于附加到明胶然后开始通过细胞信号级联。然而,细胞也可以感觉材料的刚度在这样的结扎,进而影响细胞的行为。例如,它最近表明integrin-specific交互与ECM加上ECM力学肺上皮细胞的直接行为(协同工作43]。此外,软骨细胞已被证明改变MMP和ECM生产PEG-based水凝胶,这取决于交联度(44]。因此,如果我们改变Gtn-S的浓度,细胞行为的变化可能是由于细胞粘附网站的变化,材料的刚度,能够获得营养物质,或它们的一些组合。虽然我们可能不完全理解所有的交互,如果我们知道增加Gtn-S导致特定细胞类型的早期生存,然而更严厉的水凝胶会更有利之后,那么我们可以修改配方,甚至Gtn-S本身,实现这两个目标。进一步的研究调查两种酶生产改造细胞的水凝胶、以及生产新ECM蛋白质将重要的最终确定最佳配方为特定的细胞类型和特定的应用程序。

4所示。结论

组织工程和再生医学应用程序通常依赖于使用生物材料与细胞。这种生物材料可能提供多种功能,包括支撑结构和信号。因此,生物材料的设计指导细胞功能来实现所需的结果是很重要的。合成细胞外基质可以作为生物材料在这些应用程序中,和我们关注结合修改后的透明质酸(CMHA-S)修改ECM蛋白质(Gtn-S)和合成聚合物(PEGda)共价交联水凝胶。通过改变三个组件,我们可以改变水凝胶的物理方面,如凝胶时间和压缩模量,和生化方面,如酶促降解率和细胞粘附的网站。这些变化导致细胞增殖和代谢活动的变化,也依赖于细胞类型。结合未来的研究在合成ECM重塑和重演的新组织,这些结果可能是有用的生物材料的进一步发展这个家庭为特定的细胞或组织。

承认

这项工作的部分支持由此外资金来自犹他州大学的律师和k·麦金托什。

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