基质力学对心肌细胞的收缩性的影响来自人类多能干细胞

文摘

人类多能干细胞(hPSC)派生心肌细胞具有潜在的应用在药物发现,毒性测试、发展研究、再生医学。这些细胞可以可靠地利用之前,描述它们的功能需要建立本地心肌细胞的相似性。我们跟踪的荧光珠嵌在4.4 - -99.7 kPa聚丙烯酰胺水凝胶在承包新生大鼠心肌细胞和心肌细胞生成hPSCs通过growth-factor-induced定向分化来测量输出在基质力学变化而收缩。收缩应力确定使用牵引力显微镜、免疫细胞化学和形态为特征的α辅肌动蛋白和后续的图像分析。我们发现所有类型的心肌细胞的收缩应力与基体刚度增加。这种效应并不与跳动率或形态。我们证明hPSC-derived心肌细胞收缩适当回应异丙肾上腺素和保持稳定的文化在一个2个月的时期。这项研究表明hPSC-derived心肌细胞有适当的功能反应底物刚度和药品代理,这促使他们使用的进一步应用,如药物评价和心脏治疗。

1。介绍

心血管疾病死亡的主要原因是在美国,导致1 2006年每2.9人死亡[1]。目前的缓解方法是饱受低效率,和心脏移植是有限的可用的数量供心(2,3]。工程心脏组织结构提供了新颖的细胞治疗的承诺选择恢复心脏功能,但因为成人心肌细胞增殖能力有限4),心肌细胞的来源需要这样的应用程序的开发和实现。人类多能干细胞(hPSCs),包括人类胚胎干细胞(为)5)和人类诱导多能干细胞(hiPSCs) [6,7),提供了潜在的产生无限的心肌细胞的组织工程和其他应用程序中,由于他们的无限的自我更新能力和multilineage分化。hPSCs已被证明向心肌细胞分化,最初通过拟胚体的形成(8,9通过定向分化[],最近,10,11]。这些研究利用分子技术评估心肌细胞表型,如检查颞心脏祖标记KDR的表达和PDGFR -α(11]或心脏转录因子Nkx2.5 GATA4和明确的心脏标记物如MLC2a MLC2v,αmhc、MF20α辅肌动蛋白、cTnT cTnI [8,9]。上述明确的标记的免疫细胞化学,是结构性的蛋白质,也通常用来可视化肌节的定义。这些心肌细胞的功能通常是定性评估的自发收缩,可以进一步使用电生理学特征确定亚型(节点、心房或心室)[12]。

应对收缩变化需求功能的另一个关键指标。心脏健康线性增加收缩输出响应通过现象称为血流增加Frank-Starling法(13]。未能表现出这种反应是二尖瓣狭窄的特点和心房纤维性颤动病变表型(14]。虽然相邻细胞之间的交流无疑扮演了一个角色,我们假设使显著心肌细胞可能保持这种功能响应。为了测试这一假说,文化系统,可以允许同步调制的需求收缩和收缩产出的测量是必需的。聚丙烯酰胺水凝胶(PA)是一个被充分研究过的,很容易可调系统研究底物刚度对细胞的影响过程(15,16]。在我们的例子中,增加底物刚度是用来增加收缩需求,提供更强的收缩能力。的荧光珠的预聚物允许光学跟踪位移的水凝胶。通过计算分析,珠位移可以解决到细胞牵引技术称为牵引力显微镜(17]。这种方法已被用于量化鹌鹑的收缩性,老鼠,hESC-derived心肌细胞(18- - - - - -21),但hESC——hiPSC-derived心肌细胞的生理反应基体力学性能的变化尚未被证实。增加我们的理解hPSC-derived心肌细胞的功能性质是一个关键的步骤,使它们的进一步应用,如在体外药物筛选、发展研究和工程心脏组织结构。

我们假设hPSC-derived心肌细胞收缩将会增加产量以应对基体刚度增加。为了验证这一点,我们播种新生儿鼠和hPSC-derived心肌细胞在PA水凝胶的硬度,并使用牵引力显微镜测量他们的收缩应力。然后,我们量化细胞大小和形状识别形态和收缩应力之间的联系。最后,我们研究了hPSC-derived心肌细胞收缩应力的变化由于药物治疗和增加在文化。

2。材料和方法

2.1。hPSC维护

组织培养聚苯乙烯(安全和)6-well板块(康宁)被涂上一层0.1%明胶(σ),和辐照小鼠胚胎成纤维细胞(mef)被播种密度的19500细胞/厘米²MEF介质。MEF介质由DMEM补充10% heat-inactivated MEM不必要的氨基酸的边后卫和1%解决方案(从生活中所有组件技术)。为(H9)和hiPSCs(19-9-11)是通过在每5 - 6天馈线层暴露在1毫克/毫升胶原酶IV型(生命技术)在DMEM / F12(生命技术)3分钟37°C,其次是机械分离和离心5分钟在1000 RPM。hPSCs维持在DMEM / F12培养基补充20%击倒血清代用品(技术),1% MEM不必要的氨基酸溶液,1毫米谷酰胺(技术),0.1毫米β巯基乙醇(σ),和4 ng / mL (H9)或100 ng / mL(19-9-11)人类重组bFGF (WiCell)。至少1段分化之前,hPSCs被播种到8.3μ克/厘米²增长因素都可以降低人工基底膜(BD生物科学)和维护mTeSR1介质(WiCell)。基底膜基质涂层是由resuspending 0.5毫克的基底膜基质6毫升冷DMEM / F12,加入1毫升的每个好6-well板和孵化24小时37°C。hPSCs维护在基底膜基质被暴露于Versene通道每5 - 6天(生命技术)3分钟37°C,其次是机械分离。

2.2。心肌细胞分化的hPSCs通过流式细胞术和表征

−5天,hPSCs被暴露于Accutase分离(生命技术)5分钟37°C生成单个细胞。细胞被播种到8.3μ克/厘米²人工基底膜的密度100000细胞/厘米²mTeSR1中补充了5μy - 27632岩石抑制剂(Stemgent)。细胞被维护在mTeSR1媒介2天。通过天−−3 1天,mTeSR1补充了1μσ,M 6-bromoindirubin-3′肟(生物)。0天,媒介与RPMI交换/ B27没有胰岛素(生命技术)补充100 ng / mL苯丙酸诺龙(研发系统)和1%的基因敲除血清代用品。24小时后,介质交换RPMI / B27没有胰岛素补充5 ng / mL BMP-4(研发系统)。在第五天,媒介交换RPMI / B27没有胰岛素。7天,之后每3天,媒介与RPMI交换/ B27(技术)。

通过流式细胞术描述心肌细胞纯度,细胞被分离成单个细胞暴露于0.25% trypsin-EDTA(生命技术)5分钟在37°C在15天的区别。细胞被固定为1%多聚甲醛(电子显微镜科学)PBS(生命技术)在室温下20分钟。与肌钙蛋白T细胞被染色,心脏同种型Ab-1鼠单克隆抗体(热科学)其次是Alexa萤石488山羊anti-mouse二级抗体(技术)在PBS + 0.1% Triton x - 100(σ)和0.5% BSA(σ)。数据被收集在一个FACSCalibur流式细胞分析仪使用FlowJo (Beckton Dickinson)和分析。

前1 - 2周播种心肌细胞到聚丙烯酰胺水凝胶,心肌细胞被暴露于0.25% trypsin-EDTA分离(生命技术)5分钟37°C,离心机在1000转3分钟,播种到安全和涂有0.6μ克/厘米²纤连蛋白(生命技术)的密度50000细胞/厘米²在EB20媒介。纤连蛋白涂层是由resuspending 36μ6毫升PBS g纤连蛋白,加入1毫升的每个好6-well板和孵化一夜之间在37°C。EB20介质由DMEM / F12培养基补充20%的边后卫(技术),1% MEM不必要的氨基酸溶液,谷酰胺1毫米和0.1毫米β巯基乙醇。第二天,之后每3天,媒介与RPMI / B27交换。

2.3。新生大鼠心肌细胞隔离

基于机构的动物保健和使用委员会批准协议(IACUC)威斯康辛医学院,心肌细胞分离得到1 - 2天的新生儿的雄性sd大鼠中。孤立的老鼠心脏的心室部分切成小块(~ 2毫米的立方体)和消化与单个(15分钟)和重复(10分钟)孵化项目有0.25%胰蛋白酶(技术)和胶原酶IA型(75 - 100 U / mL,σ),分别。我们通常得到~ 100万可行的心肌细胞从一个心。

2.4。聚丙烯酰胺水凝胶基质制备

聚丙烯酰胺(PA)基板的使用方法适应从先前的研究15,22]。股票的解决方案10%的丙烯酰胺(记述有机物)和0.03 - -0.6% bisacrylamide (Fisher)在去离子水被生成并存储在4°C琥珀色的玻璃小瓶。整除聚合之前,每个股票的解决方案被带到房间温度和真空脱气。聚合是由添加5% (w / v)过硫酸铵(APS, Fisher)在去离子水和5% (v / v) N, N, N′, N′, tetramethylethylenediamine (tem、σ)去离子水。2500年μL(预聚物是用移液器吸取到倒盖的玻璃培养皿(Pyrex)和覆盖着它的底部。两面的玻璃培养皿联系了预聚物被涂上一层Rain-X(公司全球品牌),和1毫米PDMS(道康宁)间隔用来控制凝胶厚度。75分钟后,聚合被洪水与50毫米每道菜玫瑰(σ)缓冲区,pH值8.5。在消息灵通的缓冲凝胶被允许膨胀前1 - 3天继续。

圆形凝胶与1.27厘米直径产生的聚合物板用打孔机(McMaster-Carr)。凝胶,然后有两个潜在的命运。对凝胶指定牵引力显微镜,10μL减少适当的预聚物的0.72μ米直径绿色荧光珠在水溶液(费舍尔)被添加到每个凝胶的表面,这下聚合Rain-X-coated玻璃盖玻片(费舍尔)75分钟。聚合被添加50 mM消息灵通的缓冲区,玻璃盖玻片被移除,凝胶是沉浸在消息灵通的缓冲区1 - 3天。这两步聚合固定一个焦平面的珠子改善图像质量(22]。免疫细胞化学凝胶指定立刻沉浸在消息灵通的缓冲区1 - 3天,不进行荧光珠层聚合步骤防止珠bleedthrough到其他荧光通道影响图像质量。

使职能化蛋白质凝胶粘合,25岁μL(1毫米N-sulfosuccinimidyl-6 - (4′-azido-2′-nitrophenylamino] (Sulfo-SANPAH,皮尔斯)消息灵通的缓冲区被干到所有凝胶表面60°C烤箱1.5小时。凝胶被暴露于紫外线(OmniCure)在365海里,90 mW /厘米²为2分钟。Sulfo-SANPAH加法,干燥,紫外线照射步骤重复一次。凝胶被转移到个人井12-well盘子,在PBS水化,暴露于紫外线杀菌20分钟消毒。0.6胶被涂上一层μ克/厘米²纤连蛋白在一夜之间37°C。如果不是第二天,使用凝胶被转移到4°C和存储两天。

2.5。聚丙烯酰胺水凝胶基质特性

每个bisacrylamide浓度制备预聚物如前一节所述,和400年μL(预聚物是用移液器吸取填补dogbone-shaped聚四氟乙烯模具。玻璃珠的直径30 - 50μ米(Polysciences, Inc .)在预聚物洒在测试期间允许光学应变测量,和预聚物与聚对苯二甲酸乙二醇酯透明薄膜覆盖。75分钟的聚合后,模具拆卸,样本存储在消息灵通的缓冲机械前1 - 3天测试允许凝胶达到流体静力学平衡。

在测试之前,额外的玻璃珠直径30 - 50μm是坚持样品的表面。英斯特朗5548微量样品测试在一个机械试验机。样本获得使用球面掌握一个磨料表面两端,防止样品在测试期间的下滑。测试的位移速度是1毫米/分钟,而相关的应变率大约0.0025秒⁻¹。这个速度足够快,蒸发周围PBS的微不足道,但足以降低惯性缓慢和粘性的影响。10 N负荷细胞是用来测量数据加载的速度1 Hz。整个系统被放在一个气动空气表来消除噪声引起的环境振动。

温控环境室是用于测试来匹配在活的有机体内条件尽可能。温度测试期间保持在一个恒定的37°C通过室周围的水套。样品测试和之前也完全水化淹没在PBS的盐度在测试中模拟凝胶通常经验在活的有机体内。修正了账户的浮力的水下部分测试仪器。一个“浮力测试”是每一个真正的测试后进行测量英斯特朗有经验的浮力。这样做是通过简单地删除示例和运行相同的测试没有任何控制之间的紧张关系。

由于样品的兼容特性,光学应变测量技术选择的相对位移小玻璃珠嵌入到材料或表面测量和用于计算应变经验的样本。之前的研究表明,嵌入珠子内样品对样品的测量模量没有影响,只要珠子是足够小,占体积的1%以下,均匀分布在材料(23]。延时显微镜用于观察珠子在指定的位置增量在拉伸试验。通过测量纵向(轴向)之间的距离对珠子在这些增量,菌株在这些时间计算使用粒子追踪与Matlab软件由约翰·c·克罗克宾夕法尼亚大学的教授。

样本的矩形截面测量之前和之后的测试。在测试之前,他们在多个地方使用卡尺测量。测试后,截面削减从颈部区域的样品和测量使用1.25 x光显微镜物镜。两个测试导致了几乎相同的横截面区域,然后用于计算应力数据。每个样品的弹性模量是其应力与应变曲线的斜率。

2.6。聚丙烯酰胺水凝胶上播种心肌细胞

hPSC-derived心肌细胞被暴露于Accumax分离(σ)5分钟37°C,在1000转离心3分钟,resuspended EB20中+ 1% Antibiotic-Antimycotic(生命技术)500细胞/密度μl .新生大鼠心肌细胞离心15分钟在650 RPM和resuspended DMEM + 10%的边后卫+ 1% Antibiotic-Antimycotic 500细胞/密度μl .每个水凝胶用PBS和播种50μL一滴细胞悬液(25000细胞/凝胶;播种密度~ 19700个细胞/厘米²),放置在一个37°C孵化器。45分钟后,每个被淹,1毫升的适当的培养基。

2.7。收缩应力测量和异丙肾上腺素治疗

播种后约24小时,收缩细胞成像获得收缩应力数据。成像在±2天内执行任何计算(例如,“30”表明天28-32分化之间)进行了测量。每个水凝胶成像之前,倒到玻璃底35毫米盘(MatTek)。细胞被维持在37°C被放置在成像加热环连接到一个温度控制器(Fryer)。萎缩细胞成像使用尼康A1R共焦显微镜20 x的目标。双向扫描的速度每秒30帧(fps)是使用线平均8帧来减少噪音,导致捕获速度为3.75 fps。每个细胞成像5秒来捕获至少1收缩周期。

在一些实验中,9μ异丙肾上腺素(σ)给到培养基5分钟开始之前成像。这使得跳动率大大增加,平均只有4帧被要求完全捕获细胞运动,导致捕获速度为7.5 fps。异丙肾上腺素增加成像在30分钟内完成。

量化收缩应力,一帧对应的最大点收缩周期,细胞在其最小(“应变”框架),和一个帧对应的最小点收缩周期,细胞静止的(“零”框架),被确定为每个细胞收缩。这些帧分成透射光和绿色荧光通道和出口使用尼康NIS-Elements软件。LIBTRC 2.4版本软件,由波士顿大学的弥迦书Dembo教授,是用来确定每个细胞的收缩应力。所涉及的计算已经详细描述了在其他地方(17]。短暂,珠位移之间的“紧张”和“零”帧计算并加载到一个模板文件,连同细胞轮廓像素位置数据“应变”框架从ImageJ和数值描述基质力学性能、荧光珠特征和图像属性。细胞内的网格创建轮廓,最有可能收缩向量之间的“紧张”和“零”帧计算和转换为收缩压力。平均产生的收缩应力的绝对值超过区域最大值点的每一个细胞的收缩周期报告(平均收缩应力),计算在LIBTRC由以下方程: 在哪里=收缩应力,=总细胞面积=区域分段与一个特定的收缩应力值。报道最大(max)收缩应力时,这个值的上限范围每个细胞产生的收缩应力的最大值点收缩周期。数据集与< 150珠位移向量被拒绝不足以准确确定收缩应力。

2.8。免疫细胞化学和形态特征

24小时后播种,细胞被固定为16%多聚甲醛(电子显微镜科学),在PBS稀释至4%,在室温下15分钟。细胞被储存在4°C在PBS开始前1周的免疫细胞化学。细胞permeabilized 0.4% Triton-X 100(σ)在PBS室温1小时,然后屏蔽5%脱脂奶粉(Bio-Rad) PBS室温1小时。细胞与小鼠单克隆抗染色α辅肌动蛋白抗体(σ)在PBS 0.4% Triton x - 100一夜之间在4°C。在PBS细胞被洗4次每次15分钟。细胞被沾Alexa萤石555山羊anti-mouse二级抗体(技术)在PBS 0.4% Triton x - 100在室温下1小时。在PBS细胞被洗3次每次15分钟,和核沾染了赫斯特33342(技术)在室温下在PBS 5分钟。成像之前,细胞被倒到一个玻璃盖玻片包含一滴SlowFade黄金不变色试剂(技术)和夹与另一个玻璃盖玻片。图片收集在一个尼康A1R共焦显微镜与20 x或60水浸的目标。

图像处理与CellProfiler软件使用一个定制的管道获取细胞面积和偏心。数据排序基于细胞区,顶部10%和底部10%被排除在外,消除细胞碎片和团。

2.9。统计分析

统计学意义决定使用单向或双向方差分析其次是因果Bonferroni测试或线性回归在适当的地方。比较(*),(* *),(* * *)决定是重要的。所有误差代表SEM。

3所示。结果

3.1。聚丙烯酰胺水凝胶的弹性模生理有关

弹性模量、刚度、聚丙烯酰胺水凝胶的合成是通过拉伸试验确定的。丙烯酰胺的浓度保持不变在10%,和bisacrylamide交联剂的浓度变化从0.03 -0.6%。弹性模量与bisacrylamide浓度不同的线性组合(图范围1)。PA的模水凝胶在这项研究中,使用4.4 kPa 99.7 kPa,生理上模仿心脏组织的整体刚度有关在活的有机体内。新生儿大鼠心脏组织的弹性模量在4.0和11.4之间kPa,和弹性模的成年大鼠心脏组织被发现的范围从11.9到46.2 kPa [20.]。心肌梗死后,组织刚度可以提高三倍由于重塑事件和变化在细胞外基质成分24]。因此,这些PA水凝胶基质包含一系列模代表发展,成熟,和患病的心脏组织。

3.2。定向分化hPSCs收益率纯粹的心肌细胞的数量

向心肌细胞分化hPSCs,我们实现了一个monolayer-based定向分化协议(10,11与一些细微的修改。这个协议文化未分化细胞中含有6-bromoindirubin-3′肟(生物)之前由激活素A和BMP-4诱导分化。图2(一个)表明H9为通过这个协议进行了有效的分化心肌细胞分化,> 90%的人口表达心肌肌钙蛋白T (cTnT) 15天postinduction分化。细胞分化通过这个协议被播种到fibronectin-coated PA水凝胶(图2 (b))。

3.3。心肌细胞的收缩应力随基体刚度

萎缩细胞种子在水凝胶成像用共焦显微镜,允许同时透射光的捕获和绿色荧光通道(图2 (c);补充视频1 - 3(补充材料上可用线http://dx.doi.org/10.1155/2012/508294))。帧对应于最大和最小点的收缩周期被确定。透射光的图像对应的最大收缩点是用来定义感染细胞边界。最大和最小的绿色荧光图像点比较使用LIBTRC牵引力显微镜软件,和珠位移测定细胞收缩的结果。随着输入的数值描述基质力学性能、荧光珠特点,和图像属性(补充表1),这些信息被用来获得一个收缩应力每个收缩细胞(图的地图2 (d))。这张地图显示范围和本地化每个细胞产生的收缩应力产生观察珠运动。当我们提到“最大(max)收缩应力”,这表示收缩的范围的上限压力所产生的每一个细胞。在大多数情况下,为了简化比较不同细胞和基质,收缩应力的绝对值超过平均面积报告每一个细胞,称为“平均(avg)收缩应力。“作为一个例子,收缩产生的应力单元图2 (d)范围从5.10 e + 01 7.25 e + 03 Pa(0.051到7.25 mN /毫米²),其平均收缩应力面积是2.60 e + 03 Pa (2.60 mN /毫米²)。

获得一个基线为心肌细胞收缩性PA水凝胶,我们第一次测量个别新生大鼠心肌细胞的收缩压力。这些细胞的平均收缩应力增加基体刚度,刚度和手段的使用单向方差分析(整体表现出显著差异)(图3(一个))。类似stiffness-dependant剖面观察当比较新生大鼠心肌细胞(图的最大收缩应力3 (b))。接下来,我们测量的收缩应力D30 postdifferentiation(30天)H9 hESC-derived心肌细胞和D30 19-9-11 hiPSC-derived心肌细胞。在这两种类型的人类多能干细胞心肌细胞,与基体刚度平均收缩应力增加,意味着使用单向方差分析有统计学显著差异(H9整体和19-9-11)(图3(一个))。D30 H9——D30 19-9-11-derived心肌细胞生成统计上显著高于平均比老鼠心肌细胞收缩应力的大小99.7 kPa刚度(D30 H9与老鼠和D30 19-9-11和鼠)。我们还比较了最大D30 H9——所产生的收缩应力和D30 19-9-11-derived心肌细胞。Stiffness-dependant概要文件是类似于平均收缩应力和统计上显著差异细胞系观察只有99.7 kPa凝胶(D30 H9与老鼠和D30 H9与D30(图19-9-11)3 (b))。

与基质收缩应力也增加了刚度在推导19-9-11-derived心肌细胞受到修改协议,生物是省略的培养基和基底膜基质添加天−3和0。两个最底物,基底膜基质协议导致更高水平的平均收缩应力相对于生物协议(补充图1 (A))。检查PA文化水凝胶时间的影响,我们测量了新生大鼠心肌细胞的收缩应力在播种后1天、3天。平均收缩应力和刚度增加在时间点和没有明显不同于任何刚度相对于1天3天(补充图1 (B))。

测试是否细胞集群合作行为产生比单个细胞收缩应力,我们镀不完全分离H9-derived PA水凝胶心肌细胞,导致单个细胞的混合物,包含2 - 20约细胞团。我们发现细胞团收缩以协调的方式(补充视频4),表明电耦合,但没有产生收缩应力平均比单个细胞()(补充图2)。

3.4。珠位移和跳动率与底物不增加刚度

接下来我们检查在多大程度上排开的心肌细胞荧光珠嵌在巴勒斯坦权力机构水凝胶,这是一个关键的输入来决定收缩应力。珠位移检测所有刚度在这项研究中,使用平均每单元位移震级从0.2到-0.35不等μm(图3 (c))。这些细胞平均大小代表近场珠子,这是在或接近细胞边界和流离失所的距离大于平均收缩和远场珠子,只有轻微的距离在收缩。细胞系,基体刚度显著影响珠用单向方差分析(整体位移,,老鼠,D30 H9 D30 19-9-11,职责);然而,线性回归显示显著减少趋势珠位移和刚度对老鼠和D30 H9增高无统计学意义D30 19-9-11增加的趋势。

然后我们计算刚度感染细胞的跳动,我们发现衬底刚度没有明显影响跳动率(图3 (d))。意味着打老鼠,D30 H9和D30 19-9-11-derived心肌细胞在不同刚度没有明显使用单向方差分析对每个细胞株(整体,,老鼠,D30 H9 D30 19-9-11,职责)。

3.5。基板刚度影响心肌细胞区域

我们下一个新生儿鼠和hPSC-derived心肌细胞的形态学检查所有的刚度以识别收缩应力之间的相关性和形态。我们用免疫细胞化学染色细胞α辅肌动蛋白,这种蛋白定位和z带连接的一起在观察。我们成像细胞低倍镜下(20 x)来捕获许多细胞在一个框架和量化他们使用CellProfiler软件和高倍镜下形态学(60 x)可视化的肌节结构单个细胞。我们量化细胞面积和偏心或程度的伸长(0 =圆,1 =完全拉长),代表细胞的大小和形状。为D30 19-9-11-derived心肌细胞、基质硬度显著影响细胞区(整体意思通过单向方差分析)。细胞面积最大49.4 kPa PA水凝胶,这代表了一个统计上的显著差异,从区域在18.4和61.6 kPa水凝胶(图4(一))。细胞离心率平均~ 0.6在所有基质硬度和刚度(整体之间没有显著性差异通过单向方差分析)(图4 (b))。定义良好的观察观察所有基质硬度(图4 (c))。类似的观察组织形态和肌节是通过新生儿老鼠,D30 H9-derived,和D60 H9-derived心肌细胞(补充图3、4、5),主要区别是更高的偏心值(~ 0.8)对新生大鼠心肌细胞刚度偏心和新兴的依赖关系对刚度D60 H9-derived心肌细胞。

3.6。hPSC-Derived心肌细胞对异丙肾上腺素能做出适当的回应

心肌细胞功能的另一个关键指标是收缩性应该适当改变以应对药品代理。异丙肾上腺素,β₁肾上腺素能受体激动剂,已被证实能增加跳动的速度和力量的心肌细胞(25,26]。我们给9μM异丙肾上腺素的培养基hPSC-derived心肌细胞在成像之前PA水凝胶。对异丙肾上腺素治疗,平均收缩应力的平均值在任何刚度没有明显变化(整体治疗的效果通过双向方差分析),虽然略高于未经处理的细胞在18.4,49.4和76.0 kPa基质(图5(一个))。殴打率更高的所有基板和异丙肾上腺素治疗(整体影响治疗的效果通过双向方差分析),显著增加的4.4和49.4 kPa基质处理和未经处理的数量(图5 (b))。这些结果证实新生大鼠心肌细胞,增高无统计学意义异丙肾上腺素治疗对收缩应力的影响和产生重大影响跳动率4.4,76.0和99.7 kPa基质(补充图6)。

3.7。随着时间的推移hPSC-Derived心肌细胞的收缩应力保持稳定

已经证明hPSC-derived心肌细胞随时间增加功能成熟度通过离子通道表达和电生理学的指标(27),但文化时间对收缩应力的影响一代是未知的。调查,我们测量H9-derived心肌细胞的收缩应力两天30 (D30)和60天(D60)的区别。在文化不存在显著影响平均或最大收缩应力在这两个时间点通过双向方差分析(整体和整体平均和最大职责。)(数据6(一)和6 (b))。类似的观察是比较D30的平均和最大收缩应力和D60 19-9-11-derived心肌细胞(补充图7 (A)和(B) 7日),没有观察到显著差异在任何整体刚度(随着时间的推移(avg)和整体(max)效应的时间通过双向方差分析)。刚度没有明显影响跳动的D60 H9-derived心肌细胞(整体),但统计上显著的增加跳动率发生在4.4和18.4 kPa D30和D60(图之间的基板6 (c))。类似的观察是在D60 19-9-11-derived心肌细胞,与无意义的刚度对D60跳动速度的影响;然而,显著减少跳动率检测到18.4和49.4 kPa基质与D30 D60(补充图7 (C))。

4所示。讨论

这些结果说明心肌细胞的收缩应力产生hPSCs与基体刚度增加。我们进一步证明跳动率和形态不与这个功能响应。最后,我们证明hPSC-derived心肌细胞对异丙肾上腺素,而收缩应力保持稳定在维护文化。通过展示相似性在本机的功能反应和hPSC-derived心肌细胞基质刚度和异丙肾上腺素治疗,我们希望鼓励使用hPSC-derived心肌细胞在药物发现和再生医学等进一步的应用。

与基质收缩应力的增加刚度由Frank-Starling预测法,即心脏会增加其收缩产量以应对需求增加(13]。虽然这法律属于完整的器官,我们也证明使显著心肌细胞表现出这种功能反应通过增加对基板的收缩应力,增加刚度提供了更强的收缩能力。与基质收缩应力增加刚度的影响一直是以前在大鼠心脏组织层(20.和消化鸡心脏组织28]。相比之下,其他的研究表明,新生大鼠心肌细胞的收缩应力19和心肌细胞收缩的鹌鹑18)达到10 kPa基质,但细胞来源的差异,细胞外基质,测量时间、和/或电刺激这些研究和我们之间可能存在占收缩行为的变化。重要的是,平均收缩应力的大小我们测量最大收缩周期点是与之前的研究结果相一致的主要人类和大鼠心肌细胞。哈森等人报道抽搐人类心肌张力峰值的44±11.7 mN /毫米²同样,56.44.4 mN /毫米²对大鼠心肌29日]。林等人最大的成年大鼠心肌细胞收缩应力测量23.7±8.6 mN /毫米²(30.]。我们证明了平均收缩应力随刚度在播种后1天,3天到PA水凝胶在新生大鼠心肌细胞,但长期收缩性能的个性化细胞不清楚。其他人已经表明,跳动的心肌细胞的百分比在体外底物刚度成反比,随着时间的推移下降硬基质(18,19,31日]。在活的有机体内心肌梗死后心脏组织的纤维化是心脏衰竭的因素(32]。这些迹象表明,心肌细胞培养长次硬基质保持健康的收缩表型会有困难。

比较平均单个细胞的收缩应力和小2 - 20几块未能揭示细胞收缩应力和丛大小之间的关系。我们团的细胞被随机的,通常与多个轴的收缩。地形控制,比如nanogrooved表面,可能会鼓励校准和各向异性收缩心肌细胞聚集的33]。

心肌细胞基质生成类似的区段珠位移,表明细胞能够产生类似水平的应变范围的底物刚度评估在这个研究。观察到的一个因素的变化可以差异珠珠位移分布在表面,导致不同比例的近场和远场珠子在每个数据集。为了更好地控制标记位置,可以微型图象点到水凝胶,而不是嵌入珠子,类似于Balaban等所使用的方法。34]。

在新生鼠,D30 H9——D30 19-9-11-derived心肌细胞,基板刚度没有明显影响打击率。所有细胞类型和刚度,平均打击率之间的变化约20 - 35次/分钟。这远低于80 - 196年的平均人类胚胎心率次/分钟(35休息),平均成人心率的60 - 100次/分钟,并报告殴打的50 - 70次/分钟hPSC-derived拟胚体(9]。电踱步hPSC-derived心肌细胞可以用来获得生理状态跳动率(12]。

我们发现,从所有hPSC行心肌细胞分化,传播面积达到一个中间刚度(49.4 kPa或61.6 kPa)。细胞面积与刚度的增加之前的研究中观察到34 kPa鹌鹑胚胎心肌细胞培养在PA水凝胶为4或24小时(18),这与我们的观察是一致的。在另一项研究新生鼠心肌细胞1-50 kPa PA水凝胶,刚度并不影响细胞的面积固定播种后7天(19]。

有几种常见的心肌细胞形状描述符,包括偏心、循环指数和长宽比,所有这些服务描述细胞的伸长。在活的有机体内新生大鼠心肌细胞有一个细长的形状和一个方面(length-to-width)的比率翻译,偏心值接近1。在体外然而,心肌细胞进行形状变化他们适应2 d文化和离心率降低(36,37]。我们没有观察到的变化与基体刚度偏心老鼠,D30 H9——D30 19-9-11-derived心肌细胞,从而提供另一个表明本研究中使用的所有基板提供了一个环境同样有助于跳动。在D60 H9-derived心肌细胞,与刚度偏心表现出显著增加,但这种形状变化没有明显更大的收缩应力代D30相比。新生大鼠心肌细胞表现出一个刚度偏心度约为0.8,而hPSC-derived心肌细胞具有一个离心率约为0.6。这是符合期望的细胞培养在活的有机体内应该有一个偏心值高于那些种植吗在体外。

刚度定义良好的观察观察,表明程度的肌节组织收缩应力生产没有直接联系。代表图像表明,尽管我们量化的一般趋势细胞大小和形状,细胞形态非常异构整个人口。此外,大多数hPSC-derived心肌细胞拥有多个肌原纤维轴。虽然心肌细胞大小和形状不出现在基质收缩应力直接影响评估在这项研究中,他们可能导致大变化在我们的收缩应力测量。其他人已经表明,细胞形状影响牵引应力分布和大小在NIH 3 t3细胞和平滑肌细胞(38,39]。控制心肌细胞大小和形状,2500年布雷等人使用微触印刷μ米²纤连蛋白岛屿和证明细胞的原生长宽比展方向各向异性(37]。适应类似的纤连蛋白缩微成像方法可以减少变异性的形态学hPSC-derived心肌细胞进而减少收缩应力的变化。

hPSC-derived心肌细胞的潜在应用是心肌细胞识别有毒的药物或影响其收缩性。我们与异丙肾上腺素治疗hPSC-derived心肌细胞,证明这些细胞适当回应这种药物通过增加他们的打击率。显著影响异丙肾上腺素治疗平均收缩应力没有观察到在这个研究。我们测量收缩应力值从两个不同的人群,一个未经处理的和一个异丙肾上腺素治疗。考虑收缩应力测量的异质性,可能需要采取治疗和治疗从相同的人口准确量化测量单个细胞的收缩反应。这可以通过使用灌注系统,药物可以引入媒介在测量没有令人不安的底物的位置和连接细胞。

其他人证明hESC-derived心肌细胞成熟时间110天以上文化,正如他们的超微结构和退出细胞周期40)以及他们的离子通道表达和电生理学27];然而,这些细胞没有达到一个成熟国家成人心肌细胞的特征。我们测量在1和2个月hPSC-derived心肌细胞的收缩应力postdifferentiation (D30和D60),可能对应于成熟的一个中间阶段,发现平均和最大收缩压力保持稳定。分析hPSC-derived心肌细胞形状和跳动速度D30 D60,然而,表明这些细胞的一些性质是动态的时间。随着新指标测量发现hPSC-derived心肌细胞成熟,我们希望链接收缩应力代结构或功能,随着时间的推移发生变化。了解这些细胞的功能反应的发展至关重要,如果我们希望使用它们作为成人心肌细胞的模型系统的行为。

总之,这项研究表明hPSC-derived心肌细胞在硬基质产生更多的收缩应力比软基板。跳动率和形态不直接联系substrate-dependent对收缩性的影响。当使用异丙肾上腺素治疗,hPSC-derived心肌细胞表现出跳动的速度增长。这些细胞保持稳定的基线收缩应力长达2个月的文化。考虑适当的收缩反应,hPSC-derived心肌细胞有潜力成为不可或缺的组成部分工程或心脏组织结构在体外药物研究等应用程序。

确认

这项工作得到了国家卫生研究院的基金资助R01 EB007534 R44机身内部GM087784, NSF资助EFRI 0735903和EFRI 0735551,威斯康星大学麦迪逊分校的研究生院,威斯康辛州商务部,斯坦福大学心血管病研究所。作者要感谢兰斯Rodenkirch高家俊凯克实验室的生物成像实验援助和威斯康星大学麦迪逊分校WiCell hPSC文化研究所试剂和支持。作者要感谢波士顿大学的教授米迦Dembo提供LIBTRC软件收缩应力测量。作者声明竞争的经济利益。InvivoSciences t Wakatsuki是创始人,公司发展文化方法和力测量工具对3 d心脏组织结构。

补充材料

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