父亲的苯并[a]芘暴露调节微rna表达模式在发展中老鼠胚胎

文摘

一直很少关注微rna表达是如何受到环境污染物暴露的影响。我们调查的影响,父亲的暴露于苯并[a]芘(B(一)P)在发展中老鼠胚胎的microrna的表达。雄性老鼠被暴露于B[一]P(150毫克/公斤i.p),和他们的精子四天后使用体外施肥试验。二十个胚胎各2 - 8和胚泡阶段被用于全基因组microrna的表达分析。父亲接触B[一]P影响几个microrna的表达,和目标基因的特异表达microrna浓缩在许多不同的途径可能是相关的发展中老鼠胚胎。通过链接microrna的目标基因公开数据库,我们确定了一些microrna的目标基因,可以作为全球B[一]P-mediated标记基因毒性压力。microrna特异表达可能提供有价值的知识的潜在继代影响亚致死的暴露在化学物质。

1。介绍

精子数量减少,精子质量报告从许多发达经济体1)还有睾丸癌的发生率增加表现在西方和欧洲北部[2,3)、澳大利亚和北美(4]。有人建议,这种消极的发展可以增加接触造成的环境污染。物理以及化学暴露与精子质量的下降相关关联研究[5- - - - - -10]。

化学环境污染物已被证明影响生殖和胚胎发展动物(11- - - - - -15]。在人类中,精子从男性不育展示高水平的DNA损伤与肥沃的男性相比,和精子DNA损伤与精子质量低(16- - - - - -19和生育能力下降20.]。在父亲的可能性被提出的问题在人类生殖细胞DNA损伤,引起环境污染,可能对下一代产生影响。

[一]苯并[a]芘B P是一种致癌污染物与无处不在的分布和潜在reprotoxic效应(21- - - - - -25]。B (a) P是煤焦油中发现,在汽车废气(尤其是柴油发动机),在所有烟造成燃烧的有机物质(包括二手烟),和炭烧食物。这种化合物是化合物形成DNA加合物的能力最好的特征。B (a) P进行代谢转换diol-epoxide, BDPE,人类有机体(26,27]。全球分布和DNA damage-inducing B[一]P的性质使其相关基因毒性模型化合物研究的潜在继代影响父亲的接触。

小分子核糖核酸(microrna),发现于1993年,是短暂的(17-25核苷酸)负调节特定目标基因的非编码rna信使rna降解或转化镇压28]。microrna在多种细胞过程和基本角色还参与多种疾病的发展(审查[29日])。它们的重要性是显而易见的从淘汰赛和突变小鼠的表型和表达谱进行比较研究。代表有前途的治疗目标和候选生物标志物在病理生理学,microrna是一个活跃的研究领域。几项研究表明microrna在早期胚胎发育的控制和维护的多能干细胞状态30.),但环境污染物的影响对microrna的表达研究到目前为止。最近,表观遗传机制,通过它的影响后代的发展得到了更多的关注31日],microrna在表观遗传调控中发挥关键作用。

后的急性暴露于B[一]P受精前的四天,我们研究了全球发展中老鼠胚胎的microrna的表达谱。我们证明全基因组microrna的表达分析研究可以执行在一个非常有限的细胞和早期胚胎转录的多个microrna是影响B P施肥的精子。据我们所知,这是第一个报告胚胎microrna的调制后的环境污染物。

2。方法

2.1。曝光的雄性小鼠精子体外受精派生

接触男性(应变B6D2F1从查尔斯河实验室,8 - 12周的年龄)收到一个ip注入B[一]P(150毫克/公斤体重)溶解在玉米油四天前体外受精实验。时间暴露在B[一]P是基于试验研究和了解精子形成的最敏感的阶段对显性致死突变。同样,年龄控制雄性收到同等体积的玉米油。天的体外受精实验中,男性被颈椎错位。尾手术切除和收集在一个包含M2的埃普多夫管中(500μL,σ)。使用一对microscissors,几个切口是在尾和精子被允许分散10分钟在小滴(250μL)的信托基金中(EmbryoMax微孔)在液体石蜡(MediCult)转移到试管受精前菜。实验是基于36雌性的卵子和精子从6雄性完全暴露(3和3控制)。

2.2。超数排卵,体外受精(IVF)

女性(应变B6D2F1从查尔斯河实验室,4 - 6周的年龄)与怀孕的母马血清激素注射ip gonadotropine (PMSG, Folligon Intervet) (5 IU)三天前体外受精过程。两天后(即。,the day before the IVF) animals received an additional i.p. injection of human chorionic gonadotropine (HCG, Ovitrelle from Serono) (5 IU). Mice were killed by cervical dislocation and oviducts were collected in M2 medium (Sigma). Egg clutches (10–20 oocytes) embedded in cumulus cells were extracted from each oviduct. Oocytes were transferred to IVFdishes and incubated in a droplet of HTF sperm containing medium under liquid paraffin for 4.5 h (37°C). Oocytes from one side of the animal were combined with sperm from B[a]P exposed animals and oocytes from the other side where combined with sperm from control animals. Hence, oocytes from all animals were present in both the control group and the exposed group. After 4.5 h, the fertilized oocytes (zygotes) were washed 5X in KSOM medium (EmbryoMax Millipore) before they were transferred to a drop of KSOM (200 μL)在培养皿中(35毫米)液体石蜡(MediCult)。的受精卵被允许种植都有收获,8芯和胚泡期。在收获,20个胚胎收集超小型电子管满5μL溶解介质(CelluLyser TATAA),然后冻结在−80°C到使用。因此,20个胚胎中包含一个随机选择的样本代表从12种不同的雌性受精的卵母细胞,所有这些已经受精相同的男性。没有技术复制;值是基于一个汇集20生物复制的样本在每个阶段和治疗。

2.3。全基因组microrna的表达分析

胚胎溶解产物受到全球microrna的前置放大使用印度国家银行小RNA扩增设备根据生产的协议(系统生物科学(SBI),山景,CA)。小RNA扩增系统包括三个步骤:(1)结扎的适配器的3′末端RNA,(2)反转录的RNA和附件5′端适配器在同一反应模板切换,和(3)的PCR扩增cDNA PCR聚合酶混合物,其中包括一个校对功能。简要描述的协议:适配器结扎RNase-free水(2步μL),印度国家银行连接酶缓冲(5μL),印度国家银行3′适配器(0.5μL),细胞溶解样品的总RNA (5μL),印度国家银行连接酶鸡尾酒(0.5μL)涨跌互现,孵化(1小时,37°C)。在第一个链合成RNase-free水(4μ引物(0.5 L),印度国家银行3′适配器μ从适配器结扎左)和结扎产品(1μL)涨跌互现,孵化两个步骤(1分钟在65°C后跟5分钟42°C)。逆转录酶一步,mastermix组成的印度国家银行(2 5 x逆转录酶缓冲μL),印度国家银行核苷酸(1混合μ5′适配器(0.5 L),印度国家银行μL),印度国家银行二硫苏糖醇(0.5μL),印度国家银行逆转录酶(0.5μL)与前面的第一链合成混合产品,允许在两个步骤孵化(5分钟42°C,然后10分钟在95°C)。反应被保存在冰到两样东西合成和放大。在第二个链合成和扩增步骤,产品从链cDNA合成的第一步是与RNase-free混合水(77μL),印度国家银行10 x PCR缓冲(10μL),印度国家银行核苷酸(2混合μL),印度国家银行3′适配器底漆(4μL),印度国家银行5′适配器底漆(4μL)和印度国家银行PCR聚合酶(3μL)。反应被转移到一个热循环仪(埃普多夫mastercycler),并进行了以下计划:5分钟在95°C, 42倍(25秒在95°C, 20秒55°C,在72°C) 30秒,30秒72°C,举行15°C。

2.4。实时qPCR反应

microRNA的放大后,全基因组qPCR microRNA的表达谱进行了使用鼠标miRome microRNA qPCR分析器从系统生物科学,同时概要文件所有已知的鼠标microRNA,在应用生物系统公司7500实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。microrna的分析是由qPCR使用microRNA-specific引物和SYBR绿色RT2火箭mastermix(试剂盒,德国)。总之,每个20μL qPCR反应包括SYBR绿色RT2火箭掌握混合缓冲(10μL),印度国家银行普遍反向引物(0.10μ(0.13 L),在全球范围内放大microrna的样本μL),印度国家银行Quantimir microRNA底漆(4μ(5.75 L)和RNase-free水μL)。PCR程序在50°C 2分钟,10分钟在95°C, 40倍(15秒95°C, 1分钟60°C, 35秒在72°C(数据读)),其次是融化曲线分析的步骤。

2.5。数据分析

生值从457年microrna预处理去除离群值和microrna的有测量的不足。的值等于35周期被认为是作为一个检测极限值> 35从下游分析。此外,过滤标准缺失的值设置为80%,现有值的最低比例,和所有的模式与现有不到80%值被移除。只有那些microrna通过质量保证标准包含在下游分析。缺失值常数被平均估算值的特定示例。

原始的值规范化使用microrna表达的意思表达所有的价值正如前面(32,33),平均单个样本计算表达式值microrna值≤35周期。样品的相对表达水平进行了分析比较方法(34,35]。褶皱的变化表明microrna的表达水平的B P[一]暴露样本相对于未经处理的控制样本。microrna的表达水平因此总是相对于未经处理的控制样本。褶皱的变化值是log2-transformed为了使数据对称在零附近。无人监督的层次聚类分析进行集群变量分成组根据他们的相似性,和结果可视化系统树图使用兆电子伏v4.7软件(36]或J-Express v2009 (MolMine,卑尔根,挪威)[37]。miRWalk数据库被用来识别潜在的microrna的目标基因(38]。miRWalk算法是基于一个计算方法,确定了最长的连续microrna和基因序列之间的互补;miRWalk比较确定的基因的microrna的结合位点与八miRNA-target建立预测程序的结果。miRWalk数据库可以提供microrna的目标交互信息由八个不同的microrna建立预测程序。

功能性浓缩miRWalk预测目标基因的分析,我们使用了WebGestalt V2 (39]。WebGestalt V2是一套基于web的基因分析工具,是一套工具功能富集分析在不同的生物环境。WebGestalt多年比较基因与基因在预定义的功能类别列表以确定这些类别和多年丰富的基因。WebGestalt V2充实分析是基于超几何统计测试,业务包括Benjamini和多个测试调整。每个类别设置为最小数量的基因2(默认),和整个老鼠基因组作为参考基因集富集分析。确定了十大最重要的途径值。

3所示。结果

受精卵和胚胎从三个胚胎植入前的阶段(2 - 8和囊胚阶段),受精与控制精子或精子从B[一]P-treated老鼠,被用来研究的暴露在B的影响(一)P面板456鼠标microrna的表达。

共有60在- - - - - -体外受精胚胎(30来自30 B[一]P暴露精子和精子的控制)在三个不同的发展阶段用于最终的分析。我们安排样品提取根据24小时周期,与2 - 8,胚泡时间点指的是24小时,72 h,分别和120 h。可以很容易地确定各阶段的8芯与小心目视检查抽样作为额外的质量标准。样本选择的专门从池中健康的胚胎的特定阶段的代表。众所周知,胚胎细胞周期持续时间受到相当大的变化,不仅在不同的胚胎,而且在胚胎卵裂球在相同的(40- - - - - -42]。

3.1。microrna的表达分析

图1显示了维恩图的microrna表达在不同的阶段。一些数量的差异指出microrna表达在不同阶段控制胚胎,胚胎的B[一]P暴露的父亲;有更多的microrna表达都有暴露组和胚泡期比控制。在为阶段,有更多的microrna表达比暴露组的对照组。维恩图的图1也表明,更多的microrna表达始终在所有阶段的胚胎中B[一]P暴露的父亲相比,控制。

上述质量保证过滤条件的结果是一组102个microrna,和这些microrna是用于下游分析。无人监督的层次聚类分析的这102个microrna执行使用兆电子伏v4.7软件(36),以及由此产生的热图呈现在图2。通过视觉检查的热图,我们观察到,8芯和囊胚胚胎集群相互接近和共享类似的表达模式相比有胚胎(图2)。也有一些主要的microrna——或者下调后的B P暴露在所有三个阶段。从这些microrna特异表达,我们选择了6个microrna的调节部分和6个目标基因表达下调部分频谱的分析(图2)。我们感兴趣的主要是B[一]P-induced效果,因此我们一致选择了——或者下调microrna在所有阶段。六个,六个表达下调microrna选择如表所示1。

然后,我们使用了miRWalk数据库(38),以识别潜在的microrna的目标选择B P microrna特异表达。的交集确定目标基因从至少5预测程序被选中,并为每个选定的microrna的预测目标基因的数量如表所示1。

每个microrna的可以调节众多目标基因,因此有潜力改变多种生化途径。调查途径可能是由我们十二个选定的microrna特异表达,我们评价他们的预测目标基因的生物功能使用WebGestalt V2 [39]。我们将预测目标基因与KEGG(京都基因和基因组百科全书)生化途径(43),以识别丰富通路。富集分析的结果代表了全球的图片路径与目标显著富集的microrna特异表达基因后的B P曝光。

大大丰富了KEGG通路的预测目标基因注释后十二个microrna特异表达的B P曝光展示在表2。大大丰富了通路注解的目标基因的完整补充表1中列出(见补充材料可用http://dx.doi.org/10.1155/2012/407431)。的例子有些大大丰富通路cytokine-cytokine受体相互作用,胰岛素信号通路,调节肌动蛋白细胞骨架、细胞凋亡,与MAPK信号通路;这些表所示2。所确定的路径与目标基因集富集主要六后调节microrna的B P曝光。KEGG通路显著富集目标基因集六个表达下调microrna是参与细胞周期、中的刺激神经组织的互动,及信号通路、钙信号通路和趋化因子信号通路(表2)。一些途径被浓缩在——和目标基因表达下调。

3.2。In-Silico分析预测目标十二个microrna特异表达基因

我们想调查我们的目标基因的表达模式是如何调制在其他报告系统B[一]P-induced基因表达调节进行了研究。为此,我们进行了公开的基因表达数据库搜索,如NCBI基因表达综合(GEO) (44]和ArrayExpress [45]。在这里,我们想从我们的目标识别基因基因列表调制的B(一)P暴露在雄性老鼠在其他系统中,同时看看这些基因的表达模式anticorrelate表达式模式的十二个microrna在我们的研究中特异表达。自mRNA表达从实验中分析数据类似于我们的研究并不可用,我们使用微阵列基因表达数据从Verhofstad和同事46),represensting基因表达分析的研究在小鼠睾丸一个急性B[一]P暴露(13毫克/公斤体重)口服填喂法(46]。在睾丸精子发生发生,比较两种类型的实验之间的基因表达模式可能是有用的。Verhofstad和同事研究了B(一)P exposure-induced基因表达模式的改变在野生型和Xpc-knockout老鼠的睾丸。为了比较我们的目标基因与睾丸基因表达微阵列数据列表,我们下载原始微阵列数据(GEO加入号:GSE17979)存入GEO数据库(44]。这些微阵列数据文件)(gpr-file: GenePix结果重新分析如前所述[47];所有数据处理进行J-Express v2009 [37]。只有微阵列数据从野生型老鼠暴露B[一]P和未经处理的控制被用于再分析。log2-transformed比率的加工强度进一步分析了山姆(意义的微阵列分析)[48]。山姆分析目的是为了识别B基因的表达水平是显著性差异P暴露和未经处理的控制样本。这导致了345个基因确定为显著差异表达(罗斯福< 10%)。然后我们进行我们的目标基因之间的相似性搜索列表和SAM-identified基因列表;这个过程确定了63个基因显示anticorrelated表达式模式给我们提供十二个microrna。这些基因,44个表达下调,19日调节小鼠睾丸B[一]P-exposure。图3显示了分层聚类分析的63个基因。目视检查的热图(图3),我们观察到B[一]P-exposed样本集群相互接近而未经处理的一个分支控制样本集中在其他分支。这些改变基因的基因表达谱构成及其anticorrelated microrna的可以使用为基础的识别B[一]P-exposure基因表达特征。使用两种microrna的结果和mRNA表达配置结合是什么知道microrna函数我们期望的识别anticorrelated miRNA-mRNA双将缩小目标基因列表和改进预测miRNA-mRNA交互。

我们也比我们十二个最特异表达基因miRz microrna的表达数据库(49]。这种比较的结果是补充图1表示。看来,基于miRz数据库的一些十二microrna特异表达,尤其是mir - 210, mir - 294,和大鹏- 466 f - 5 - p是几个组织中高度表达,而另一些(mir - 139 - 3 - p, mir - 197, mir - 1896, mir - 346,和mir - 1906)并没有被发现。

4所示。讨论

从这项工作最重要的发现是,不同的多个microrna表达胚胎的B P[一]相对于控制胚胎暴露的父亲。我们的研究结果还表明,microrna表达可以以很少的细胞。早期的异型生物质的诱导抑制或增强的功能意义单一的microrna的表达谱发展中胚胎不清楚;然而,考虑到广泛的基因转录microrna的目标,可能扰动,在某种程度上,不利于胚胎的发展。

高度动态的生理发展中胚胎是反映在动态的microrna的表达谱。母体遗传来的microrna在鼠标受精卵丰富,但是许多产妇期间迅速表达下调基因产物maternal-zygotic过渡;有些表达下调高达95%[1 -和有之间的阶段50]。microrna的表达水平下降了60%已经报道,表明microrna可能退化类似于孕产妇mrna (51]。合子的rna转录开始有阶段(52,~ 2.2倍增加的microrna的表达已经注意到从2 - 4细胞阶段(51]。在聚类分析(图2),为舞台,囊胚阶段聚集在一起,表明有阶段表现出不同的表达谱的两个阶段。maternal-zygotic过渡可能代表一个特别敏感的胚胎发育阶段。

microrna的预测目标基因被发现在当下研究特异表达的B P[一]接触参与多种生化途径。在丰富KEGG相关代谢通路,癌症、细胞周期、细胞凋亡、MAPK信号cytokine-cytokine受体相互作用,及信号(表2和补充表1),预测基因的影响B[一]P-induced microrna的畸变重叠与以前公布的B(一)磷敏感睾丸基因数据集;结果基因如图3。我们没有任何信息可在胚胎microrna的目标基因的表达在我们当前的研究。睾丸数据集从Verhofstad代表了我们能找到的最接近的匹配在文献中,但目前还不清楚到什么程度的基因表达B[一]P暴露发展中胚胎基因表达与睾丸B[一]P暴露小鼠;我们正在探索这一问题。

也许最有趣的microrna的胚胎发育mmu - mir - 294, mir - 290集群的成员。在小鼠胚胎干细胞(ES) mir - 294已经被证明可以促进多能性通过调节目标基因和原癌基因的一个子集上调pluripotency-associated基因如Lin28 [30.]。据估计,mir - 290集群仅占超过70%的总数量的microrna在ES (53]。表达这个集群迅速下调在分化,同时与细胞周期的延长。mir - 290集群保持很短在ES细胞周期抑制G1 / S限制。类似的抑制G1 / S限制是癌症细胞中观察到54),有趣的是,mir - 106 b促进细胞周期进程在乳腺癌细胞系(55),通过机制类似于,mir - 290集群显示相似之处的分子控制胚胎干细胞和癌细胞的细胞周期56]。在我们的分析中,预测目标基因mmu - mir - 294丰富MAPK-signaling通路相关,细胞凋亡和癌症。最近的一份报告发现,microrna - 290集群中表达更丰富的比滋养外胚层的胚泡内细胞团,作者认为这个不对称的模式stemness-controlling microrna的表达有助于细胞专业化(57]。

发现另一个基因表达下调在发展中胚胎后的B P[一]接触mmu - mir - 210。线粒体代谢在缺氧的控制涉及mir - 210,这是容易和动态受缺氧诱导因子1 (HIF-1α),主调节器的缺氧反应58]。细胞周期调节E2F3 [59),酪氨酸激酶受体配体ephrin A3 (60),DNA修复蛋白RAD52 [61年)都被研究为镇压,mir - 210的目标。iron-sulfur集群组装蛋白质ISCU1 ISCU2被认定为直接目标,mir - 210在人类肺内皮细胞(62年]。除了线粒体代谢,mir - 210也可以参与其他hypoxia-dependent过程如铁的新陈代谢,控制由ISCU1/2活动(63年]。此外,缺氧抑制线粒体功能mir - 210和ISCU1/2理论上可以触发mitophagy-a形式出有缺陷的线粒体自噬的选择性地运送到溶酶体降解。Mitophagy一直认为a-HIF-dependent机制(64年),但它仍然是mir - 210本身是否诱发mitophagy。

表达下调的基因中,最具戏剧性的反应是mmu - mir - 483。异常表达mir - 483据报道在老鼠喂食高脂肪的饮食65年)表明这microrna在能量代谢的作用。符合mir - 483 - 5 - p的识别作为一个intronic microrna在Igf2的第二内含子基因编码(66年),最近的一份报告证实coexpression mir - 483 - 5 - p和胰岛素样生长因子2 (Igf2) [67年]。Igf2主要涉及产前增长的规定(68年),但老鼠携带Igf2转基因也被证明有减少脂肪(69年),并降低Igf2表达式在成人是伴随着增加脂肪沉积(70年]。马和同事在他们的报告中发现,mir - 483 - 5 - p的过度导致减少而不是增加Igf2 mRNA,作者建议,mir - 483 - 5 - p调节Igf2表达式通过抑制Socs3和通过一个额外的未被发现的机制67年]。

发现了另一个microrna的表达下调在胚胎的B P[一]接触父亲的控制相对于胚胎父亲mir - 346。mir - 346已被证明是参与调节致癌作用、炎症反应和分化71年- - - - - -73年]。有趣的是mir - 346也已被证明能够目标receptor-interacting蛋白140 (RIP140) mRNA,从而上调的蛋白表达在不改变mRNA水平(74年]。RIP140是一个调节的转录coregulator许多核受体和转录因子的活动(75年]。的生理功能RIP140已经证明的基因敲除动物模型和基于细胞系的系统;糖酵解,这些包括角色gluoconeogenesis线粒体脂肪酸氧化,生物起源以及调制激素靶基因(76年- - - - - -79年]。mir - 346的表达在胚胎暴露的父亲在目前研究表明减少RIP140 transrepression基因调控。

保守的评价,表达下调microrna在发展中胚胎建议由于固有的这些机制的复杂性。然而,基因和microrna的表达谱的研究在发展中胚胎从暴露的父亲,体现了在这个报告,可以开辟新的途径对我们理解亚致死的继代影响环境暴露。先前的实验观察microrna的表达在胚胎发育阶段集中数以百计的小鼠胚胎(57];我们证明microrna的表达谱可以从很少获得胚胎。这说明潜在的类似的实验方法与达到欧盟指令(注册、评估、授权和限制的化学物质),这意味着化学物质可能对生育的影响与发展测试使用很少的动物。

我们的研究有一些局限性对生物和技术复制。此外,目标基因的mRNA表达分析体外受精胚胎的B P[一]暴露父亲会加强了研究结果。也可能有一些事件的错误预测,确定目标基因。为了减少这些错误的可能性,我们缩小和细化目标基因的列表通过比较公开可用的基因表达数据。

你得作结论,有预见性的暴露在B[一]P可能影响发展中老鼠胚胎的microrna的表达。还需要更多的研究来全面欣赏早期microrna的表达特异表达的影响,但是考虑到广泛的细胞过程microrna的目标,预计不受欢迎的后果。在早期胚胎基因和microrna表达可能提供有价值的知识的潜在继代影响亚致死的接触外源性化合物。

信息披露

作者没有利益上的冲突。

承认

这项工作是由挪威研究委员会,批准号182048 / V40。

补充材料

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