岩石抑制剂治疗y - 27632,增加了Proinvasive SW620细胞三维胶原蛋白的性质1型矩阵

文摘

使用组织密度的概念作为一种机制来诊断肿瘤已经存在了几个世纪。然而,这一概念在实验室中并没有得到充分的探讨。因此,在这篇文章中,我们观察到的细胞密度的影响和细胞外基质(ECM)密度对结肠癌使用SW620细胞入侵和扩散。我们也试图抑制巨石以确定它对细胞入侵和扩散的影响使用标准的分子生物学技术和先进的成像。增加细胞播种密度导致患病率增加细胞入侵以及细胞增殖独立于治疗y - 27632。我增加胶原蛋白支架密度导致细胞增殖增加2.5倍,用y - 27632治疗减毒效果虽然1.5折观察细胞入侵增加抑制岩石样本。有趣的是,岩石也抑制导致细胞入侵增加了3.5倍内三维胶原蛋白支架对细胞播种密度较低。我们展示本文巨石抑制导致增加入侵在三维胶原蛋白我微环境。这些数据表明,尽管岩石抑制剂在临床上已用于治疗一些病症,其效果很大程度上取决于周围的微环境。

1。介绍

结肠癌是第三个最常见的诊断癌症和癌症死亡的第三大原因,男性和女性在美国(1,2]。今天,有一个广泛的方法来诊断癌症包括活检、内窥镜检查和诊断成像。成像技术利用这一事实致瘤的组织有更高的组织密度比周围正常细胞外基质(ECM)。因此,区域的组织密度增加被认为是一个潜在的恶性肿瘤的一个警告信号(3- - - - - -5]。与这个强大的组织密度和癌症之间的联系,没有充分的在体外数据,特别是对结肠癌,完全理解这一现象。

两个变量影响组织细胞力学和ECM密度。改变细胞密度诱导细胞分化,增殖,甚至凋亡[6,7];因此,细胞密度是在癌症研究中相关参数之一。先前的研究已经表明,高细胞密度环境显著增加细胞转移,特别是结肠癌26日(8)和初始播种密度影响干细胞分化的多细胞因子和生长因子(9]。

同样,机械感应通过改变周围的ECM仅影响细胞分化、增殖和凋亡[10,11]。这可以归因于机械信号,影响细胞骨架安排通过Rho-kinase(岩石)。它已被证明在岩石的文学,事实上,负责调节细胞的形态学改变肌动蛋白细胞骨架(12]。同时,激活的岩石促进力代有助于不同的细胞过程,如细胞运动性和附着力13]。岩石的两种亚型,ROCK-1 ROCK-II,已经被证明来表达相似的表型(14尽管他们的细胞定位是不同的(15,16]。调节器,激活或抑制两种亚型的岩石也不同(13,17]。这些差异可能是负责巨石的独特功能和ROCK-II在细胞内。文献表明,块岩石击倒促进角化细胞终端分化,而ROCK-II击倒抑制角化细胞终端分化(18]。cell-permeable, y - 27632是一个高度有效的选择性抑制剂Rho-associated蛋白激酶(19]。

我们曾表明,岩石本地化invadopodia在结肠癌MMP-2调节活动,似乎MMP-13 [20.]。这些实验在1.5毫克/毫升支架进行。然而,肿瘤组织通常有一个刚度符合胶原蛋白浓度远远大于2毫克/毫升(21]。在先前的研究中使用的支架重要的密度,他们不是一样密集的组织可能会发现在一个肿瘤。因此,本研究的目的是为了定义如何组织和细胞密度影响ROCK-1-mediated扩散和入侵。

2。材料和方法

2.1。试剂和物资

所有细胞培养试剂,扣除的边后卫(双子座生物制品),得到从Mediatech, Inc .(弗吉尼亚州赫恩登)。ccl SW620细胞(写明ATCC # - 227)写明ATCC买来(弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞保持餐具的BD猎鹰(林肯公园,NJ)。I型鼠尾胶原蛋白是从BD购买生物科学(贝德福德,MA)。哺乳动物蛋白酶抑制剂鸡尾酒是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。细胞提取物都统一使用从皮尔斯BCA蛋白质分析工具(罗克福德,IL)。核与巨石(sc - 29473)购买从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。消音器核转染II装备从英杰公司购买(尤金,或者)。Rho-kinase活动测量使用Rho-kinase分析工具可以从Cyclex(日本长野,)。观察扩散使用“Vybrant MTT细胞增殖测定工具包”从英杰公司(CA)卡尔斯巴德。CellTracker橙色CMTMR从英杰公司购买(尤金,或者)。比色入侵检测从微孔(Bellerica, MA)购买。所有其它供应分子生物学品位和来自费舍尔(宾夕法尼亚州匹兹堡)。

2.2。细胞培养

SW620细胞培养在贝克汉姆的L-15/10%包含2毫米的边后卫谷酰胺在37°C,孵化有限公司0%₂湿润的环境。

2.3。制备三维支架

建立了三维(3 d)支架使用类型我collagen-based水凝胶。简要9毫克/毫升I型胶原在0.1醋酸中和pH值为7.4与1.0 M氢氧化钠在PBS 10 x最终I型胶原蛋白的浓度1.5或4.0毫克/毫升。预定数量的混合物被放置在井和允许聚合。SW620细胞被镀的播种密度和细胞/厘米²在每一个。凝胶在孵化为1小时37°C。在适当时间额外2毫升的媒体了。

SW620细胞被播种在50和250×10³细胞/厘米²到1.5或4毫克/毫升胶原凝胶和孵化37°C的五天。支架是治疗10μM岩石抑制剂y - 27632每日添加到支架。没有摇滚抑制剂治疗作为控制条件。

2.4。多光子显微镜

Cell-containing胶原蛋白支架培养5天在37°C孵化器(没有有限公司₂)。支架被用磷酸缓冲盐(PBS),固定在一夜之间有10%中性缓冲福尔马林(NBF),然后用Tris-buffered permeabilized盐水Tween-20 0.05% (TBST) 15分钟。在这之后,20分钟的支架被封锁无血清蛋白质块,然后用TBST洗。支架被标以10μM的CellTracker橙色CMTMR染料30分钟,然后用PBS。

种子细胞是由多光子激光扫描共焦显微镜成像40 x目标()。细胞贴上CellTracker染料在541 nm可视化利用多光子激光激发和发射在565 nm, femotsecond的激光束(80 MHz, 0.5兆瓦),从锁模钛泵:蓝宝石激光(媚态鸡尾酒,Spectra-Physics Inc . CA),加上可见激光(英国Bio-Rad)反激光扫描共焦显微镜(日本尼康TE200-U)。

2.5。Boyden室试验

分析了初始细胞入侵使用商用比色检测入侵。插入的试验包括8μ米孔聚碳酸酯膜预镀与胶原蛋白。无血清培养系统插入被浸泡在温暖的媒体为了补充胶原蛋白涂层。接下来,SW620细胞悬浮液被创建并添加到插入为了给50×10的播种密度³或250×10³细胞/厘米²在每个插入。媒体补充添加了10%的边后卫室底部,确保膜充分接触媒体在下院。

井被孵化在37°C 72小时0%的股份有限公司₂湿润的环境。3天之后,媒体被删除和插入包含包含细胞染色膜放置在井。插入的洗水和noninvading细胞被从顶部部分插入用干净的棉签。插入被放置后提取缓冲和提取,一个吸光度阅读是在550海里。有关详细信息,请参阅扩散试验。

2.6。扩散分析

细胞增殖测定使用标准MTT试验装备。为此,媒体被从每个室和凝胶与PBS洗。新鲜的l - 15媒体没有酚红和MTT染色,((3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化),在PBS被添加到每个室5:1的比例。凝胶是在37°C孵化四个小时。四个小时后,从每个室上层清液结合二甲亚砜(DMSO) 1: 2的比例。吸光度是阅读在550海里。

2.7。岩石活动

以达到所需的播种密度,细胞被镀在50×10的密度³细胞/厘米²在6-well盘子和250×10³细胞/厘米²在24-well盘子。细胞治疗10μy - 27632 M,常见的岩石抑制剂和未经处理的条件是用作控制。

使用酶联免疫试剂盒岩石活动进行了分析。简而言之,每个样本在激酶反应缓冲(1:10比)被添加到每个预镀。洗后,每个孵化了一个HRP-conjugated抗体一小时之后,增加了检测的解决方案来检测抗体的存在。双吸光度测量是在450/550 nm使用标准标。

2.8。转染与核

与核SW620细胞转染可拆卸的巨石,untransfected细胞被用作控制的地方。转染后的细胞被播种到胶原蛋白凝胶的浓度的2.0和4.0毫克/毫升和孵化37°C的三天。

2.9。统计数据

使用学生的数据进行了分析t分配使用平均值和标准偏差有关。比较值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。在3 d细胞播种密度的影响特征

胶原蛋白支架准备,SW620细胞被播种在方法部分描述。细胞被染色和phalloidin使用多光子显微镜成像。种子细胞在低细胞密度似乎相对较少的信息交互。在胶原蛋白支架,这些细胞表现出对称轮表型。没有突起或invadopodia一样观察到在之前的实验中使用SW620细胞1.5毫克/毫升支架(20.]。细胞的密度越高,4毫克/毫升,在3 d支架紧密导致迫使细胞间接触。重要的是要注意,细胞出现“圆润”飞机上高于其他细胞。这个图中可以看到1。

3.2。增加细胞密度导致岩石活动的增加

岩石活动与增加细胞密度显著增加。增加2.5倍岩石活动支架与细胞中观察到播种在250×10³细胞/厘米²相比,支架与细胞在50×10播种³细胞/厘米²。重要的是要注意,细胞密度改变通过改变播种面积和保持细胞的数量的常数。这样做是为了确定细胞密度的影响,而不是细胞的数量,对岩石的活动。标准的学生t以及和执行值为0.05时被认为是显著的(*)。数据显示在图2。

3.3。用y - 27632治疗减少入侵Boyden室

细胞入侵增加约2倍样品细胞密度为250×10³细胞/厘米²。然而,应该注意的是,最初的播种条件高细胞密度样本5倍50×10的播种密度低³细胞/厘米²。结果,最重要的是,摇滚与y - 27632抑制减少入侵时在高细胞密度较低的播种密度对入侵影响最小。约1.5倍,降低细胞入侵中观察到样品在250×10播种³细胞/厘米²和对待y - 27632。标准的学生t以及执行,值为0.05时被认为是显著的(*)。数据显示在图3。

3.4。y - 27632增加入侵在胶原凝胶的低密度

样本追踪使用细胞追踪染料。播种密度是影响侵入深度SW620细胞胶原蛋白支架。细胞在250×10播种³细胞/厘米²入侵距离的两倍比播种在50×10³细胞/厘米²未经处理的。然而,并没有观察到这种效应SW620细胞治疗y - 27632。为细胞种子播种密度越低,用y - 27632治疗导致侵入深度增加了3.5倍。然而,没有观察到显著增加细胞在250×10播种³细胞/厘米²。标准的学生t以及和执行值为0.05时被认为是显著的(*)。数据显示在图4。

3.5。增加细胞播种密度增加扩散

细胞密度改变通过改变区域同时保持细胞总数不变。细胞播种密度细胞增殖的影响。增加细胞播种密度从50×10³细胞/厘米²到250×10³细胞/厘米²导致对未经处理的细胞增殖增加2.5倍。对y - 27632细胞治疗,增加细胞播种密度导致1.5增加扩散。预计增加扩散,因为它已被证明在文学细胞增殖增加播种时高细胞密度环境(22]。

在50×10细胞播种³细胞/厘米²,用y - 27632治疗导致细胞增殖增加1.5倍比未经处理的样品。然而,对于细胞在250×10播种³细胞/厘米²、治疗与岩石抑制剂没有出现细胞增殖产生重大影响。这些数据显示在图5。

3.6。块岩石击倒导致增加入侵

SW620细胞转染与核材料和方法来描述。样本追踪使用细胞追踪染料。增加胶原蛋白浓度似乎降低整体入侵,虽然效果微乎其微。胶原蛋白细胞播种到4.0毫克/毫升我凝胶~ 20%少侵入深度比播种到1.5毫克/毫升凝胶两块岩石击倒以及untransfected细胞。1.5和4.0毫克/毫升胶原凝胶,巨石击倒导致增加1.6倍比untransfected细胞侵入深度。标准的学生t以及执行,值为0.05时被认为是显著的(*)。这些数据显示在图6。

3.7。岩石击倒减少入侵密集的凝胶

SW620细胞转染与核部分中描述的方法。胶原蛋白浓度有显著影响扩散untransfected SW620细胞。细胞播种到4毫克/毫升胶原凝胶有扩散值2.5倍比播种到1.5毫克/毫升细胞胶原凝胶。然而,细胞块岩石被撞倒导致增加胶原蛋白浓度增加1.3倍。

之间没有显著差异巨石击倒和ROCK-II击倒对细胞增殖的胶原蛋白浓度(数据没有显示)。然而,岩石击倒了胶原蛋白凝胶的不同浓度不同的影响。块岩石击倒了一个无关紧要的减少在1.5毫克/毫升凝胶的细胞增殖。然而,对于细胞胶原凝胶为4.0毫克/毫升,扩散是由于岩石击倒削减50%。标准的学生t以及和执行值为0.05时被认为是显著的(*)。这些数据显示在图7。

4所示。讨论

癌症仍然是全球死亡率的主要原因诊断结肠癌是第三个最常见的癌症和癌症死亡的第三大原因在男性和女性在美国1,2]。Rho-kinase是癌症的一个重要药理目标因为它的角色在癌细胞的入侵和迁移23,24]。我们以前联系ROCK-II击倒与降低入侵SW620细胞在先前的研究中(20.]。在这项研究中,我们的目标是分析巨石抑制结肠癌细胞入侵的影响。尽管y - 27632目标摇滚亚型,它是一个比ROCK-II巨石的有效抑制剂(19]。

最令人惊讶的,但暴露的数据来自研究不同密度的侵入深度SW620细胞三维胶原蛋白支架。种子细胞密度较低时,岩石由y - 27632抑制导致显著增加入侵。然而,随着细胞密度的增加,这种影响是衰减的。这表明细胞密度在管理中起着重要作用的岩石抑制剂影响pro-invasiveness SW620细胞。

其他研究已经表明,y - 27632治疗导致减少转移,特别是乳腺癌在体外和在活的有机体内(25]。也有人建议由其他人y - 27632的表达减少LIMC和多层陶瓷表明抑制转移26)和减少入侵在脑膜炎模型(27]。与岩石抑制剂治疗,特别是y - 27632,也已被证明能够启动损失的压力纤维和相应减少桩蛋白酪氨酸磷酸化和粘着斑激酶(FAK) [28)从而减少cell-ECM接触。虽然文献表明y - 27632治疗应该减少入侵,入侵我们的3 d数据反驳这种观点。因此,我们进行了更为传统的入侵检测基于boyden室,发现与抑制剂治疗可以减少入侵这些化验。所以,治疗效果差和y - 27632可以播种的微环境条件有关。因为我们以前联系ROCK-II击倒在类似的三维胶原微环境,减少入侵我们假设它是块岩石击倒导致增加入侵3 d胶原蛋白支架。巨石与促进应力纤维形成和促进局部粘连成纤维细胞(29日]。另一项研究表明,块岩石击倒导致降低粘附在角化细胞纤连蛋白(18]。这种失去附着力实际上可能会促进细胞活性从而帮助增加细胞入侵。测试块岩石的作用抑制入侵,我们可拆卸的巨石,用y - 27632治疗SW620细胞支架不同胶原蛋白的浓度,发现巨石击倒导致胶原蛋白浓度增加入侵。三维胶原支架模拟在活的有机体内微环境的结肠组织比Boyden室组装,因为3 d胶原组织密度矩阵有可比性在活的有机体内环境。因此,增加入侵SW620细胞上播种时三维胶原蛋白基质和对待y - 27632表明巨石抑制剂治疗可能事实上是有害的事件的结肠癌在活的有机体内模型。

总之,我们证明巨石抑制的结果在一个三维胶原蛋白增加入侵我的模型。虽然这可能似乎与其他研究的结果,重要的是要理解的意义上的微环境的结果。二维基质细胞附件有少点和方向相比,三维胶原蛋白矩阵。因此,减少局部粘连由于块岩石击倒,可能有不同的影响在这些不同的细胞环境。因此建议在一个在体外就像一个三维胶原蛋白矩阵在活的有机体内模型,用y - 27632治疗可能会进一步增加细胞入侵。然而,进一步的研究需要进行评估的影响巨石在细胞基质附件2 d和3 d环境的影响以及y - 27632的在活的有机体内癌症模型。

资金

美国国立卫生研究院(1 RO1 CA113975-A2)资助。

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