MAP1B与自噬的弗兰克-威廉姆斯域受体Nbr1促进微管网络的联系

文摘

选择性自噬是一个过程,具体的有针对性的货物蛋白质,骨料,或细胞器被隔离到double-membrane-bound phagophores之前与溶酶体融合蛋白质降解。它已经证明了微管网络对自噬小体的形成和运动很重要。Nbr1选择性货物受体,通过其与LC3新兵ubiquitinated自噬降解的蛋白质。这项研究表明进化守恒的弗兰克-威廉姆斯域之间的交互与microtubule-associated Nbr1 MAP1B蛋白质。在自噬诱导,MAP1B本地化与Nbr1集中到离散的囊泡。这个colocalisation是依赖于一个完整的微管解聚的网络诺考达唑治疗废除starvation-induced MAP1B招聘这些囊泡。MAP1B不招募自噬小体对蛋白质降解溶酶体堵塞的酸化不会导致MAP1B蛋白水平明显提高。然而,蛋白质磷酸化MAP1B水平显著增加堵塞后自噬降解。这是第一个证据表明泛素受体Nbr1链接,这架航天飞机ubiquitinated蛋白质被自噬降解,微管网络。

1。介绍

细胞受损的周转率和错误折叠的蛋白质是由两个主要降解途径;macroautophagy(以下称为自噬)和泛素蛋白酶体系统(UPS)。UPS目标可溶性,胞质蛋白的蛋白酶体降解。针对降解蛋白质的共价修饰小,高度保守的,无所不在地表达蛋白质泛素。泛素可以形成连锁7个赖氨酸残基,通常情况下,四个或更多的泛素分子链所需的目标蛋白质的蛋白酶体(1]。然而,错误折叠蛋白可以形成大骨料呈现它们抵抗蛋白酶体降解[2]。自噬是一种进化保守的分解过程,提供大型polyubiquitinated蛋白质总量和整个细胞器的溶酶体降解3]。一块在这个过程中会导致ubiquitinated蛋白质总量的积累,最终细胞死亡(4]。

自噬需要35的协调行动到目前为止autophagy-related基因(ATG)调解的双层膜界自噬小体的形成包含一部分细胞质和交付到溶酶体5,6]。有两个ubiquitin-like接合autophagosomal形成所需的系统。Atg12-Atg5-Atg16L复杂对伸长的隔离膜很重要7]虽然Atg8 / LC3共价连接到磷脂酰乙醇胺(PE)对自噬体至关重要生源论(8]。LC3通常是用作自噬小体的标志和已被证明绑定和稳定微管(9,10]。autophagosomal形成的微管网络是很重要的(11,12];然而,它要求自噬体与溶酶体的融合仍不清楚(11- - - - - -13]。角色不同的微管的数量也已提出,不稳定微管专门招募标记隔离膜,如Atg5 Atg12, LC3 autophagosomal而形成稳定的微管网站促进成熟的自噬小体的运动(14]。

最近的证据表明,自噬可以是一个选择性的过程,即单一的蛋白质和细胞结构,如聚合和细胞器可以专门针对自噬体(15,16),但货物识别的分子机制了解甚少。最近描述了自噬受体蛋白质p62和NBR1包括结构相似,以及TBK1适配器NDP52 [17- - - - - -19]。这些受体被认为结合polyubiquitinated蛋白质通过C-terminal-ubiquitin-associated(非洲联合银行/ UBZ)域和排序与LC3 autophagosomal形成通过他们的网站互动(20.,21]。与泛素NBR1和p62 colocalise马洛里身体在酒精性脂肪肝患者的肝脏18)和积累与泛素在肌肉纤维零星的包涵体肌炎(22]。p62相比,NBR1没有被广泛研究,然而越来越多的证据表明与它在各种不同的生物功能。NBR1与巨人sarcomeric蛋白肌和部分信号复杂,调节肌肉基因表达(23]。转基因小鼠模型表达一种c端截断Nbr1确定一个角色在骨重建而Nbr1 T-cell-specific淘汰赛的全长Nbr1牵连Nbr1作为中介的t细胞分化和过敏性炎症24,25]。NBR1最近也被证明的直接自噬降解mid-body衍生品,独立于p62 [26]。此外,NBR1抑制受体酪氨酸激酶(RTK)捕获降解细胞表面的受体(27与SPRED2),通过互动,调节激活受体和衰减的溶酶体降解纤维母细胞生长因子(FGF)信号(28]。识别的其他蛋白质NBR1扶少团团员,如钙,integrin-binding蛋白质(CIB)和自发性收缩和伸长zeta-1 (FEZ1) [29日NBR1]建议额外角色的心脏功能障碍(30.)和神经发展,分别31日]。已经表明,NBR1和p62招募autophagosomal形成网站LC3的独立;然而,机制尚不清楚32]。

在本文中,我们确定NBR1 microtubule-associated蛋白MAP1B作为一个互动的伙伴。通过进化守恒的弗兰克-威廉姆斯域这发生。我们表明,虽然MAP1B不是本身autophagosomal蛋白质降解的基质,MAP1B的磷酸化形式被溶酶体抑制稳定。我们建议这种交互提供了一种机制,通过这种机制NBR1是针对微管网络通过自噬小体促进蛋白质的降解。

2。材料和方法

2.1。生物信息学

BioEdit用于牧师序列和编译比对。爆炸是用于各种数据库来识别FW-like序列从动物、植物、真菌、原生生物、细菌、和metagenome序列。Phyre用于结构预测。

2.2。主要抗体和构造

免疫印迹分析和免疫荧光抗体使用如下:多克隆anti-myc(阿,Santa Cruz)单克隆anti-HA(罗氏)单克隆anti-myc (9 e10, Santa Cruz),和多克隆anti-MAP1B-HC(请提供Gordon-Weeks教授,伦敦国王学院(33,34),多克隆anti-MAP1B(圣克鲁斯N19)多克隆anti-MAP1B(甜,Santa Cruz),多克隆anti-pThr1265-MAP1B(罗福斯生物制品),单克隆anti-Nbr1 (Abcam)单克隆anti-p62 (Abnova)和多克隆anti-p62(请提供Gautel教授,伦敦国王学院),多克隆anti-ULK1(σ),多克隆anti-ubiquitin (Dako)多克隆anti-EEA1(细胞信号),多克隆抗β肌动蛋白(Abcam)和单克隆anti-His (Novagen)。

酵母二者混合Nbr1诱饵是放大了PCR克隆到pGBKT7 (Nbr1 aa346 - 498) (Clontech)。全长Nbr1克隆成pHM6(罗氏)和MAP1B aa2216 - 2464被克隆到pcDNA3.1(表达载体)coimmunoprecipitation化验。Nbr1 aa346 - 498被克隆到pGEX2T(通用电气医疗集团)GST-binding化验和MAP1B aa2227 - 2464被克隆到PET6H pET11d-Novagen(修改版)的重组绑定化验。

2.3。Yeast-2-Hybrid

酵母菌株Y187与Nbr1诱饵构造改造和交配pretransformed(酵母菌株AH109)鼠标新生儿颅顶的cDNA文库请由教授Ikramuddin Aukhil,佛罗里达大学。导致殖民地被HIS3记者基因活性筛选,山肩和插入排序的三倍。Y187转换与pGBKT7 Nbr1 aa346 - 498与酵母菌株交配AH109表达图书馆MAP1B克隆pGADT7 MAP1B aa2238 - 2465和镀到SD媒介缺乏亮氨酸,色氨酸、组氨酸和腺嘌呤和培养在30°C验证交互。

2.4。Coimmunoprecipitation

COS7细胞cotransfected HA-Nbr1和MAP1B-myc 48小时后,细胞溶解在IP缓冲区(50毫米三pH值7.5,150毫米氯化钠,NP-40 0.5%,补充与蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏)),和细胞溶解产物孵化与兔多克隆抗体anti-myc一夜之间在4°C。蛋白质一个珠子(微孔)被添加到溶解产物2小时,珠被洗了三次在IP缓冲区。蛋白质保留的珠子被sds - page分离和转移到一个硝基膜后的标准程序。墨迹与鼠单克隆anti-myc探测和鼠单克隆抗体anti-HA随后二级抗体(HRP-conjugated anti-mouse或anti-rat Dako, Abcam)。检测是由发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团)。

2.5。细菌表达的融合蛋白

Nbr1 aa346 - 498融合销售税和销售税仅表达在Bl21 (DE3)细菌细胞和蛋白质纯化的谷胱甘肽亲和色谱法(如前所述)(35]。MAP1B aa2227 - 2464融合His6也表示在Bl21 (DE3)细菌细胞和纯化的尿素。简单地说,细菌细胞表达₆-MAP1B aa2227 - 2464细胞溶解在缓冲(100毫米不溶解₂阿宝₄10毫米三pH值8 6 M尿素,5毫米咪唑pH值,补充了EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏))。样品用,离心机,上层的孵化与镍琼脂糖6快流珠(Amersham生物科学)2小时在4°C。珠子被洗在咪唑洗脱缓冲(100毫米不低₂阿宝₄10毫米三pH值8 6 M尿素,20毫米咪唑pH值,补充了EDTA免费的蛋白酶抑制剂(罗氏))和绑定蛋白的筛选了珠子使用高咪唑洗脱缓冲(100毫米不₂阿宝₄10毫米三pH值8 6 M尿素,250毫米咪唑pH值,补充与EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏))。结果纯化His-tagged蛋白分离成50毫米三pH值7.5,150毫米氯化钠和消费税拉试验中使用。

2.6。销售税拉化验

COS7细胞转染MAP1B-myc构造和48小时后表达,细胞溶解在IP缓冲区(如上所述),溶解产物孵化与珠子加上GST-Nbr1 aa346 - 498或销售税仅2小时在4°C。孵化后,珠子在IP洗水洗三次缓冲区(50毫米三pH值7.5,200毫米氯化钠,NP-40 0.5%,补充与蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏))和蛋白质保留的珠子被西方墨点法分析如上所述,使用单克隆抗体anti-myc 9 e10。或者纯化销售税或GST-Nbr1 aa346 - 498与谷胱甘肽琼脂糖珠(σ)是在孵化IP缓冲区(50毫米三pH值7.5,150毫米氯化钠,NP-40 0.5%,补充与蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏))与净化₆-MAP1B aa2227在4°C - 2464 2小时。孵化后,珠子在IP洗水洗三次缓冲区(50毫米三pH值7.5,200毫米氯化钠,NP-40 0.5%),和蛋白质保留珠子被sds - page分离和免疫印迹分析如上所述,使用anti-His标记单克隆抗体。

2.7。细胞培养、治疗、转染和疣状

COS7细胞在DMEM培养/ 10% FCS通过标准协议和转染使用Fugene 6(罗氏)。在200年晚些时候细胞细胞溶解48小时μL IP缓冲下拉和coimmunoprecipitation化验。疣状的盖玻片上培养的PC12细胞在DMEM / 10% FCS, DMSO溶液处理或Bafilomycin A1(σ)4或8小时,或饥饿Hanks-Balanced盐溶液(σ)4小时或处理5μg / mL诺考达唑(σ)30分钟之前或之后2小时饥饿和固定在4%多聚甲醛/ PBS 10分钟。细胞被permeabilised 0.1% Triton X100 / PBS和孵化与中小学抗体(Dako)连续一个小时每个安装之前。细胞成像使用蔡司LSM 510年顺序扫描共焦显微镜模式Plan-Apochromat 63 x / 1.4石油DIC的目标。量化MAP1B / Nbr1 colocalisation使用蔡司ZEN2010软件,执行数据代表的意思22 SEM图像。

3所示。结果

3.1。的预测结构和演化Nbr1 FW域

我们使用BLAST-based搜索获得NBR1-related从多个可用的基因组和转录组序列来源广泛的真核生物。这些标识明显的区域保护105个氨基酸(残留374 - 478人类NBR1)认可的单一NBR1 orthologue发现在大多数真核生物,但从p62缺席。这部小说域已经被命名为NBR1域(36和弗兰克-威廉姆斯域由联合国Johansen的组37四个非常保守的色氨酸残基后,为了清晰起见,这里,我们将使用弗雷德里克命名法。

单一NBR1 orthologues被发现在所有的动物,大多数植物、真菌(虽然明显不是酿酒酵母)和某些单细胞真核生物(如盘基网柄菌discoideum)。在每种情况下NBR1-like分子有氨基端PB1域,一个(动物、植物)或更多(真菌)ZZ域,弗兰克-威廉姆斯域和域(图c端非洲联合银行1)。

弗兰克-威廉姆斯域还发现,否则无关的动物蛋白。随着人类版本已经被命名为c6ORF106,我们将使用这个名字。单一c6ORF106 orthologues被发现在所有的动物研究,加上单细胞后生动物姐妹团队鞭虫。在任何其他生物没有c6ORF106 orthologues被发现。的蛋白质往往是小(人类c6ORF106长298氨基酸),包括一个普遍的守恒的氨基端α螺旋形域~ 70 - 80个氨基酸,然后弗兰克-威廉姆斯域最后结构不合理和可变长度(图c端区域1)。

有趣的是,弗兰克-威廉姆斯也在广泛的领域真细菌。的eubacterial FW-containing蛋白质域结构明显不同,唯一的共同主题是弗兰克-威廉姆斯的领域往往是非常接近糖基。尽管大多数eubacterial基因组不编码一个弗兰克-威廉姆斯domain-containing蛋白质,我们发现它是广泛分布在eubacterial演化支(γ变形菌门,chloroflexi、放线菌和几个不保密的基因组)。在一些细菌的蛋白质(Halorhodospira halophila, Methylomonas methanica, Kribbella flavida, Variovorax脉,和一个从淡水环境metagenome),弗兰克-威廉姆斯域出现强劲立即c端预测helix-turn-helix XRE家族的dna图案。我们称这些XRE-FW蛋白质。XRE域一般出现独自或者与multimerisation域(如枯草芽孢杆菌孢子形成抑制因子和生物膜的形成,SinR和噬菌体阻遏蛋白CI和Cro)。这种并列提出了弗兰克-威廉姆斯域可能调解homo和/或heterodimerisation或可以绑定一个小信号分子。其他一些eubacterial FW蛋白质完全由两个串联弗兰克-威廉姆斯域,(例如,从Coprococcus),而其他人则含有跨膜域(例如,从链霉菌属sp)。这个结构的多样性表明,弗兰克-威廉姆斯域一般有用的功能,已在许多方面。

我们使用Phyre分别预测所有弗兰克-威廉姆斯的二级结构域。这有力预测alignable结构特点在每一个序列,不管序列散度(图2)。因此我们认为我们可以有信心地说,弗兰克-威廉姆斯域包含两组三人β链被更多的可变长度的非结构化的中部地区。引人注目的序列功能包括四个几乎不变的色氨酸残基,躺在中间的链β2,之间的链接β2,β3、中间线β5和β6。这些给域的名字,只是很少被其他芳香取代残留。也有一些不变的甘氨酸和势函数在一些非结构化的连接器。可以想象,两个三股的域折叠成一个三明治β表与色氨酸投射到疏水核心。

系统发育分析显示,所有NBR1 FW域聚集在一起,做所有c6ORF106 FW域。两个额外的序列从宏基因组资源集群NBR1序列;其中一个有一个c端非洲联合银行领域,我们假设这些都是真核物种在环境metagenome来源。细菌弗兰克-威廉姆斯的重复单元聚类域(排除真核NBR1和c6ORF106序列)反对多个eukaryote-to-prokaryote水平基因转移事件,表明弗雷德里克域可能是古代,比真核和eubacterial域之间的分裂。

3.2。弗兰克-威廉姆斯域的识别Nbr1 Microtubule-Associated蛋白质MAP1B作为一个互动的伙伴

识别小说蛋白质扶少团团员的高度保守的弗兰克-威廉姆斯Nbr1域,因此阐明一个函数,我们执行一个yeast-2-hybrid屏幕的弗兰克-威廉姆斯域Nbr1作为诱饵。一个新生儿颅顶的cDNA文库筛选和microtubule-associated的轻链蛋白1 b (MAP1B-LC1)被确认为一个交互Nbr1伙伴。这种交互验证了导演酵母使变回原形2台混合动力试验的孤立的猎物向量编码偏MAP1B-LC1序列(aa2238 - 2465)到酵母菌株AH109和交配与酵母菌株Y187表达的弗兰克-威廉姆斯Nbr1域(图3(一个))。MAP1B作为单一的mRNA转录,翻译成多肽,随后裂解产生重链(2214 aa)和一个轻链(250 aa) (38]。重链(MAP1B HC)和轻链(MAP1B-LC1)可以绑定到微管(39,40和彼此41]。MAP1B已经涉及到自噬的规定,因为它与LC3和目标自噬小体在神经退化(轴突码头42]。

3.3。Nbr1与MAP1B-LC1发现在复杂在活的有机体内

以确定是否与MAP1B-LC1 Nbr1形式复杂在活的有机体内,我们执行一个coimmunoprecipitation实验暂时使用COS7细胞转染HA-Nbr1和MAP1B-LC1-myc结构。使用一个anti-myc MAP1B-LC1-myc抗体进行免疫沉淀反应,我们发现HA-Nbr1与MAP1B-LC1-myc coimmunoprecipitate(图3 (b))确认他们发现在一个复杂的在活的有机体内。我们无法显示coimmunoprecipitation内生Nbr1和MAP1B-LC1 PC12细胞。这可能是由于相互作用蛋白的水平低于检测水平可能通过免疫印迹分析可用的抗体(数据未显示)。

3.4。Nbr1与MAP1B-LC1在体外

yeast-2-hybrid数据表明,弗兰克-威廉姆斯Nbr1域与MAP1B-LC1直接交互。更严格的测试这一假说,我们执行销售税拉化验使用提取物COS7细胞overexpressing MAP1B-LC1-myc和弗兰克-威廉姆斯的GST融合领域Nbr1和销售税。事实上,弗兰克-威廉姆斯Nbr1域与MAP1B-LC1同时销售税独自没有(图4(一))。

验证弗兰克-威廉姆斯Nbr1域之间的交互和MAP1B-LC1在胞外环境中,他的₆-MAP1B-LC1纯化和孵化的GST融合FW Nbr1域或独自销售税。这表明,弗兰克-威廉姆斯Nbr1直接与轻链相互作用领域MAP1B(图4 (b))。

3.5。MAP1B不是由自噬降解

它曾被观察到MAP1B-HC不是由自噬降解[42]然而,它还没有报道是否MAP1B-LC1也是如此。建立如果Nbr1和MAP1B-LC1之间的交互的功能是通过自噬促进MAP1B-LC1的退化,MAP1B-LC1蛋白质含量分析条件下,自噬蛋白降解受阻。PC12细胞,神经细胞内源性MAP1B的表达水平升高,治疗与Bafilomycin A1或DMSO蛋白质提取前8小时被发现SDS PAGE和解决使用抗体识别p62, Nbr1 MAP1B-LC1 MAP1B-HC和β肌动蛋白。堵塞后自噬蛋白质周转的水平p62 Nbr1分别增加了60%和130%,分别证明自噬蛋白降解被Bafilomycin A1治疗(数字5(一个)和5 (b))。MAP1B-HC, MAP1B-LC1蛋白质含量增加可以忽略不计的堵塞自噬蛋白降解暗示他们不是由自噬降解,Nbr1-MAP1B-LC1交互的功能并不是目标MAP1B-LC1自噬蛋白质周转。令人惊讶的是,尽管总MAP1B水平在很大程度上影响通过阻断自噬蛋白降解,phospho-pThr1265-MAP1B水平提高后Bafilomycin A1治疗(图5 (c))。这种磷酸化的MAP1B形式表达在神经元分化和是一个主要的基质糖原合酶kinase-3beta (GSK-3beta)和被认为是参与调节微管动力学MAP1B [43]。

3.6。Nbr1 Colocalises MAP1B诱导的自噬

接下来,我们分析了内生的亚细胞定位Nbr1 MAP1B共焦显微镜。建立如果Nbr1 MAP1B colocalise在活的有机体内PC12细胞治疗和DMSO, Bafilomycin A1阻断自噬蛋白降解或饥饿诱导自噬,免疫荧光分析。基础的条件下,当Nbr1水平很低,几乎没有colocalisation Nbr1和MAP1B之间(图6(A))。在堵塞autolysosomal蛋白质降解Bafilomycin A1治疗,Nbr1不再是由自噬和积累(图6(B)),但总MAP1B,排除在Nbr1-positive囊泡的影响。这证实MAP1B不是本身autolysosomal退化的途径。在饥饿和诱导自噬,Nbr1 MAP1B colocalise(图明显的细胞核周围的空泡状结构6(C))。虽然这并不是发生在所有的细胞,只有在饥饿条件下MAP1B - / Nbr1-positive囊泡。在饥饿条件下MAP1B / Nbr1积极点状的结构观察、量化colocalisation显示曼德的colocalisation系数%。这些MAP1B——/ Nbr1-positive囊泡与自噬蛋白colocalise p62(图6(D)),但一些colocalise泛素,表明这些囊泡不aggresomes或成熟的自噬小体含有ubiquitinated货物(图6(F))。我们发现小重叠分布与ULK1 Nbr1 / MAP1B囊泡在饥饿条件下,与之前相比分析Nbr1 / ULK1 colocalisation在这些条件下(32)(图6(E))或与早期endosomal EEA1标志(图6(G))。这表明在诱导自噬,Nbr1招募与p62 colocalising MAP1B积极的结构,说明这可能是早期autophagosomal形成自噬体,但下游站点。

确定colocalisation Nbr1和MAP1B回应starvation-induced自噬是依赖于一个完整的微管网络,PC12细胞治疗与解聚剂诺考达唑在饥饿条件下,colocalisation检查。证实了微管网络的解聚α微管蛋白染色(数据未显示),导致损失的点状的colocalisation MAP1B和Nbr1但完整的囊泡是Nbr1保留(图6(H))。这表明MAP1B不是必不可少的Nbr1-positive囊泡的形成,而是一个完整的微管网络是必不可少的colocalisation Nbr1和MAP1B饥饿条件下。

4所示。讨论

Nbr1的弗兰克-威廉姆斯域是高度保守的整个真核王国,也存在于许多细菌蛋白。它包含两个内部重复~ 55的残留物,预测二级结构组成的两个,三个β链表。这个地区的高保护及其在p62缺席(37)表明,它有一个函数,从p62截然不同。因此我们执行yeast-2-hybrid屏幕的弗兰克-威廉姆斯域Nbr1为了确定一个特定的函数。MAP1B的轻链(MAP1B-LC1)被确认为一个交互的FW域。Nbr1此前被认定为一个自噬受体通过与目标ubiquitinated蛋白质降解LC3 [18,19),它是合理的假设的功能之间的交互Nbr1 MAP1B-LC1是促进自噬MAP1B-LC1退化。分析后的蛋白质水平自噬堵塞证明MAP1B-LC1增加了一个微不足道的水平表明它不是由自噬(图退化5)。堵塞autophagosomal蛋白质降解也会导致减少营业额的UPS (44]因此,MAP1B-LC1是退化的UPS (45),这可能表明Bafilomycin A1治疗结果的抑制蛋白酶通过MAP1B-LC1降解而不是自噬。有趣的是,我们观察到抑制自噬降解导致增加phospho-Thr1265 MAP1B,也许也反映在小总MAP1B水平增加。表达这种磷酸化的MAP1B形式区分神经元空间管制,并负责磷酸化的激酶在这个网站已被确认为糖原合成酶激酶3β。GSK-3β抑制与Bif-1-dependent自噬诱导血清饥饿下调节细胞生存(46]。

生化分析进一步证实Nbr1 MAP1B-LC1直接和之间的交互,这些蛋白质可以被发现在一个复杂的在一起体内。Nbr1和微管网络已经被确认为便利的蛋白质降解的关键球员通过自噬(11,12,18,19),这可能表明Nbr1-MAP1B-LC1交互对这个过程很重要。MAP1B与LC3交互,通过这个互动提出了自噬小体是针对轴突码头在神经退化(47]。此外MAP1B预测与Atg12和Atg3表明除了LC3, MAP1B对目标很重要autophagosomal机械网站的其他组件autophagosomal形成(48]。本文提供的交互数据的colocalisation Nbr1和MAP1B细胞核周围的囊泡与MAP1B表明,通过互动,Nbr1是针对微管网络,从而提供一种机制,通过这种机制可以针对自噬小体蛋白质。MAP1B - / Nbr1-positive囊泡不但是colocalise泛素,表明这些囊泡还没有装满ubiquitinated货物。或者,他们可能是囊泡含有其他nonubiquitinated蛋白质针对退化。虽然目前没有已知的蛋白质所针对自噬Nbr1 ubiquitin-independent的方式,可以针对自噬降解STAT5A-ΔE18 PB1域p62独立的泛素(49]。这表明Nbr1类似的机制也可以代理的目标蛋白质的泛素降解独立。Nbr1 / MAP1B囊泡不colocalise EEA1,表明这些不是早期核内体。同样,我们看到很大程度上没有colocalisation MAP1B / Nbr1 ULK1囊泡,这表明MAP1B——Nbr1-positive结构不出现在网站autophagosomal形成但也许代表了早期的自噬小体,是阳性p62 nonubiquitinated蛋白质货物。

这是第一个证据表明Nbr1微管网络,也演示了一个不同的函数FW Nbr1领域。类似的机制曾被证实,HDAC6能够与polyubiquitinated蛋白质总量和动力蛋白汽车从而耦合聚合的微管网络,他们可以运输到站点autophagosomal形成(50]。此外,适配器蛋白质如FYCO可以LC3和微管马达蛋白相互作用,有人建议,通过这些交互preautophagosomal autophagosomal形成的膜有针对性的网站(51]。角色MAP1S (MAP1B同系物)在线粒体自噬降解也被证实。MAP1S与目标LC3 LC3和这种交互功能,微管网络。基因消融MAP1S原因有缺陷的线粒体和严重缺陷的积累营养应激反应表明缺陷autophagosomal生物起源和间隙52]。有人建议招聘autophagosomal货物受体Nbr1和p62 autophagosomal形成网站可能是这种类型的受体的一般特性,但它是独立于Atg因素下游pi3激酶复杂(32]。本研究进一步强调了角色定位的微管相关蛋白自噬小体机械微管网络和补充这里给出的工作表明microtubule-associated蛋白质和自噬受体之间的联系。

弗兰克-威廉姆斯的高度进化的保护域内Nbr1同系物牵连到它在Nbr1功能有重要作用。弗兰克-威廉姆斯的预测二级结构域,由两三个β链表形成一个紧凑的“三明治”也出现在cholesterol-binding蛋白质尼曼C2 (NPC2) [53,54]建议额外角色弗兰克-威廉姆斯域的脂质绑定。

总之,我们现在第一个证据表明自噬Nbr1受体蛋白和微管网络通过直接互动与MAP1B Nbr1 evolutionary-conserved FW域的。Nbr1是一种广泛表达蛋白,已经涉及到几种疾病(18,22,23),因此将有重大价值的评估组织的生理研究中这种交互。

确认

作者要感谢教授Gordon-Weeks(伦敦国王学院)教授有用的讨论和多克隆抗体MAP1B Ikramuddin Aukhil,(佛罗里达大学)酵母二者混合颅顶的cDNA图书馆。k Marchbank BBSRC博士奖学金支持,支持美国水域威康信托基金会r·g·罗伯茨是由肌肉萎缩症,和c·a·怀特豪斯支持英国关节炎研究奖学金。

引用

1. j . s .喷射器l·霍夫曼m . Rechsteiner和c m . Pickart“polyubiquitin蛋白水解的识别信号,”EMBO杂志,19卷,不。1,第102 - 94页,2000。视图:谷歌学术搜索
2. Weinhofer, s . Forss-Petter m .Žigman和j·伯杰,“受到多麸醯胺酸聚合形成抑制蛋白酶体降解蛋白质,”人类分子遗传学,11卷,不。22日,第2700 - 2689页,2002年。视图:谷歌学术搜索
3. t . Yoshimori“自噬:监管大部分细胞内降解过程,”生物化学和生物物理研究通信,卷313,不。2、453 - 458年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. j·s·卡鲁,e·c·梅迪纳j . a .丘韦et al .,“自噬抑制细胞凋亡增强vorinostat-induced通过ubiquitinated蛋白质积累,”细胞和分子医学杂志》上,14卷,不。10日,2448 - 2459年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. z杨和d . j . Klionsky”活活吞噬:macroautophagy史”,自然细胞生物学,12卷,不。9日,第822 - 814页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. n .水岛t Yoshimori, y Ohsumi”Atg自噬体形成蛋白质的作用,”细胞和发育生物学的年度审查,27卷,不。1,第132 - 107页,2011。视图:谷歌学术搜索
7. 水岛,a .山本m波多野et al .,“解剖使用apg5-deficient老鼠胚胎干细胞自噬体形成的,“细胞生物学杂志,卷152,不。4、657 - 667年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. h . Weidberg e . Shvets t . Shpilka f .仑诉Shinder和z Elazar”Lc3和gate-16 / gabarap亚科还都是至关重要的操作方式在自噬体生物起源,”EMBO杂志卷,29号11日,第1802 - 1792页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. e . m .针板、t·s·维伦纽夫和d·l·布朗”Map1a相关轻链3增加微管稳定通过抑制微管动力学,”分子和细胞神经科学第41卷。。1,第93 - 85页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 曼和j·a . Hammarback”轻链的分子表征3。微管绑定亚基的map1a, map1b。”生物化学杂志,卷269,不。15日,第11497 - 11492页,1994年。视图:谷歌学术搜索
11. e·法斯e . Shvets Degani, k . Hirschberg z Elazar,“微管支持生产starvation-induced自噬小体而不是他们的目标和与溶酶体融合,“生物化学杂志,卷281,不。47岁,36303 - 36316年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. r . Kochl x w·胡e . y . w . Chan和s . a . Tooze“微管促进自噬小体和核内体自噬小体的形成和融合,“交通,7卷,不。2、129 - 145年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. r·谢阮,w . l . McKeehan和l .刘“乙酰化微管所需的自噬体与溶酶体融合,“BMC细胞生物学卷。11日,货号。89,897年,页2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. c . Geeraert a . Ratier s . g .费et al .,“Starvation-induced hyperacetylation自噬的刺激所需的微管蛋白是营养不足,“生物化学杂志,卷285,不。31日,第24194 - 24184页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. m .小松,黑川纪章h, s . Waguri et al .,“压力反应的选择性自噬衬底p62激活转录因子nrf2通过keap1的失活,”自然细胞生物学,12卷,不。3、213 - 223年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. t·约翰森和t . Lamark选择性自噬由自噬适配器蛋白质,”自噬,7卷,不。3、279 - 296年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. t·l·瑟斯顿g . Ryzhakov s .布卢尔n·冯·Muhlinen和f . Randow”tbk1适配器和自噬受体ndp52限制ubiquitin-coated细菌的增殖,”自然免疫学,10卷,不。11日,第1221 - 1215页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 诉Kirkin, t . Lamark y s苏et al .,”一个角色在autophagosomal nbr1 ubiquitinated基质的降解,”分子细胞,33卷,不。4、505 - 516年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 美国水域,k . Marchbank e·所罗门c·怀特豪斯和m . Gautel”交互和lc3 polyubiquitin链链接nbr1自噬蛋白质周转,”2月的信,卷583,不。12日,第1852 - 1846页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. s . Pankiv t·h·克劳森t Lamark et al .,“P62 / sqstm1直接绑定到atg8 / lc3促进ubiquitinated蛋白质总量的自噬降解,”生物化学杂志,卷282,不。33岁,24131 - 24145年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. m . l . Seibenhener j . r .先生,t . Geetha h . c . Wong n r·克里希纳和m . w . Wooten”Sequestosome 1 / p62 polyubiquitin链结合蛋白参与泛素蛋白酶体降解,”分子和细胞生物学,24卷,不。18日,第8068 - 8055页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. c . et al .,达“NBR1异常,小说autophagy-associated蛋白质、肌肉纤维的零星的包涵体肌炎,“Acta Neuropathologica,卷122,不。5,627 - 636年,2011页。视图:谷歌学术搜索
23. 兰格,f, a Yakovenko et al .,“细胞生物学:肌小节的激酶结构域控制肌肉基因表达和蛋白质周转,”科学,卷308,不。5728年,第1603 - 1599页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. c·a·怀特豪斯美国水域,k . Marchbank et al .,“邻居brca1基因(nbr1)函数的负调节产后成骨细胞的骨形成和p38 mapk活动,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷107,不。29日,第12918 - 12913页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. j .问:杨m . t . Diaz-Meco h . Liu, j . Moscat Nbr1是一个新的pb1信号适配器th2细胞分化和过敏性气道炎症在活的有机体内”,EMBO杂志卷,29号19日,3421 - 3433年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. t·c·郭et al .,”中体积累通过逃税的自噬有助于细胞重新编程和致瘤性,”自然细胞生物学,13卷,不。10日,1214 - 1223年,2011页。视图:谷歌学术搜索
27. f . k . Mardakheh et al .,“Nbr1小说ligand-mediated受体酪氨酸激酶的抑制剂退化,“分子和细胞生物学,30卷,不。24日,第5685 - 5672页,2010年。视图:谷歌学术搜索
28. f . k . Mardakheh m . Yekezare l . m . Machesky和j·k·希斯,“Spred2交互与已故endosomal nbr1下调的蛋白质纤维母细胞生长因子受体信号,”细胞生物学杂志,卷187,不。2、265 - 277年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. c·怀特豪斯,j·钱伯斯,k .豪m . Cobourne·夏普和e·所罗门”Nbr1与束状和伸长蛋白质zeta-1 (fez1)和钙和整合素结合蛋白(cib)和显示在神经管发育限制的表情,“欧洲生物化学杂志,卷269,不。2、538 - 545年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. j . Heineke m . Auger-Messier r . n .雷尔et al .,“Cib1病理性心肌肥大的监管机构,”自然医学,16卷,不。8,872 - 879年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. 山崎裕荣n, n, k Kitaichi et al .,”老鼠缺乏schizophrenia-associated蛋白质fez1清单多动症和增强的响应性精神刺激剂,”人类分子遗传学,17卷,不。20日,第3203 - 3191页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. 大肠Itakura和n .水岛”P62目标自噬体形成的网站需要self-oligomerization但不是lc3绑定,”细胞生物学杂志,卷192,不。1,17-27,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. s . r . Tymanskyj t . m .尺度,p . r . Gordon-Weeks”MAP1B增强微管装配率和发展中神经元,轴突延伸率”摩尔细胞>卷,49号2、110 - 119年,2011页。视图:谷歌学术搜索
34. m·约翰斯通r·g·古尔德。费舍尔,p . r . Gordon-Weeks,”神经丝抗体rt97承认监管发展的磷酸化microtubule-associated蛋白质1 b抗原决定基,”解剖学杂志,卷191,不。2、229 - 244年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. 兰格,d·奥尔巴赫p·迈克劳林et al .,”亚细胞定位的代谢酶在心肌肌可能由dral / fhl-2,”《细胞科学,卷115,不。24日,第4936 - 4925页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. c .卡夫m .彼得,和k·霍夫曼,“选择性自噬:ubiquitin-mediated识别和超越,”自然细胞生物学,12卷,不。9日,第841 - 836页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. 美国斯文et al .,“植物NBR1选择性自噬衬底和哺乳动物自噬的功能混合适配器NBR1和p62 / SQSTM1”自噬,7卷,不。9日,第1010 - 993页,2011年。视图:谷歌学术搜索
38. m . Togel r . Eichinger g . Wiche, f . Propst”45个氨基酸残基域充分必要map1b多元蛋白质前体蛋白水解乳沟,”2月的信,卷451,不。1、15—18,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. j . a . Hammarback r . a . Obar s·m·休斯和r·b·法兰”Map1b作为多元蛋白编码处理,形成一个复杂的氨基端microtubule-binding域,“神经元,7卷,不。1,第139 - 129页,1991。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. r . Noiges r . Eichinger w . Kutschera et al .,“Microtubule-associated蛋白1 (map1a)和map1b:光链确定不同的功能性质,“神经科学杂志》上,22卷,不。6,2106 - 2114年,2002页。视图:谷歌学术搜索
41. m . Togel g . Wiche, f . Propst”小说特点microtubule-associated的轻链蛋白map1b:微管稳定,自我互动、肌动蛋白丝绑定,重链和监管,”细胞生物学杂志,卷143,不。3、695 - 707年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. 问:j . Wang y叮,s . Kohtz et al .,“诱导自噬在轴突萎缩和退化。”神经科学杂志》上,26卷,不。31日,第8068 - 8057页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. n . Trivedi·马什r·g·古尔德a . Wood-Kaczmar和p . r . Gordon-Weeks糖原合成酶激酶3β磷酸化的map1b ser1260 thr1265空间局限于日益增长的轴突,”《细胞科学,卷118,不。5,993 - 1005年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. l·乔和j·张”,抑制溶酶体功能降低蛋白酶体活动,“神经学字母,卷456,不。1、15 - 19,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. e·艾伦,j .丁w·王et al .,“Gigaxonin-controlled退化map1b轻链对神经元的生存至关重要,”自然,卷438,不。7065年,第228 - 224页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. j .杨y高桥,Gsk-3大肠程et al。。β由调制bif-1-dependent自噬促进细胞存活和细胞死亡,”《细胞科学,卷123,不。6,861 - 870年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. 问:j . Wang y叮,s . Kohtz et al .,“诱导自噬在轴突萎缩和退化。”神经科学杂志》上,26卷,不。31日,第8068 - 8057页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. c . Behrends m·e·索s p . Gygi和j·w·哈珀“人类自噬系统的网络组织,”自然,卷466,不。7302年,第76 - 68页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. y渡边和m .田中P62 / sqstm1自噬non-ubiquitylated衬底的间隙,“《细胞科学,卷124,不。16,2692 - 2701年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. y川口,j·j·科瓦奇,a . McLaurin j·m·万斯a .伊藤和t . p .姚明,“脱乙酰酶的hdac6调节aggresome形成和细胞生存能力以应对错误折叠蛋白质的压力,”细胞,卷115,不。6,727 - 738年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. s . Pankiv e·a·而minelik a Brech et al .,“Fyco1 rab7效应,结合lc3 pi3p调节微管+结束,导演囊泡运输、”细胞生物学杂志,卷188,不。2、253 - 269年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. r·谢阮,k . McKeehan w . l . McKeehan f . Wang和l .刘”Microtubule-associated蛋白1 (map1s)桥梁与微管和线粒体自噬组件影响autophagosomal生物转化和降解,”生物化学杂志,卷286,不。12日,第10377 - 10367页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. d . c . Ko, j . Binkley a . Sidow m·p·斯科特,“cholesterol-binding口袋里的完整性在尼曼c2蛋白溶酶体控制胆固醇水平是必要的,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷100,不。5,2518 - 2525年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. n . Friedland h·l . Liou p•a . m .股票,“cholesterol-binding蛋白质的结构缺乏尼曼C2疾病,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷100,不。5,2512 - 2517年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2012凯蒂Marchbank et al。这是一个开放的访问分布在条知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。