抗增殖因素变化的磷酸化和棕榈酰化Cytoskeleton-Associated含有调节核易位和DNA结合

文摘

Cytoskeleton-associated蛋白4 (CKAP4)是一种可逆palmitoylated和磷酸化跨膜蛋白功能作为抗增殖因子的高亲和性受体(APF)——sialoglycopeptide膀胱上皮细胞分泌的间质性膀胱炎患者(IC)。DHHC2棕榈酰化的CKAP4棕榈酰酰基转移酶,其细胞表面需要本地化和随后的APF信号转导;然而,CKAP4 APF信号转导机制是未知的。在本文中,我们证明了APF治疗诱发丝氨酸的磷酸化残留S3,肌力,S19 CKAP4 CKAP4和核易位。此外,我们表明,CKAP4结合gDNA phosphorylation-dependent方式针对APF治疗,而且phosphomimicking,既定的nonpalmitoylated CKAP4本地化的细胞核,DNA结合,模仿APF对细胞增殖的抑制作用。这些结果揭示了小说角色CKAP4作为APF的下游区信号转导。

1。介绍

Cytoskeleton-associated蛋白4 (CKAP4;ERGIC也称为climp - 63 - 63,和p63)是63 kDa,可逆palmitoylated和磷酸化,II型跨膜(TM)蛋白,最初认定为居民的内质网和高尔基体中间复杂(ERGIC) [1- - - - - -5]。第一个报告描述CKAP4 [1](称它为“p62”)表明,它的棕榈酰化在有丝分裂期间达到顶峰,建议棕榈酰化可能是一个重要的监管机构之间的膜泡运输各种膜隔间。不久之后,施魏策尔和他的同事们克隆CKAP4和确定membrane-proximal半胱氨酸100 (C100)作为棕榈酰化的网站4]。最近,DHHC2被确定为棕榈酰酰基转移酶(PAT) palmitoylates CKAP4 C100 [6]。

CKAP4局部突出的内质网(ER)。CKAP4主要功能之一是锚的ER微管,组织ER的整体结构对微管网络(3- - - - - -5,7,8]。CKAP4绑定的微管是由三个关键的磷酸化丝氨酸残基(S3、肌力和S19)位于胞质,n端结构域(图1)[2]。CKAP4是独特的微管结合蛋白之间至少在一个方面:这是一个TM蛋白质。然而,它类似于许多其他microtubule-binding蛋白质磷酸化块绑定微管的能力(9]。超表达的变异版本CKAP4模仿三丝氨酸残基磷酸化(S3E、S17E S19E)内的微管结合域导致重组或“崩溃”的ER原子核周围没有任何显著影响微管网络。类似影响ER结构发生当一个删除CKAP4缺乏同样的丝氨酸残基的突变细胞中过表达。相反,过度的长篇,phosphorylation-incompetent (S3A、S17A S19A)突变的CKAP4与和能够包微管与野生型相似CKAP4 [7]。

图1

CKAP4域 l l l l l l 3 。CKAP4是63 kDa,寡聚,II型,单次的TM域palmitoylated和磷酸化蛋白。腔的/细胞外域包含一个两性α螺旋区域(506 - kvqeqvhtllsqdqaqaarlppqdfldrlssldnlkasvsqveadlkmlrtavdslvaysvkietnennlesakgllddlrndldrlfvkvekihekv - 602)重要寡聚化和亮氨酸拉链(468 -ASTVRSGETQLVYGDVEEKRSVGEPSTVES-504)。在一起,这些地区是同源bZIP dna结合域的转录因子。细胞质,n端包含TM的半胱氨酸残基邻域在100位置是palmitoylated(修改重要的交易从ER PM),和三个丝氨酸残基(S3,肌力,S19)所需phosphorylation-dependent CKAP4绑定到微管细胞骨架。两个地区在细胞质n端所需的绑定和绑定微管,从而维护ER和细胞骨架之间的连接(]。还有一个PQ蛋白质相互作用域(49 - phpqqhpqqhpqnq - 63)和一个假定的glycine-rich核定位信号序列(65 - gkgghrgggggggk - 79)。

CKAP4也表达了在等离子体膜(PM)。棕榈酰化的DHHC2 CKAP4的需要表达在细胞表面(6),它的功能作为抗增殖因子的高亲和性受体(APF) [10]。APF是亲脂性的,nine-residue sialoglycopeptide的氨基酸序列与假定的TM 6日域卷曲的8 [11]。APF存在于间质性膀胱炎患者的尿液(IC),一种慢性的、痛苦的膀胱疾病知之甚少的病因(12]。让细胞APF在体外显著改变基因表达和街区正常膀胱上皮细胞的增殖和癌症细胞系包括膀胱(T24)和宫颈腺癌(海拉),模仿的关键方面IC患者膀胱上皮的病理6,11,13,14]。的集成电路₅₀扩散化验的合成和纯化APF ~ 1 nM [14,15),这表明APF的亲和力CKAP4很高。

以前,我们观察到核增加大量的CKAP4在海拉细胞暴露在APF [6]。重要的是,这种APF-induced CKAP4本地化的变化被DHHC2依赖棕榈酰化。并发CKAP4核数量的增加,一些基因的表达水平,(即。,vimentin, zonula occludens-1, and E-cadherin) changed significantly in HeLa and normal bladder epithelial cells following APF exposure [6,10,13,16]。这些基因和其他13显示有显著改变表达式从IC患者和膀胱组织已知参与核扩散的规定,细胞粘附、肿瘤发生[17- - - - - -19]。CKAP4细胞核和并发的再分配的基因表达的变化表明,APF诱发特定棕榈酰化的变化和/或磷酸化CKAP4的状态,而且这些变化影响其细胞内的亚细胞分布和功能。因此,我们生成CKAP4突变体模仿本构depalmitoylation和各种状态的丝氨酸磷酸化来确定它们对CKAP4的亚细胞分布的影响对APF的回应。

我们的结果表明,APF增加CKAP4丝氨酸磷酸化,磷酸化的残留S3,肌力,和S19所需核易位;此外,phosphomimicking,既定的nonpalmitoylated CKAP4本地化的细胞核,DNA结合,模仿APF对细胞增殖的抑制作用。这些结果揭示了小说角色CKAP4 APF-dependent信号从质膜细胞核,表明CKAP4规范直接绑定到DNA的转录。

2。实验程序

2.1。DNA结构

向量构造包含野生型CKAP4 (WT CKAP4)融合在坐标系的n端版本5和6 xhis表位标记在哺乳动物表达载体pcDNA3.1V5His6-TOPO(表达载体,卡尔斯巴德,CA)是由使用CKAP4-specific PCR引物,从海拉细胞互补。一种palmitoylation-incompetent CKAP4 (CKAP4C100S)是由定点诱变的野生型向量构造(Stratagene拉霍亚,CA)改变半胱氨酸在100 -丝氨酸的位置。一系列CKAP4突变体,模仿depalmitoylation和/或本构和磷酸化脱磷酸化由定点诱变WT CKAP4或者CKAP4C100S向量的结构如表所示1。互补脱氧核糖核酸编码的细胞外领域CKAP4 (c端残留126 - 501)是由PCR和克隆在坐标系His6抗原决定基的标签pRSET-B(表达载体)5′末端。所有结构的准确性被DNA测序验证。

2.2。细胞培养和转染

海拉(写明ATCC # CCL-2;美式文化收藏、马纳萨斯,弗吉尼亚州)细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素和1μ从表达载体g / mL二性霉素b(所有)。使用FuGENE6细胞转染试剂(瑞士巴塞尔罗氏公司)根据制造商的指示。

2.3。免疫细胞化学

海拉细胞表达WT CKAP4或模仿depalmitoylation CKAP4突变体和/或本构去磷酸化,磷酸化(见表1)被播种密度2×10⁴细胞/在8-well LabTek室幻灯片(Nalge Nunc,罗彻斯特,纽约)和种植semiconfluence DMEM培养基中含10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,1μ克/毫升二性霉素b和0.4毫克/毫升G418从英杰公司(所有)。细胞3%多聚甲醛固定20分钟磷酸盐(PBS) permeabilized PBS 0.1% Triton x - 100,并封锁了PBS / 5%正常山羊血清(门店)。以下主要使用抗体:鼠标马伯G1/296反对CKAP4(“反- climp - 63”,稀释1:100年,亚历克西斯生化药剂,圣地亚哥,CA),兔子帕布对微管蛋白(Abcam稀释1:100年,剑桥,MA),兔子对fibrillarin帕布(稀释1:100年,Abcam)和异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠标马伯对V5抗原决定基(稀释1:500年,英杰公司)。二次抗体FITC-labeled山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse(稀释1:1000年,英杰公司)和四甲基异硫氰酸罗丹明- (TRITC)标记山羊anti-mouse(稀释1:1000年,杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林,PA)。幻灯片是安装在SlowFade不变色试剂(表达载体)和成像使用尼康TE2000显微镜数字化或莱卡SP5II共焦。

2.4。核和核仁蛋白隔离

一夜之间,海拉细胞被serum-starved然后处理20纳米合成APF(肽国际)24小时。核提取生成使用NE-PER工具包(ThermoFisher科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的指示。核仁是孤立使用变体布施和同事在1963年所使用的方法20.]所述Lamond实验室(http://www.lamondlab.com/f7protocols.htm)。短暂的,APF-treated或未经处理的海拉细胞被洗冷PBS (pH值7.4),使胰蛋白酶化,离心收集的500 g×5分钟。细胞颗粒resuspended在15卷张力减退的缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值7.4,10毫米氯化钠,MgCl和1毫米₂),在冰上孵化了30分钟,然后通过添加诺乃清洁剂细胞溶解p 40的终浓度0.3%。样本使用玻璃dounce均质机均质10倍(0.4毫米间隙;金伯利/天鹅,欧文斯,IL)同时保持高速搅拌器在冰上。原子核是由离心收集在218 g×5分钟和resuspended 10卷0.25包含10毫米MgCl蔗糖₂。原子核是由离心提纯在1430 g×5分钟通过0.88包含0.05毫米MgCl蔗糖垫₂。纯化细胞核resuspended在10卷0.34包含0.05毫米MgCl蔗糖₂和用冰六,每个破裂之间的时间间隔10秒迸出10秒。核仁被纯化从产生的匀浆在3000×g离心10分钟通过0.88包含0.05毫米MgCl蔗糖垫₂。纯化核仁resuspended在0.34包含0.05毫米MgCl蔗糖₂为进一步分析。

2.5。免疫沉淀反应

溶菌产物(500μg)从serum-starved海拉细胞治疗20 nM APF serum-starved控制免疫沉淀反应的马伯抗体CKAP4 (G1/296;1μg马伯/ 100μg总蛋白溶菌产物;亚历克西斯生化药剂)一夜之间在4°C。样品被绑定到蛋白质,洗(4 x里帕/ Empigen缓冲区),筛选了(4 x摩门教的样品缓冲;在95°C表达载体),煮5分钟,解决4 - 12% Bis-Tris凝胶和转移到降低条件下硝化纤维膜。免疫印迹分析发现磷酸丝氨酸CKAP4主要使用鼠标马伯,α磷酸丝氨酸抗体(表达载体;稀释1:1000)和次要HRP-conjugated山羊anti-mouse(稀释1:20000年,杰克逊ImmunoResearch实验室)。信号检测在电影发射极耦合逻辑(ThermoFisher科学)。膜被剥夺和reprobed鼠标马伯G1/296反对CKAP4 (Alexis生化药剂)规范化磷酸丝氨酸信号的免疫沉淀反应CKAP4。光密度分析的免疫反应性的乐队使用ImageJ,执行和磷酸化的比率nonphosphorylated CKAP4测定。

2.6。免疫印迹分析

细胞细胞溶解在冰冷的里帕缓冲区包含蛋白酶抑制剂(ThermoFisher科学),用近,离心机15分钟在4°C。浮在表面的蛋白浓度测定使用微BCA蛋白质分析工具包(ThermoFisher科学)。蛋白质是由电泳分离使用4 - 12% NuPAGE Novex Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶在拖把运行缓冲(表达载体),然后转移到硝基。膜被封锁在室温下2小时在TBST缓冲区(Tris-buffered盐水,pH值7.4,0.1%的渐变20)含5%脱脂乳和孵化马伯抗体CKAP4 (G1/296;稀释1:1000;亚历克西斯生化药剂)一夜之间在4°C。膜与TBST随后洗,孵化HRP-conjugated 1小时在室温下的山羊,anti-mouse(稀释1:20000;ThermoFisher科学)开发的二次抗体和增强化学发光(ThermoFisher科学)。评估相同加载的蛋白质,被膜和reprobedβ微管蛋白(稀释1:1000;Abcam)和fibrillarin(稀释1:1000;Abcam),以确保纯度核分数。细胞膜受到电影(以下AR、柯达,罗彻斯特,纽约)和由此产生的图像扫描300 dpi。感兴趣的蛋白质乐队使用ImageJ量化和综合信号密度规范化β微管蛋白(细胞溶质)或fibrillarin(核),随后表示的分数相对于未经处理的控制细胞丰度。

2.7。代谢标记

海拉细胞种植在10厘米~ 80%融合菜肴血清饥饿了三个小时然后新陈代谢贴上150μCiγ³²P-ATP一小时。然后细胞暴露在APF(20海里;24小时)或在无血清培养基(控制)24小时。细胞被收获,在冰冷的PBS洗了三次,核分数被隔离使用NE-PER工具包(ThermoFisher科学)。相等数量的每个分数被sds - page分离和免疫印迹分析转移到硝基使用CKAP4马伯(G1/296;稀释1:500;亚历克西斯生化药剂)如上所述。免疫印迹后,膜冲洗在1% H₂O₂一分钟消除化学发光信号然后裹着保鲜膜接触电影12小时检测磷酸化蛋白质。

2.8。细胞表面生物素酰化

Sulfo-NHS-biotin (ThermoFisher科学)溶解在无血清DMEM最终浓度为0.5毫克/毫升。海拉细胞在无血清培养基被种植了36小时(10厘米~ 80%融合菜),在PBS洗了三次,中替换为无血清DMEM /生物素。在4°C标记反应进行60分钟。接下来,这些细胞被洗了三次PBS / 100毫米gylcine淬火未反应的生物素。无血清DMEM包含APF (20 nM)或没有APF(控制)添加回细胞,然后在37°C的环境四个小时。细胞被胰蛋白酶化收获,在PBS洗了三次,核蛋白质分数被隔离使用NE-PER工具包(ThermoFisher科学)根据制造商的协议。从每个核分数相等数量的蛋白质被sds - page分离,然后涂抹硝基。膜在一夜之间被在4°C TBST缓冲区包含10%的牛奶和随后在TBS洗了三次,一次TBST一旦PBS。膜被孵化两小时在室温下在PBS / 1% BSA包含链霉亲和素合(ThermoFisher科学)的浓度1:500稀释(0.02μg / mL)。膜被洗了三次(10分钟)在4°C TBS TBST一旦。生物素化的蛋白质膜检测使用ECL (ThermoFisher科学;超级西Pico)信号。相同的膜后来西方涂抹与抗体同时CKAP4 (G1/296;稀释1:1000;亚历克西斯生化药剂)和fibrillarin(稀释1:100年,Abcam)。信号从生物素化的CKAP4在核分数归一化核大量CKAP4由免疫印迹和核内蛋白的总量加载到每个车道从fibrillarin由信号。

2.9。基因组DNA亲和色谱法(GDAC)

海拉细胞治疗APF(或控制)或表达CKAP4C100S / SΔE(24 - 48小时)被刮进gDNA绑定缓冲(20毫米三(pH值7.5),100毫米氯化钾,10%的甘油,EDTA 1毫米,1毫米德勤,1毫克/毫升BSA, 0.1% SDS) 1 x磷酸酶抑制剂和1 x鸡尾酒磷酸酶抑制剂1(从ThermoFisher科学)。蛋白质提取2小时冰上然后不溶性分数是颗粒状在15000×g离心10分钟4°C。接下来,15 - 100毫克的gDNA单独纤维素或纤维素(控制;从σ)添加到上层清液和混合常数反演在一个旋转的轮子在4°C在一夜之间两个小时。捕捉细菌表达糖基CKAP4, 0.4 -40人μ纯化蛋白g(由微观BCA化验,ThermoFisher科学)于500年加入15-50 mg gDNA-celluloseμL gDNA-binding缓冲区和混合在4°C以上。蛋白质被允许绑定后,独自gDNA-cellulose或纤维素被离心分离颗粒状,用PBS三次。这洗协议足以消除是非绑定蛋白质和nonphosphorylated CKAP4从单独的纤维素和gDNA-cellulose。最后洗后,sds - page样品缓冲被添加到10μL的上层清液之前从gDNA颗粒,纤维素,或gDNA-cellulose颗粒。样本加热5分钟在95°C,通过sds - page分离,转移到硝基和探索αv5抗体(mAb;1:5000;英杰公司)山羊——紧随其后α-mouse-HRP(1: 10000年,ThermoFisher科学)来检测CKAPC100S / SΔE或表达的是暂时性的α-CKAP4 (mAb G1/296;1:1000;亚历克西斯生化药剂)山羊——紧随其后α-mouse-HRP(1: 10000年,ThermoFisher科学)来检测内源性和/或瞬变CKAP4表示。使用化学发光信号检测在电影(SuperSignal西Pico ThermoFisher科学)。

3所示。结果

3.1。CKAP4把细胞核从质膜对APF的回应

以前,我们观察到immunolocalization CKAP4是海拉细胞表面表达,成为更加丰富在APF暴露后的核(6]。确认CKAP4把原子核在对APF的回应,我们使用三种不同的techniques-surface标签,细胞分离和免疫细胞化学。首先,我们与sulfo-NHS surface-labeled海拉细胞蛋白生物素,一种水溶性生物素,不经过的点只有一级胺结合细胞外的部分蛋白质。然后我们把细胞与APF三个小时,孤立的核蛋白质分数,和分离的蛋白质SDS PAGE随后转移与streptavidin-HRP硝基和检测。作为显示在图2(一个)蛋白质检测,生物素化的CKAP4 APF-treated细胞的核分数而不是核蛋白质分数与未经处理的细胞。这表明CKAP4呈现在细胞表面,是内化并把原子核反应APF治疗。

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(b)

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图2

Surface-labeled CKAP4把从质膜进入细胞核后APF曝光 2 _{2 2} 2 β β 。(一)海拉细胞表面蛋白标记与磺酸基NHS-biotin节中描述。接触后20 nM APF 24小时(或没有治疗),细胞收获和核蛋白质分数被隔离(皮尔斯NE-PER),通过sds - page分离,转移到硝基。膜被探测streptavidin-HRP (1: 5000;皮尔斯)结合生物素化的蛋白质,和信号检测到发射极耦合逻辑(皮尔斯)。检测生物素化的蛋白质的核后,膜上的(链霉亲和素)合灭活了孵化的污点PBS含有3% HO叠氮化钠和1%。相同的膜被reprobed CKAP4抗体(anti - climp - 63”,稀释1:1000年,亚历克西斯生化药剂)和fibrillarin(核标记和加载控制;Abcam;稀释1:1000)。(b)海拉细胞治疗与APF 24小时(20海里),导致显著增加丰富CKAP4相比,细胞核控制样品。治疗细胞收获和核和胞质分数被孤立和节中描述的sds - page分离。分析了蛋白表达与抗体蛋白免疫印迹微管蛋白(稀释1:1000年,Abcam;加载控制无核武器的分数),CKAP4(“反- climp - 63”,稀释1:1000年,亚历克西斯生化药剂),和fibrillarin(稀释1:1000年,Abcam;加载控制核分数)和特定的标记,然后用一个HRP-conjugated anti-mouse二级抗体(1:20000;ThermoFisher科学)。蛋白质被发现发射极耦合逻辑(皮尔斯)和多重曝光拍摄。电影上的乐队的集成密度用ImageJ测量。曝光时间控制,确保信号在电影没有饱和。(c)核/胞质比率代表的相对分布CKAP4核与胞质分数从细胞中提取处理或没有APF。CKAP4 APF-treated丰富,控制样本归一化加载微管蛋白的无核武器的分数和fibrillarin核分数。CKAP4的核/胞质比这些规范化的APF控制样品测定值。标准差描述标准化之间的可变性,核,胞质比率从三个独立的实验。正反,配对以及两个数据的数组(加上APF控制)表明,这些比率的差别显著(;)。细胞治疗APF停止分裂,所以10厘米菜包含APF控制治疗细胞含有更少的细胞(和蛋白质)在实验的最后,正常化CKAP4信号加载控制纠正这种差异。Fibrillarin特征明显是一个核标记也被本地化核仁。数据显示是代表四个独立的实验。

来确定是否有部分核的变化丰富的CKAP4 APF的刺激,我们进行核和胞质蛋白免疫印迹分析分数从APF-treated和未经处理的细胞中提取。我们发现的海拉细胞APF导致~ 4倍增加的相对丰度CKAP4核(数字2 (b)和2 (c))证实了我们之前的观察6]。最后,我们将展示通过免疫细胞化学,是暂时性的表达,野生型(WT) CKAP4本地化APF治疗后核(图3(a))。总的来说,这些数据表明CKAP4后把海拉细胞的细胞核APF治疗。

图3

CKAP4磷酸化和棕榈酰化调节CKAP4走私 3 17 19 1 β 2 。CKAP4突变体模仿本构depalmitoylation和丝氨酸的各种状态,,)磷酸化生成的影响来确定这两个亚细胞分布的转译后的修改CKAP4针对APF(见表)。海拉细胞转染24-36小时与构造表示每个面板的左侧。细胞血清饥饿了6个小时,然后处理APF (20 nM) 18 - 24小时。随后,这些细胞被固定在4%多聚甲醛缓冲,permeabilized Triton x - 100, 0.1%和应用(1)微管蛋白(红色;TRITC)和(2)V5(格林:FITC)(如部分所述)来区分转染,V5-epitope标记WT (a)和突变版本的CKAP4从内生CKAP4 (b) - (d)。的变异版本CKAP4无法palmitoylated (c100)或磷酸化(SΔA)不把原子核对APF的回应。(e)那些模仿磷酸化(SΔE)把原子核对APF的回应。(f) CKAP4C100SSΔE, depalmitoylated起来从而phosphomimicking,主要在细胞核中表达。在每个频道拍摄的图像叠加来说明突变CKAP4对细胞骨架的分布。细胞被数字化成像或在60和63 x共焦显微镜,分别(规模酒吧= 25微米)。

3.2。APF-Induced核易位CKAP4由丝氨酸磷酸化调节

以前我们发现DHHC2-mediated CKAP4棕榈酰化的半胱氨酸- 100 (C100)核本地化需要针对APF治疗(6]。工作由其他人已经表明,丝氨酸的磷酸化3,17日和19 (S3、肌力和S19)也影响CKAP4亚细胞分布,促进脱离微管(7]。这些发现表明,APF绑定可能改变棕榈酰化和/或磷酸化CKAP4状态,影响其细胞内的亚细胞分布和功能。因此,我们生成CKAP4突变体模仿本构depalmitoylation丝氨酸磷酸化和各种国家检查APF的亚细胞分布的影响在海拉细胞使用免疫细胞化学(表1)。CKAP4突变包括C100丝氨酸(C100)阻止棕榈酰化;突变的S3,肌力,S19丙氨酸(SΔA)阻止磷酸化;突变的三个丝氨酸谷氨酸(SΔE)模仿磷酸化7]。每个突变体融合到V5表位标记免疫区别于内生CKAP4。而且,由于磷酸化调节微管的CKAP4协会,我们coimmunolabeled微管蛋白和CKAP4可视化差异的相对定位CKAP4内微管网络。表1提供了一个数据的总结。

如图3所需,我们证实棕榈酰化是CKAP4表情点无论磷酸化的状态(见图3(b),3(d),3(f))。重要的是,当CKAP4不表示点,它不应对APF的亚细胞分布的变化(数据3(b),3(d)3(f))。CKAP4C100S / SΔA表达仅限于内部膜和没有改变以应对APF(图3(d))。CKAP4SΔA表达整个细胞,包括点、WT CKAP4(数字惊人的相似3(一)和3(c))。治疗的细胞表达与APF CKAP4SΔA没有造成易位的突变形式的CKAP4进入细胞核,表明CKAP4必须磷酸化丝氨酸残基3,17日,19日,从而脱离微管网络,可能促使进入细胞核。CKAP4SΔE也分布在整个细胞包括点,但在CKAP4SΔA相比,APF治疗引起的易位CKAP4SΔE成核(图3(e))。令人惊讶的是,CKAP4C100S / SΔE主要是表示如果不是只在细胞核(即使没有APF)及其定位并没有改变针对APF治疗(图3(f))。这些数据表明,CKAP4磷酸化的丝氨酸残基3、17和19所需核易位对APF的回应。

测试的想法APF治疗促进CKAP4丝氨酸磷酸化,我们使用了一个antiphosphoserine磷酸化抗体来衡量任何变化的内生CKAP4完整的细胞溶解产物对APF的回应。丝氨酸的磷酸化CKAP4免疫沉淀物从APF-treated海拉细胞增加~ 5.0倍而CKAP4免疫沉淀物从未经处理的细胞的完整的细胞溶解产物(图4),证明APF增加CKAP4磷酸化丝氨酸残基。

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(b)

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图4

APF诱发CKAP4丝氨酸磷酸化 μ 。(一)APF治疗诱发显著增加丝氨酸的磷酸化CKAP4 CKAP4通过免疫沉淀反应的免疫印迹检测磷酸丝氨酸。完整的细胞溶解产物(500g)从海拉细胞治疗20 nM APF serum-starved控制与CKAP4抗体免疫沉淀反应(Alexis)一夜之间在4°C。样品被绑定到蛋白质,洗(4 x里帕/ Empigen缓冲区),筛选了(4 x摩门教的样品缓冲;在95°C表达载体),煮5分钟,解决4 - 12% Bis-Tris凝胶和转移到降低条件下硝化纤维膜。免疫印迹分析ps发现phospho-serine使用初级(表达载体和二级抗体(山羊anti-rabbit HRP-labeled抗体;皮尔斯)开发增强化学发光试剂(皮尔斯)和暴露于电影。膜被剥夺了与恢复剥离缓冲区(皮尔斯)和reprobed CKAP4 (Alexis)规范化磷酸丝氨酸信号的免疫沉淀反应CKAP4。(b)的光密度分析免疫反应性的乐队是使用ImageJ和磷酸化的比率nonphosphorylated CKAP4测定。

3.3。核CKAP4磷酸化APF-Induced易位

观察增加内源性CKAP4丝氨酸磷酸化和核本地化phosphomimicking CKAP4突变体对APF表明内生CKAP4应该磷酸化在细胞核中。确定核CKAP4的确是磷酸化,我们新陈代谢的标记细胞γ³²P-ATP、暴露他们APF和孤立的核分数。磷酸化水平的评估后,免疫印迹的蛋白质sds - page分离。在协议与先前的实验中,大量的CKAP4在细胞核中增加以下APF(图5(一个)上面板)。核CKAP4磷酸化同等学位APF-stimulated和控制细胞(图5(一个),下半部分)。CKAP4磷酸化信号的比值在相应CKAP4免疫印迹信号都是相同的(1.00和0.975;APF治疗与控制)表明核CKAP4磷酸化。

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(b)

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(c)

图5

核CKAP4磷酸化APF-induced易位 γ ³² μ γ ³² α _{2 2} APF增加协会CKAP4核仁。 20. α 。(a)在核分数CKAP4磷酸化APF-treated相同的学位和控制细胞代谢标记就证明了这点P-ATP。CKAP4磷酸化信号的比值在相应CKAP4免疫印迹信号大约是相同的两个(1.00和0.975;APF治疗和控制)。海拉细胞在10厘米~ 80%融合菜肴是3小时150血清饥饿CiP-ATP了每道菜额外1小时。那么细胞暴露于APF (20 nM;24小时)或在无血清培养基(控制)24小时。24小时结束时,这些细胞被收获,在冰冷的PBS洗了三次,核和细胞质分数孤立使用NE-PER(皮尔斯)。相等数量的每个分数被sds - page分离和转移到硝基。膜是孵化隔夜在4°CTBST -CKAP4抗体(1:500)和1%的牛奶,洗和孵化6个小时在鼠标4°C, HRP-conjugated二级抗体(皮尔斯;1:20000年TBST)和1%的牛奶。CKAP4乐队被增强化学发光检测(发射极耦合逻辑;皮尔斯;20秒曝光;左面板)。免疫印迹后,膜冲洗在1% HO1分钟消除化学发光信号然后裹着保鲜膜接触电影12小时检测磷酸化蛋白质。光密度分析的免疫反应性的乐队是使用ImageJ和磷酸化的比率nonphosphorylated CKAP4测定。(b)和(c)免疫印迹分析表明,治疗与APF的海拉细胞(20 nM)增加了协会的内生CKAP4核仁的分数,而depalmitoylated起来从而phosphomimicking CKAP4突变,CKAP4C100S / SΔE与核仁的分数在更大程度上比内生CKAP4隔绝APF-treated细胞。核仁是孤立使用变体布施和同事发布的方法(安格斯所描述的]Lamond实验室(英国邓迪大学)。核仁的蛋白质分离的sds - page和西方CKAP4涂抹(v5的CKAP4C100S / SΔE)和fibrillarin。在电影发现了乐队的发射极耦合逻辑并使用ImageJ量化。CKAP4信号在每个车道的免疫印迹是规范化fibrillarin乐队在同一车道上。CKAP4控制细胞的归一化值设置为1,其他值都是相对于控制。图中的值是手段和SD。“*”表示的值明显不同于serum-starved控制当评估使用的学生以及(双尾。血清饥饿与APF治疗;血清饥饿和CKAP4C100S / SΔE;CKAP4C100S / SΔE与APF治疗,;为每个)。

在海拉细胞暴露在APF或细胞转染CKAP4C100S / SΔE,我们观察到immunolabeling CKAP4不是均匀分布在细胞核内,而是似乎集中在核仁和其他身份不明的亚核的结构(数据未显示)。确定CKAP4与核仁,我们海拉细胞治疗与APF 24小时,并测量了大量的CKAP4核仁,核分数(细胞核nonnucleolar分数)免疫印迹(图5 (b))。我们的研究结果表明,与核仁APF诱发CKAP4协会(数字5 (b)和5 (c))。Immunolocalization CKAP4C100S / SΔE建议也与核仁APF治疗(独立)。确认这个生化反应,我们在海拉细胞表达CKAP4C100S / SΔE,孤立的核仁的分数,并测量其与核仁免疫印迹。图5表明CKAP4C100S / SΔE associates核仁更大程度比内生CKAP4 APF-treated细胞。这些数据支持的想法CKAP4变得APF绑定后,磷酸化,磷酸化增强核易位。

3.4。CKAP4C100S / SΔE作为APF模仿行为

核之间的相似性的本地化内生CKAP4 APF后治疗和瞬变表示CKAP4 c100 / SΔE表明,突变可能模仿APF的活动,如抑制细胞增殖。判断这个假设是正确的,我们与不同数量的CKAP4C100S转染海拉细胞/ SΔE cDNA和测量他们的扩散在48小时。图6显示瞬时表达CKAP4C100S / SΔE显著剂量依赖性地抑制海拉细胞增殖(相对于模拟转染细胞),因此,细胞暴露于APF的特征(6,11,21]。这些结果表明,CKAP4C100S / SΔE可能函数作为APF模仿和支持论点,内生CKAP4 depalmitoylated和磷酸化后APF绑定。

图6

CKAP4C100S / SΔE表达抑制海拉细胞增殖 。海拉细胞被模拟转染(Fugene;控制)或转染100、200或400 ng CKAP4C100S / SΔE DNA。24小时后额外增长,扩散测量使用WST-1扩散试验(Biovision)根据制造商的协议。每个数据点的平均值和SD来自12个独立的井。在统计上有显著差异的细胞增殖的速度被检测到海拉细胞转染与100年,200年和400年ng CKAP4C100S / SΔE DNA与mock-transfected细胞使用的学生以及(*)。

3.5。磷酸化CKAP4 gDNA结合

因为CKAP4本地化细胞核、核仁针对APF治疗,因为其预测结构包括一个地区同源bZIP转录因子(图1),我们评估CKAP4是否可以绑定到使用DNA基因组DNA (gDNA)亲和色谱法(GDAC) [22]。这种技术,核溶解产物从APF——或者mock-treated海拉细胞被孵化与gDNA-bound纤维素珠子的存在特异性的竞争对手(dI-dC), DNA和蛋白质被sds - page其次是孤立和分离蛋白质印迹anti-CKAP4抗体。如图7(一),CKAP4结合gDNA APF-dependent地(巷3)相比,mock-treated控制(巷4)。CKAP4-gDNA绑定是磷酸化依赖CKAP4隔绝细胞治疗前没有磷酸酶抑制剂APF治疗未能结合gDNA(巷6)。此外,核溶解产物从细胞转染V5-tagged, phosphomimicking CKAP4突变(CKAP4 c100 / SΔE),我们观察到增强绑定gDNA(图7 (b))。在图7 (c),我们表明,纯化rCKAP4 (126 - 501 c端残留,包括bZIP-like dna结合域)也将gDNA绑定。总的来说,这些数据表明,APF诱发CKAP4磷酸化,磷酸化是绑定gDNA CKAP4所需。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图7

CKAP4直接绑定到基因组DNA 。(a) CKAP4结合gDNA APF-dependent地(巷3)相比,mock-treated控制(巷4)。CKAP4-gDNA绑定磷酸化依赖CKAP4隔绝细胞治疗APF之前没有磷酸酶抑制剂治疗未能结合gDNA(巷6)。作为控制,我们装载APF对待核溶解产物巷1和磷酸酶/ APF对溶解产物巷5。巷2是一个没有gDNA纤维素控制。(b)的能力是暂时性的转染V5-tagged, CKAP4 c100 / SΔE绑定gDNA没有APF的治疗(c)和净化的能力rCKAP4(残留126 - 501,包括bZIP-like dna结合域)来绑定gDNA也评估通过比较CKAP4捕获的数量相对于剩下的细胞溶解产物后绑定(少量)。

4所示。讨论

CKAP4建立作用在维护ER的结构相对于细胞骨架由绑定microtubules-a函数依赖三氨基端丝氨酸残基(S3、肌力和S19)磷酸化,使CKAP4脱离微管(见图1)[3,7]。表达的变异版本CKAP4不绑定微管深刻变化ER形态(2]。最近,我们的知识CKAP4功能已经扩大到包括它作为APF的细胞表面受体10),表面活性剂蛋白(SPA) (23),和组织纤溶酶原激活物(tPA) [24]。在先前的研究中,我们表明,棕榈酰化的CKAP4 DHHC2需要本地化的点和调停APF-induced信号事件,包括抑制细胞增殖和基因/蛋白表达的变化6]。但是,本文提供的数据,之前没有了解CKAP4 APF信号转导机制。

以前,我们观察到免疫细胞化学,让细胞暴露在APF导致增加大量的CKAP4在细胞核6]。这些数据表明,APF绑定CKAP4在细胞表面诱导易位到细胞核。在这项研究中,我们使用细胞表面标记与Sulfo-NHS-biotin(只有细胞外主要胺反应但不绑定到标签过程中对细胞内蛋白质)来监视CKAP4定位针对APF绑定。我们的研究结果表明,生物素化的CKAP4从细胞表面丰富的核分数与APF海拉细胞治疗,但不是在未经处理的细胞。检测相对少量的nonbiotinylated CKAP4在未经处理的细胞的细胞核在这个实验中与其他实验的数据是一致的,表明CKAP4可能有一些固有的核函数与APF-induced信号转导,此外,它表明,为了阻止扩散,CKAP4在细胞核中必须绑定到APF。

使用一系列的突变体,模仿棕榈酰化和磷酸化相结合,我们确定APF促进CKAP4丝氨酸磷酸化;此外,磷酸化的丝氨酸3,17日和19需要APF-induced CKAP4核易位,这些残留丙氨酸(SΔA)的突变抑制这一过程。此外,这些丝氨酸残基的突变谷氨酸创建一种phosphomimicking CKAP4 (CKAP4SΔE)促进了核易位CKAP4对APF的回应。有趣的是,一种phosphomimicking CKAP4也持续depalmitoylated本地化的细胞核没有APF的刺激。这些数据表明,当CKAP4受APF的点,它成为depalmitoylated磷酸化和把进入细胞核。直接支持的想法,必须磷酸化CKAP4进入细胞核,我们通过代谢标记γ³²P-ATP核CKAP4磷酸化。尽管使用多个方法,我们没有观察到palmitoylated CKAP4细胞核。的机制CKAP4或任何其他palmitoyl-protein变得depalmitoylated极大的兴趣。然而,很少有知道depalmitoylation是如何管理的。丝氨酸3和19驻留在一个共识站点内PKC和丝氨酸17 CKII网站(7];然而,这些激酶磷酸化的丝氨酸负责是否还有待确定。

CKAP4 ~ 106氨基酸胞质尾,一个TM域,和一个大,细胞外/ ER-luminal域由474个氨基酸组成的(参见图1)。细胞外的大部分领域,包括齐聚反应所需的部分,将折叠成一个卷曲螺旋构象,以两性α螺旋富含基本残留由c端(~ 80)残留3]。这些结构是最常见的和良好的领域参与蛋白质的相互作用。此外,468 - 602氨基酸残基同源bZIP dna结合域的转录因子。许多CKAP4的预测结构的详细信息,它的非随机分布在细胞核中,增强与核仁(见图5),表明它可能与DNA结合。基因组DNA亲和色谱法是一种简单的方法来确定蛋白质与DNA的结合先天的知识的结合位点(25]。使用GDAC,我们证明了CKAP4隔绝APF-treated海拉细胞基因组DNA (gDNA)。此外,我们的结果表明,包含磷酸酶抑制剂是内生CKAP4绑定到gDNA所需,而不是绑定的纯化CKAP4 gDNA c端片段。这表明c端片段,分离磷酸丝氨酸在n端附近,可以驻留在一个构象状态有利于gDNA绑定相同的构象存在于内源性蛋白磷酸化。未来的实验将进行识别的特定DNA序列CKAP4绑定。

CKAP4 63 kDa, homo-oligomeric,嵌在膜;这些都不是典型的物理性质的蛋白质通过扩散进入细胞核。一般来说,蛋白质扩散到核胞质,分子量小于40 kDa。太大的蛋白质通过核孔扩散的协助下把航天飞机蛋白质(或karyopherin)身体绑定到一个核本地化信号(NLS)导入的蛋白质序列。CKAP4包含glycine-rich可能充当NLS的域。类似的领域中找到几个已知蛋白质的家庭调解核进口(22,26]。正在进行的工作表明,该域CKAP4足以驱动核本地化的nonrelated蛋白质(数据未显示)。

因为它的大小和TM域,似乎不太可能CKAP4核函数。然而,有先例,TM-domain蛋白质进入细胞核。表皮生长因子(EGF)受体家族糖化,单程TM域蛋白质~ 140 kDa,还把unproteolyzed,从质膜进入核配体结合后(27]。在细胞核内,他们调节转录和参与,保持酶的信号转导途径。认为这些蛋白质在细胞核转移到,功能活动,超出了他们的酪氨酸激酶活动在质膜上,是有争议的;然而,最近,机械的细节如何进入细胞核内的核函数以及他们如何变得清晰(了27])。

总之,本文提供的数据的机制提供新的见解CKAP4介导APF信号转导。同时,我们增加了一个小,但越来越多的文献表明在质膜受体结合配体后可以把到细胞核。最后,我们的数据表明,CKAP4C100S / SΔE APF-like它的核活动,抑制增殖没有绑定到APF。这一发现表明,CKAP4C100S / SΔE可以用来治疗hyperproliferative癌症等疾病。APF本身已被建议作为一个抗癌疗法(28]。

缩写

确认

作者想感谢凯伦Overstreet技术援助。本文从克里斯·德马科资金支持的美国癌症协会机构科研补助金(机构没有。伊斯兰革命卫队- 01 - 188 - 04),癌症基金会的攀爬,惠特尼实验室,佛罗里达大学和英联邦医学院。fibrillarin的抗体是一个慷慨的礼物从格里·肖(超滤和EnCor生物科学)。

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