见解的功能蛋白质的非结构化的n端结构域在红细胞生成4.1 r和4.1克

文摘

膜骨架蛋白4.1 r是一个四口之家的原型成员高度paralogous蛋白质,包括4.1 g、4.1 n,和4.1 b。两种亚型的4.1 (4.1 r^135年和4.1 r^80年),以及4.1 g,在终端分化成红血球细胞中表达,但只有4.1 r^80年存在于成熟的红细胞。该领域的一个目标是为了更好地理解复杂的细胞类型的监管和isoform-specific 4.1蛋白质的正常表达。开始回答这些问题,我们正在研究在深度4.1蛋白质的重要功能组织在红细胞和功能膜的骨架。我们以前报道,绑定配置文件4.1 r^80年和4.1 r^135年膜蛋白和钙调蛋白是非常不同的,尽管membrane-binding相似的结构域为4.1 g和4.1 r^135年。我们积累了证据表明这些差异引起的n端209个氨基酸盔地区(HP)。有趣的是,惠普的地区是一个非结构化的域。我们现在的概述4.1亚型和假字之间的差异和相似之处。我们也讨论非结构化的生物学意义域。

1。4.1 r的红细胞膜骨架

膜骨架,红细胞质膜的基础,是由一个血影蛋白/肌动蛋白晶格固定各种通过两个专门的细胞骨架蛋白的跨膜蛋白,4.1 r和红细胞锚蛋白,ankyrin-R [1]。4.1 r^80年稳定水平血影蛋白之间的相互作用形成(α2 -β2)和短肌动蛋白细丝(~ 14分子)。肌动蛋白细丝与众多辅助蛋白质,如原肌球蛋白、肌球蛋白,tropomodulin, adducin [1),确保肌动蛋白丝的重组。4.1 r^80年也与跨膜蛋白相互作用,血型糖蛋白C (GPC)和膜相关鸟苷激酶(MAGUK)蛋白质过去,也作为红细胞脚手架蛋白(图1)。

1.1。GPC

GPC是32 kDa单跨膜蛋白表达~ 50000−100000分子/红细胞。胞质域由47个氨基酸残基(ID: P04921)。R^82年序列已被确认为4.1港元r绑定序列(2- - - - - -4]。这个RHK主题是高度保守的胞质域Neurexin IV, Paranodin, TSLC1(肿瘤抑制肺癌1)(5]。Girault等人已经指定这个RHK主题“GNP-motif,”单跨膜后4.1 r结合蛋白,G电脑,Neurexin四世巴勒斯坦权力机构ranodin [6]。GPC和其他GNP-motif含有蛋白质拥有过去绑定主题,EYFI, c端区域(图2)。

1.2。过去

过去是一个55 kDa红细胞支架蛋白,属于膜相关鸟苷激酶同系物(MAGUK)家族(ID: Q00013)。这种蛋白质的特征是存在PDZ (Postsynaptic密度蛋白- 95,Dlg (果蝇阀瓣大肿瘤抑制),Z1 (ZonulaOccludens-1)领域,一个SH (src-homology) 3域,和催化活性的鸟苷激酶域(鞠觉亮),所有这些函数作为蛋白质交互模块(图2)[8]。过去人类红细胞副本的数量~ 80000。过去也被称为米embranePalmitoylatedProtein 1 (MPP1)以来的半胱氨酸残基可以palmitoylated鞠觉亮域(8]。然而,仍然没有直接证据的表达palmitoylated过去在活细胞。虽然过去在红细胞的功能尚未澄清,过去似乎对于维护极性在中性粒细胞(9)在毛细胞(10,11]。最近,NMR-based研究已经启用的3 d结构的GPC肽,与过去的PDZ域(7]。突变的研究中,基于替代的苯丙氨酸残基EYFI主题与半胱氨酸残基(E^125年YC我),提供了我们过去对GPC结构信息绑定。因此,4.1 r^80年参与两个不同的三元复合物的形成在红细胞,4.1 r^80年/ GPC /过去/复杂和4.1 r^80年血影蛋白/肌动蛋白复杂。Ektacytometry研究显示4.1 r在控制红血球膜力学性能起着关键作用。事实上,重新封闭膜准备从红细胞完全或部分缺乏4.1 r^80年显示一个戏剧性的减少膜稳定性(了12])。有趣的是,无论是纯化增加4.1 r^80年或净化10 kDa spectrin-actin绑定域4.1 r^80年不稳定的4.1 r-deficient膜能够恢复这些膜的机械稳定性。这说明明确4.1 r的重要作用^80年,更具体地说21-amino-acid肽由外显子编码16在spectrin-actin绑定域,在维护膜稳定通过促进血影蛋白/肌动蛋白相互作用[1,12]。

1.3。带3

膜稳定性也在控制部分由乐队3-ankyrin-spectrin交互(如图1)。带3是102 kDa 14-transmembrane蛋白介导的交换和Cl⁻因此被称为阴离子交换剂1 (AE1) [1)(ID: P02730)。它在1200000分子/细胞表达。形成二聚体组装成四聚体,每个四聚物结合锚蛋白分子之一。这是基地组织的乐队3-ankyrin-spectrin复杂(13]。

我的4.1 r结合^386年RRRY和L^343年RRRY序列在乐队3-cytoplasmic域(14]。虽然氨基的晶体结构胞质域乐队3的报道,这个结构是公认的氨基55残留,包括L^343年RRRY序列,失踪的晶体(15]。结果表明,带3有四个4.1 r结合位点。带3绑定到4.1 r的化学计量仍是未知的。带3的重要性在膜结构作用的结果与脚手架蛋白锚定血影蛋白网络通过交互锚蛋白。我们已经表明,4.1 r^80年调节带3与锚蛋白(16]。我们有类似的特征函数为4.1 r^80年在调制与CD44锚蛋白相互作用,一个跨膜蛋白作为透明质酸受体(17]。

没有4.1 r,锚蛋白、血影蛋白或选择这些蛋白质的突变导致红细胞改变形状和力学性能(了1,12])。我们已经表明,4.1 r在斑马鱼与膜蛋白相互作用类似物(鲐鱼类)使用在体外绑定化验(18,19)(ID: NP_778259)。Salomao等人已经证明,蛋白质4.1 r^80年可以绑定在体外额外的红细胞跨膜蛋白,如凯尔,XK, Rh,达菲(20.]。这些相互作用仍有待验证在活的有机体内。4.1 r的功能已经从造血推断人类4.1 r-deficient表型观察病人,4.1 r淘汰赛转基因小鼠和斑马鱼(鲐鱼类)进行化学诱变21]。4.1 r不足导致遗传性elliptocytosis(他),红细胞失去典型的两面凹的圆盘形状椭圆。因此,4.1 r的行为与其他膜蛋白维持正常红细胞形状(22]。

2。第一部分:4.1 r^80年和4.1 r^135年在红细胞生成

2.1。4.1 r结构的概述

4.1 r形成多分子的跨膜蛋白和膜相关蛋白复合物,如血影蛋白和肌动蛋白(1]。这种复合物,这是至关重要的维持红细胞的结构稳定,nonerythroid细胞可能参与了其他功能,例如,例如,信号转导的网站信息和/或cell-matrix联系人。

4.1 r^80年(ID: P11171),出席每红细胞约200000册,可以提取高盐治疗由内向外囊泡(IOVs),这对应于红细胞细胞膜贫血影蛋白和肌动蛋白。基于其622 -氨基酸成分(了1,12]),预测分子量4.1 r ~ 70 kDa,表观分子量的差异导致的非结构化域4.1 r。有限的α糜蛋白酶的消化4.1 r生成四个多肽:30 kDa n端membrane-binding域,一个16 kDa域,10 kDa spectrin-actin绑定域名,和一个22/24 kDa c端域(了1,12])。4.1 r同种型成红血球细胞中表达,而不是成熟的红细胞,包含一个额外的氨基端209个氨基酸盔(HP)地区。的表观分子量4.1 r同种型在sds - page ~ 135 kDa,并因此被称为4.1 r^135年。然而,它的理论分子量~ 100 kDa。这种差异源于非结构化的惠普地区(23]。

2.2。非结构化的氨基端和结构化30 kDa丰贸领域4.1 r^135年

我们计算的障碍的概率氨基惠普地区和丰贸领域使用PrDOS软件(http://prdos.hgc.jp/cgi-bin/top.cgi)[26]。值大于0.5反映了无序结构,错误的概率预测的5%或更少。我们的分析表明惠普地区高度无序结构(氨基酸1 - 209)与30 kDa的高度有序的结构丰贸领域氨基酸(210 - 507)。特别注意,而整个209 aa惠普地区采用无序结构,一个简短的多肽氨基酸(70 - 80),先前确定对应于一个Ca^{2 +}端依赖CaM-binding网站(27,28不(图)4)。

我们实验表明,惠普是一个展现地区通过sds - page、尺寸排阻色谱(SEC)和动态光散射(DLS)。惠普的理论分子量4.1 r(右投手)23 kDa但我们估计其表观分子量55 kDa的sds - page (29日]。此外,证交会分析表明,右投手之间筛选了免疫球蛋白(150 kDa)和白蛋白(68 kDa) Sephacryl s - 300列。而相应的理论分子量蛋白质氨基酸1 - 507 4.1 r^135年(RHP-R30)和R30 (30 kDa丰贸域)56 kDa, 32 kDa,分别,他们迁移的多肽> 100 kDa 35 kDa,分别在sds - page (29日]。由DLS测量,右投手的水力直径,RHP-R30和R30是7.6,9.4,5.6 nm,分别(Nunomura, W。、日本柴、k和Takakuwa Y。未公开的数据)。这些水动力参数使我们能够评估右投手的分子量,RHP-R30 R30为77,127年,分别和40 kDa。理论之间的差异和表观分子量蛋白质包含右投手反映展开这个肽的性质。

相比之下,一致性理论和表观分子量R30 R30说明了折叠的本质。重要的是,PrDOS-based全长4.1 r的分析^135年预计30 kDa蛋白质域是唯一地区采用有序(折叠)结构。4.1 r 30 kDa的晶体结构域是让人想起蝶式或螺旋桨的形状,有三个明显不同的叶(PDB: 1 gg3) [25]。第一,N-lobe,对应于第一个78个氨基酸,其中包括乐队3绑定主题L³⁷EEDY,由4双链β链。第二,α叶,对应下面的90个氨基酸,其中包括GPC结合位点,包括4α螺旋线。第三,COOH-terminal叶(C-lobe),其中包含过去绑定表面,是由七个β链,结尾α螺旋(图4)。尽管许多膜骨架蛋白包含内在无序(展开)地区,很少有报道描述这些内在无序区域的函数(s) (30.- - - - - -35]。我们的研究结果不仅有助于更好地理解膜骨架蛋白的结构也是内在无序蛋白质的功能。

2.3。4.1 r的表达^135年和4.1 r^80年

在早期阶段,成红血球细胞(CD34⁺细胞),4.1 r^135年是唯一的同种型检测,4.1 r^80年完全缺席。中间阶段后,大约7天后达到在文化、表达4.1 r^80年大幅增加。在成熟的红细胞,4.1 r^80年主导,4.1 r^135年被采用的方法(几乎没有见过29日]。4.1 r的复杂机械^135年-4.1 r^80年基因转换最近被Parra et al。36,37]。

2.4。4.1 r的绑定配置文件^135年和4.1 r^80年膜蛋白和凸轮不同

以前的研究已经表明,4.1 r^80年结合乐队3和GPC本机由内向外囊泡(IOVs),它只是绑定到GPC在使胰蛋白酶化IOVs [32]。Scatchard分析显示一个明显的离解常数在平衡时,,76海里的4.1 r^80年绑定使胰蛋白酶化IOVs(即。GPC)。相比之下,4.1 r^80年绑定到本地IOVs(即。,to both GPC and band 3) reaches 340 nM. A similar analysis for 4.1R^135年显示4.1 r^135年绑定使胰蛋白酶化IOVs(即。GPC)明显较弱(~ 2μ比4.1米)r^80年。相比之下,4.1 r^135年绑定到本地IOVs 230海里,类似于观察4.1 r^80年。这些发现意味着惠普在4.1 r的存在与否亚型调节他们的亲和力GPC但不带3 (29日]。

为了获得独立确认绑定的4.1 r上的相似之处^135年带3 cyt GPCcyt,我们使用基于共振镜IAsys系统检测方法(29日]。同意上述使用IOVs绑定数据,有一个戏剧性的差异4.1 r的亲和力^135年带3 cyt GPCcyt,更高的亲和力乐队3 cyt(23±2海里)比GPCcyt(1327±103海里)。形成鲜明对比,4.1 r的值绑定^80年带3 cyt和GPCcyt非常相似,在submicromolar范围内。这证实了一个重要的角色对于惠普在调节4.1 r紧密联系的两个主要的跨膜约束力的合作伙伴。与4.1 r的结合亲和力之间的显著区别^135年和4.1 r^80年带3 cyt GPCcyt,非常相似的两个亚型与过去相似,submicromolar范围。

像预期的那样从获得的数据为4.1 r^80年和4.1 r^135年亚型,添加右投手R30 (RHP-R30)产生深刻变化的能力R30绑定到乐队3 cyt和GPCcyt。因此,绑定的亲和力RHP-R30乐队3 cyt GPCcyt 35-fold高于。这些发现强调一个重要的角色的右投手调制R30与其两个membrane-binding伙伴之间的交互。

2.5。差异在凸轮绑定到4.1 r亚型

我们以前记录4.1 r^80年结合与一个凸轮submicromolar范围,存在和缺乏Ca^{2 +}这意味着这种交互是Ca^{2 +}独立(38]。我们也检查了4.1 r之间的相互作用的本质^135年和凸轮。4.1 r的动力学分析^135年与凸轮使用IAsys系统确定了很强的相互作用51±5 nM的Ca^{2 +}。在缺乏Ca^{2 +},亲和力下降了100倍。因此,相比4.1 r^80年,4.1 r之间的交互^135年与凸轮强烈Ca^{2 +}相关的。独自惠普地区的调查证实了Ca^{2 +}与凸轮端依赖交互,这意味着这一地区港口CaM-binding网站(27,28]。我们的观察是依照Leclerc和检查者的研究指出^76年RGLSRLFSSFLKRPKS肽作为Ca^{2 +}端依赖凸轮绑定序列在右投手27,28)(图5)。4.1 r的化学计量学^135年绑定到凸轮的Ca^{2 +}1:1的石英晶体微量天平(药物)方法。这些结果表明,Ca^{2 +}/ CaM结合惠普地区而不是30 kDa域(29日]。

2.6。4.1 r的监管^135年Ca与膜蛋白的相互作用^{2 +}/ CaM

4.1 r的亲和力^135年带3 cyt由Ca下降了近两个数量级^{2 +}/ CaM。此外,钙^{2 +}/ CaM完全废除4.1 r的能力^135年绑定到GPCcyt或者过去。要么5μ凸轮或100μM Ca^{2 +}单独绑定关系上没有影响。4.1 r^135年绑定到乐队3 cyt开始下降(Ca^{2 +}]_我大于10 nM (pCa < 8)与最大抑制,享年100岁μ米(pCa > 4)。[Ca最大绑定是观察到一半^{2 +}]_我3.2μ米(pCa = 5.5)。在4.1 r^80年、钙^{2 +}/ CaM绑定到30 kDa域降低10倍左右的亲和力乐队3。因此,我们指出4.1 r之间的显著差异^135年和4.1 r^80年在Ca^{2 +}依赖绑定这两种亚型的凸轮。与Ca^{2 +}独立绑定的凸轮4.1 r^80年凸轮绑定到4.1 r^135年强烈Ca^{2 +}相关的。这种差异再次直接归因于惠普地区出现在4.1 r^135年。重要的是,与乐队3和GPC不直接绑定到惠普的地区,这一地区本身结合在Ca凸轮^{2 +}端依赖的方式。因此,必须推断,CaM-binding网站惠普地区占主导地位的结合位点的凸轮4.1 r^135年这个网站阻止了绑定的凸轮Ca^{2 +}独立的结合位点在4.1 r^80年。此外,我们发现凸轮大大减少4.1 r的绑定^135年在Ca乐队3^{2 +}端依赖的方式,并破坏其绑定到GPC和过去有影响这4.1 r同种型早期成红血球细胞的功能。事实上,虽然低水平的Ca^{2 +}在早期成红血球细胞会导致膜协会通过的高亲和性与乐队3,增加水平的Ca^{2 +}在红细胞分化将导致的蛋白质膜的位移和可能退化成红血球细胞的同种型和损失。我们的研究结果,在早期成红血球细胞,4.1 r的一小部分^135年实际上是与膜相关的现象支持了这一假说(29日)(图6)。引人注目的是,在人类成红血球细胞培养7天,1毫米EGTA处理4.1 r^135年更清楚地分布在或接近等离子体膜比在参与细胞(图7)。精确的定量测量^{2 +}水平成红血球细胞在成熟的不同阶段,需要进一步验证这一假设。

3所示。第二部分:4.1 r^135年和4.1 g成红血球细胞

4.1 r^135年和4.1克同时表示成红血球细胞和nonerythroid细胞如上皮细胞(42,43]。30 kDa的结构域(丰贸)4.1 r和4.1 g非常相似。到目前为止,没有任何报告4.1 r之间的功能差异^135年和4.1 g。我们展示了第一次绑定的差异这两个4.1蛋白质膜蛋白。

3.1。结构相似性4.1 r^135年和4.1克

的主要氨基酸序列30 kDa域的4.1 g是71%相同的4.1 r (42)(ID: O43491)。4.1 g因此预测绑定到许多以前确认4.1 r约束力的合作伙伴。与30 kDa的高保护领域,惠普的氨基酸序列的身份地区为4.1 g和4.1 r^135年很低(35%)。因此我们推测,惠普的4.1 r和4.1克地区可能调节不同的绑定属性各自30 kDa域。

计算机分析的三维结构30 kDa域的4.1 g证明其折叠clover-like结构非常类似于4.1 r (41)(图8)。这个观察验证4.1 g的结构性基础绑定之前定义4.1 r绑定合作伙伴通过其30 kDa域。作为30 kDa域观察4.1 r, 4.1 g也可能与凸轮在Ca^{2 +}独立的方式。

使用组合计算的计算(旨在计算障碍的概率基于PrDOS软件分析),sds - page分析和尺寸排阻色谱法,我们建立了,像惠普的4.1 r,惠普的4.1 g地区采用非结构化状态(41]。从他们的相似的结构,如预期R30和G30都是折叠的多肽,这30 kDa地区代表唯一的结构化(折叠)域为蛋白质41]。

3.2。4.1 g和4.1 r的表达^135年在成红血球细胞

在成红血球细胞,4.1克和4.1 r表达基因产品,而另外两个4.1 4.1 4.1 b和n,不是(个人通信,Narla莫汉达斯·,纽约血液中心)。4.1 g表示后7 - 12天的文化~ 70 kDa包含惠普地区同种型。这表明可变剪接事件的发生针对域下游惠普地区(丰贸领域,spectrin-actin绑定域和/或c端域)在4.1 g。

3.3。不同的绑定配置文件4.1 r^135年和膜蛋白4.1克

4.1 g结合IOVs准备从红血球膜。明显的值4.1 g丰贸领域(G30)和全长4.1 g绑定IOVs 169±67 nM和207±49 nM,分别作为评估Scatchard情节分析。这些值与获得使用共振镜检测(41]。这些发现表明,4.1 g可以绑定到红细胞膜的跨膜蛋白通过其30 kDa域。

4.1 g相互作用在体外和乐队3 cyt GPCcyt在~ 200 nM范围内。重要的是,4.1 g的结合亲和力乐队3 cyt GPCcyt不同于4.1 r^135年尽管惠普地区两个蛋白的存在。因此,4.1 g与乐队3 cyt亲和力远低于4.1 r^135年,反向GPCcyt被观察到。这些差异主要源自于不同的速率常数。相比之下,4.1克和4.1 r^135年与过去相似的亲和力(44]。

绑定的全长4.1 g上的相似之处和30 kDa的域(G30)上述膜蛋白非常相似,这表明4.1 g与约束力的合作伙伴主要通过G30,帽子的GHP对这些相互作用有一个微不足道的影响。这是形成鲜明对比的交互30 kDa域4.1 r (R30)由右投手显著影响29日]。有趣的是,重组嵌合体蛋白质组成的右投手和G30 (RHP-G30)或GHP R30 (GHP-R30)显示出类似的结合亲和力G30和R30。这意味着显著差异在右投手和GHP的结构和功能。应该注意的是,无论是GHP还是右投手绑定到这些膜蛋白。

我们展示了惠普地区一个重要的角色在调节4.1 r^135年30 kDa域绑定到膜蛋白。因此,惠普N-lobe乐队3的地区提高可访问性,但会损害的可访问性α叶GPC而C-lobe上没有显著的影响(29日]。4.1 g惠普并没有调节的可访问性三个叶G30各自约束力的合作伙伴,绑定的4.1 g G30相似。

我们先前表明,4.1 g结合各种特征4.1 r约束力的合作伙伴,包括跨膜蛋白带3,GPC,和过去,通过其30 kDa域。惠普域并不影响这些交互。然而,Ca^{2 +}端依赖凸轮绑定到惠普的地区有深远的影响4.1 g与约束力的合作伙伴之间的交互。4.1 g的记录绑定配置文件是明显不同于之前报道为4.1 r^135年(29日]。自30 kDa的主要结构域为4.1 g和4.1 r是高度保守的序列相似性)(71%,绑定配置文件可能出现的差异主要来自nonconserved惠普地区。

3.4。异同的凸轮绑定到惠普和30 kDa域4.1 r和4.1 g

全长4.1 g和GHP绑定到一个凸轮琼脂糖4 b列在Ca^{2 +},可以用5毫米EGTA筛选了。的凸轮绑定到4.1 g和GHP Ca螯合后就显著增加^{2 +}用EGTA。这些发现证明凸轮结合4.1 g惠普地区Ca^{2 +}端依赖的方式。这些数据概括以前的观测为凸轮绑定右投手和4.1 r^135年(29日]。4.1 g的亲和力^{2 +}~ 10 nM / CaM,化学计量学是~ 1:1 (41]。这个观察强烈支持惠普地区协调的重要性^{2 +}端依赖凸轮绑定到4.1 g。

然而,尽管凸轮结合惠普地区4.1 g的Ca^{2 +}端依赖的方式,它不绑定到4.1 g 30 kDa领域,正如前面记录4.1 r^80年(38]。惠普的4.1 g地区包含一个序列^71年RGISRFIPPWLKKQKS 76%相同(13/17残留物)在惠普CaM-binding站点地区4.1 r (S^76年RGLSRLFSSFLKRPKS) [27,28]。尽管Ca^{2 +}独立CaM-binding序列之前30 kDa域确定的4.1 r^80年是守恒的4.1克(41),我们的研究结果表明,凸轮结合惠普区域而不是30 kDa域的4.1 g。应该强调,虽然惠普本身不会影响4.1 g的30 kDa域绑定到不同的膜蛋白,Ca^{2 +}/ CaM结合惠普明显抑制30 kDa域的4.1 g的能力与它的各种绑定合作伙伴交互。这些发现使我们文档的结构和功能性质异同4.1克和4.1 r^135年。

3.5。Ca^{2 +}/ 4.1 g CaM-Dependent监管约束力的膜蛋白

我们已经表明,Ca^{2 +}/ CaM绑定到4.1 g结果的帽子在一个完整的抑制4.1 g绑定乐队3 cyt过去和显著增加4.1 g GPCcyt绑定。凸轮的事实结合30 kDa域4.1 r^80年在缺乏Ca^{2 +}凸轮约束力的减少Ca的R30约束力的合作伙伴^{2 +}端依赖的方式(17,44),我们检查了凸轮的影响在其绑定属性绑定到G30使用RHP-G30膜蛋白嵌合体蛋白质。结合亲和力的RHP-G30乐队3 cyt GPCcyt,过去,CD44cyt以Ca的存在与否^{2 +}和凸轮。的为每个绑定获得合作伙伴没有凸轮是类似获得全长4.1 g。相比之下,结合化验与RHP-G30 preincubated Ca^{2 +}/ CaM显示主要的亲和力下降(7 - 10倍)的RHP-G30乐队3 cyt GPCcyt和过去。这些结果表明,尽管凸轮可以绑定独立G30的Ca^{2 +}G30与膜蛋白的相互作用可以由凸轮在Ca^{2 +}端依赖的方式。这些结果还表明30 kDa域绑定属性的规定展开惠普领域具有独特的特性在4.1 r^135年和4.1 g。

Ca^{2 +}浓度依赖性CaM-modulated交互的4.1 g和乐队3 cyt GPCcyt已经证明(38,44]。4.1 r的最大约束力的一半^135年和4.1 g带3 cyt GPCcyt发生在Ca^{2 +}在submicromolar浓度范围(39,40),支持我们的生化研究的潜在生物相关性(29日]。Ca^{2 +}/ CaM-dependent调节4.1 r^135年和4.1 g绑定之后,膜蛋白可以触发信号转导在红色的发展。事实上,它已经记录,在红细胞生成的早期阶段,细胞内钙含量从基础水平的增加55±5 nM 259±49海里后绑定的红细胞生成素受体(39]。这样的细胞内钙含量的增加足以调节4.1 r之间的交互^135年和4.1 g在红色的细胞其约束力的合作伙伴。我们的研究结果进一步表明,4.1 g提供了一个独特的机会来探索蛋白质结构和功能的差异在进化和发展。在成红血球细胞,我们表明,与先前的报告相一致(42,43),4.1 g和4.1 r^135年都表达了在终端红细胞分化和蛋白质可以与常见的跨膜蛋白,如乐队3、GPC和过去。不同的结合亲和力和Ca^{2 +}/ CaM-dependent调制与乐队3和GPC表明这些4.1蛋白膜生物起源中扮演特定的角色在终端红细胞分化(图9)。

因此,非结构化惠普域4.1 r和4.1 g似乎发挥独特的作用在调节这些蛋白质的membrane-binding属性。理解差异和相似之处的结构基础4.1绑定属性将帮助我们揭开小说各种4.1基因产物的生物功能。为此,我们正在实施一个HP-Ca的结构分析^{2 +}/ CaM复杂使用核磁共振和小角x射线散射(粉煤灰)。这些生物物理分析有助于我们进一步了解的监管作用的结构基础非结构化惠普域。

4所示。结论

在红细胞生成,惠普域作为一个监管机构4.1 r和4.1 g与质膜的交互。我们假设这些监管部分属性的结果非结构化惠普地区的构象。我们还表明,这些监管性质取决于细胞内钙浓度,与这些不同浓度在红细胞生成。因此,惠普的功能域可能会发展根据4.1的结构蛋白亚型表达红细胞生成的每个阶段。

5。未来的研究在4.1 r^135年和4.1克

本文的结构和功能氨基内在无序地区(HP)和membrane-binding丰贸域4.1 r^135年和4.1 g和Ca的角色^{2 +}通过凸轮在调节与膜蛋白结合。我们的研究结果是基于在体外绑定化验。这些交互及其直接证据规定在活细胞还有待建立。尽管众所周知,右投手包含磷酸化网站(28,45),Ca之间的关系^{2 +}/ CaM监管和磷酸化还有待调查。4.1 g结合血影蛋白/肌动蛋白(46,47)和受体通过c端地区(48,49]。Ca^{2 +}/ CaM结合惠普也调节这些交互?回答此类机械的问题将帮助我们定义4.1 r的生物学意义^135年和4.1 g红细胞生成的后期阶段。

附录

表1和2总结4.1 r^135年和4.1 g绑定动力学参数的胞质尾带3和GPC和凸轮Ca的存在或缺乏^{2 +}。尽管4.1 r^135年和4.1 g绑定到Ca^{2 +}~ 10 / CaM⁻⁸米范围,4.1 r^135年绑定到凸轮是5倍4.1 g在缺乏Ca^{2 +}。这些结果表明,4.1 r和4.1 g的绑定配置文件对凸轮可能有所不同。

缩写

4.1 g:	蛋白质4.1克
4.1 r80年:	80 kDa人类红细胞蛋白质4.1
4.1 r135年:	4.1 135 kDa人类成红血球细胞蛋白质
带3 cyt:	胞质域的乐队3
凸轮:	钙调蛋白
CD44cyt:	CD44的胞质域
丰贸,四人:	Ezrin、Radixin Moesin
G30:	30 kDa膜绑定域蛋白质4.1克
GHP:	帽子的蛋白质4.1克
GHP-G30:	GHP和G30的融合蛋白
GPC:	血型糖蛋白C
GPCcyt:	胞质域的GPC
惠普:	4.1蛋白质的氨基端头片地区
IOVs:	Inside-out-vesicles人类红细胞
:	离解常数平衡
R30:	30 kDa域蛋白质4.1 r
右投手:	盔的蛋白质4.1 r
RHP-R30:	融合蛋白的右投手和R30
RHP-G30:	右投手和G30嵌合体蛋白质。

承认

这项工作是支持部分由教育部科学研究补助金文化、体育、科学和技术的日本15570123 w . Nunomura。

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