PAI-1表达式需要HDACi-Induced增殖抑制拉改变肾上皮细胞

文摘

哺乳动物细胞的恶性转化拉家庭致癌基因导致戏剧性的变化在细胞结构和增长特征。平v-K回复突变体——的生成拉改变肾细胞暴露于组蛋白脱乙酰酶抑制剂丁酸钠(NaB)曾发现依赖转录的激活PAI-1 (SERPINE1)基因(编码1型抑制剂尿激酶和组织类型的纤溶酶原激活物物)。NaB-initiated PAI-1表达式之前诱导细胞扩散和进入G₁逮捕。评估的相关性PAI-1感应增长逮捕这个细胞系统中更关键的是,两种互补的方法。添加一个稳定、长半衰期,重组PAI-1突变PAI-1-deficient v-K -拉- / c-Ha拉-transformants或PAI-1功能空NaB-resistant 4 hh细胞(由反义击倒PAI-1 mRNA转录)导致显著白细胞郁滞NaB的缺失。的转染拉转化细胞与Rc / CMVPAI表达式构造,此外,显著提升本构PAI-1合成(10 - 20倍),相应的增殖率。这些数据表明,高层PAI-1表达抑制长期的增长拉癌基因转化细胞和可能NaB暴露的主要抑制细胞生长的效应。

1。介绍

组蛋白乙酰转移酶(帽子)转移乙酰基乙酰辅酶a到特定的赖氨酸残基的氨基末端组蛋白形成“尾巴”ε-N-acetyl赖氨酸促进“开放”或放松的染色质结构。几个转录辅活化因子,包括海关与边境保护局/ p300和SRC,有内在的帽子活动(1,2]。组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac),相比之下,催化乙酰基的去除目标赖氨酸(3,4)创建一个凝聚,转录压抑,染色质组织(5]。各种HDAC抑制剂(HDACi),一些或多或少表现出特异性的个别成员四类(I-VI)人类HDAC [6,7]。

的主要作用方式HDACi(即。,the transcription-dependent mechanism) [5影响基因重组由于HDACi类型、浓度和暴露时间(8,9]。最近估计HDACi-impacted基因的数量在2 - 10%的总表示,其中一些消极的调节细胞周期进展(10- - - - - -13p21)等^{WAF1 / CIP1}和纤溶酶原激活物抑制剂1型(PAI-1;SERPINE1) [14- - - - - -21]。PAI-1尤为相关的在这种情况下,因为这SERPIN复合物与尿激酶(uPA)和组织类型(tPA)纤溶酶原激活物物限制pericellular血纤维蛋白溶酶生成有效衰减uPA - / plasmin-dependent生长因子激活和细胞增殖反应(22,23]。PAI-1,事实上,是两个必要和充分p53-dependent增长逮捕[23- - - - - -26)和所需TGF -β1-mediated抗增殖作用在人类角质细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(27]。激活拉或英国皇家空军致癌基因触发senescence-like增长逮捕程序的启动,PAI-1感应,在几个细胞类型(28- - - - - -31日]。至少有一些细胞转变为慢性致癌的结果拉表达式,逃跑拉全身的衰老也可以进行增殖抑制在接触某些HDACi(例如,丁酸钠;与伴随的高层PAI-1感应(NaB)16,17,32]。现在还不知道,但是,如果HDACi-associated增长无限增殖的抑制作用拉-transformants,如入口正常细胞的复制衰老(23),还需要PAI-1-induction。

本文详细的参与PAI-1表达式在HDACi-induced增长限制在几个特征v-Ki -拉和Ha -拉^val-12改变上皮细胞系(15,16]。NaB被选为本研究这个HDACi PAI-1表达的有力刺激器(14,20.]和白细胞郁滞[16在拉改变肾细胞。NaB-mediated增长抑制在PAI-1击倒(即不明显。,anti-sense) cells, but the HDACi-dependent proliferative block could be rescued by vector-driven PAI-1 overexpression.

2。材料和方法

2.1。文化环境和基因工程细胞

各种各样的拉本研究改变肾上皮细胞系中使用(15,16)生长在无血清DMEM(至少在这项研究中使用的短时间内;3 - 5天)促进proliferation-modulating NaB的影响评估(1 - 10毫米)和外源性PAI-1(0.02 -100海里突变14-1B稳定,小时;N150H、K154T Q319L M354I) (33在存在和缺乏的边后卫。的推导PAI-1功能(PAI-1零击倒^KD)4 hh细胞系,转染的老鼠PAI-1 2.6 kb生态R1 /欣dIII cDNA片段(代表核苷酸−118 + 2572)克隆在反义方向(Rc / CMVIAP)被描述(34,35]。v -拉转化细胞也被转染与Rc / CMVPAI感觉向量启动高级PAI-1表达式没有逮捕或空Rc /巨细胞病毒构建[32]。耦合在体外转录/翻译化验证实,全身免疫反应性的PAI-1蛋白质合成使用Rc / CMVPAI向量作为模板(35]。在某些情况下,Rc / CMVPAI转染子选择用G418 [32]。克隆策略和细胞系中详细推导文本。c-Ha -拉oncogene-expressing人类HaCaT与角质细胞是前面描述的33,36]PAI-1-deficient和重建肾细胞系(35]。

2.2。Northern

细胞质RNA分离在变性1%琼脂糖电泳/ 2.2 M甲醛凝胶,转移到硝基和墨迹杂化³²老鼠PAI-1 cDNA P-labeled EcoRI-HindIII片段(具体活动1 - 2×10⁸cpm /μg DNA) 48小时在4°C。重组pBluescript (SK (-) phagemid pRPAISS1-3,包含3.0 kb EcoRI / PAI-1 SstII-flanked cDNA插入编码,用于隔离的pRPAImr1-4探针用于杂交。短暂,pRPAISS1-3消化EcoRI / 1小时后三世在37°C和碎片在1%琼脂糖凝胶分离。与溴化乙锭染色后,乐队代表PAI-1 cDNA插入被切除,electroeluted。这插入片段(pRPAImr1-4)贴上³²P-dCTP随机启动。杂交后,膜清洗顺序各20分钟2 x SSC / 0.1% SDS(两次),然后在1 x SSC SDS / 0.1%, 55°C。

2.3。提取代谢标记细胞和凝胶电泳

生长媒体(35 mm直径。文化)吸气,细胞洗两次与哈佛商学院和1毫升的标签中(的边后卫和methionine-free RPMI 1640中包含50μCi³⁵S-methionine(具体活动= 1100 Ci /更易)添加到每个文化。6月底人力资源标签,底物adherent-enriched (SAP)细胞收集一部分,阐明在13000×g和可溶性裂解缓冲(9.8 M尿素,2%诺乃清洁剂p 40,两性电解质2%,和100毫米二硫苏糖醇)(37]。一维凝胶分离之前一样详细(38]。二维凝胶电泳,cpm 50000³⁵S-methionine-labeled蛋白质被加载到预试1.5毫米直径管凝胶(9.1 M尿素,2%诺乃清洁剂p 40, pH值6% 5 - 7两性电解质,pH值3 - 10两性电解质1.2%,4%的丙烯酰胺/ bisacrylamide等电点聚焦(18)人力资源分离之前在sds - 10%丙烯酰胺板凝胶(39]。个别蛋白质斑点映射和量化Bio-Image调查员二维电泳分析系统界面的SUN SPARC工作站(40]。

3所示。结果

3.1。PAI-1归纳在v -拉在接触HDACi NaB改变肾细胞

之前有限的表达分析表明PAI-1 NaB-upregulated基因的是最丰富的拉改变肾上皮细胞(14,15)符合芯片和生物信息学分析的遗传网络响应NaB在结肠上皮细胞(20.]。一维电泳(图1(一)),northern(图1 (b)(图),二维蛋白质组映射1 (c)),此外,证实了显著而选择性PAI-1感应NaB-stimulated v -拉-transformants(涉及50-kD和成熟52-kD糖化PAI-1物种),使用一维/二维流动和免疫化学识别判据,建立了之前(16,38,41),相对于无法探测PAI-1水平控制v -拉人群。PAI-1 upregulation与著名NaB-associated G₁逮捕增加细胞大小(图2)和浓度增殖抑制导致63%(图3(一个)(图)和48%3 (b)采用无血清)减少人口密度和10% serum-supplemented介质,分别(总结在图4)。总的来说,这些发现(数字1和4v -)是一致的结论拉-transformants,逃避拉oncogene-initiated细胞衰老(29日,42,43)本质上是PAI-1 null。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图1

³⁵ 拉 拉 拉 ³⁵ 拉 电泳的S-methionine-labeled saponin-resistant (SAP)蛋白质的v -改变肾细胞和NaB-treated同行表明PAI-1 (50-kD和全糖化52-kD物种)表示在NaB回复突变的但不是在未经处理的细胞(a)。PAI-1从正常肾细胞(grameen bank)作为标记。上面的乐队PAI-1 v -细胞(62 - kd)是高度糖形式的骨桥蛋白(a)。Northern证实没有PAI-1 mRNA在v --transformants和恢复mRNA表达回应NaB (b)。二维电泳映射来自SAP的一部分蛋白质S-methionine-labeled文化透露,此外,PAI-1感应响应NaB治疗,而选择性(c)。地图位置的糖化PAI-1亚型(固体红色空心矩形)表示。蛋白质细胞类型之间的共同强调的颜色(紫色,红色虚线框,蓝色椭圆表明波形蛋白和phosho-vimentin细分产品和肌动蛋白的黑色箭头),没有丰富的变化,尽管重要的v - PAI-1感应明显/NaB蛋白(c)。

图2

拉 ₁ NaB的影响在v -细胞周期进程转化株。指数增长的s阶段分数(10%的边后卫)细胞近似> 34%,紧意味着细胞大小分布(意思是:频道80)评估的前进角光散射(歧视)测量。NaB治疗导致了G块(即使在FBS-supplemented介质)和平均直径明显增加。

(一)

(b)

(一)
(b)

图3

NaB抑制细胞生长在无血清或补充文化条件。增生性限制在10毫米导致最终最大人口密度仅为47% (a)和(b) 52%相比各自的控制。数据绘制是一式三份的平均值±标准偏差的评估最终的细胞密度(即。,每个NaB % confluency)浓度下两个生长条件。

图4

拉 2 摘要NaB-induced表型在v -的特性改变肾上皮细胞。NaB发起快速白细胞郁滞明显接触后3天内收购增加cell-spread面积与歧视评估细胞的大小(即一致。,图)。细胞保持增长逮捕甚至长期治疗后(例如,46天)虽然这种长期的文化有一个双核频率增加。PAI-1 mRNA /蛋白表达在控制人口很低检测不到的水平相比PAI-1 NaB转录和蛋白质明显反应。情节说明一式三份的平均值±标准偏差评估每个参数的评估。

3.2。增长逮捕拉-Transformants恢复由外生暴露在一个很长的半衰期PAI-1突变或PAI-1 Vector-Driven重建的表达式

由于靶向抑制PAI-1导致绕过复制衰老和TGF -β全身的增长逮捕[23,27),确定很重要exogenously-delivered PAI-1同样可以在调节PAI-1-deficient的增殖反应拉转化株没有逮捕。的长半衰期PAI-1重组突变体(PAI-1 14-1B) v -有效地抑制增长拉转化细胞浓度的方式减少80%的最终人口密度后5天暴露在100 nM PAI-1(图5(一个))。事实上,文化接触的生长抑制水平20 nM PAI-1(减少45%人口密度相对于对应的控制)(图5(一个)减少)近似47.5%由10毫米NaB甚至在血清的存在(图4(b))。哈哈- - -拉改变HaCaT细胞表达低水平的PAI-1针对表皮生长因子(33),增长也被暴露在PAI-1 14-1B的边后卫或EGF(人物的存在5 (b)和5 (c))很大程度上是由于G₁被捕(图5 (c))。评估这种影响更关键的是在遗传背景下,反义击倒(PAI-1^KD;(图4 hh)细胞6(一)),这是抵抗NaB-dependent增殖抑制,在PAI-1-supplemented孵化中有或没有逮捕。PAI-1重组,最终浓度20 nM,有效地抑制PAI-1^KD细胞增殖;PAI-1 + NaB的结合的程度没有显著影响白细胞郁滞而独自PAI-1(图6 (b))。瞬态vector-driven表达PAI-1 Rc / CMVPAI v -拉转染子(图6(一))同样减少了细胞生长相对于细胞转染空Rc /巨细胞病毒构造(图6 (b))。Rc / CMVPAI-expressing细胞的质量文化,特别是G418-selected克隆分离,但不是细胞转染与Rc /巨细胞病毒没有2.6 kb PAI-1 cDNA插入,有相当数量的增长的传播细胞(一个标志逮捕在肾上皮细胞表型14- - - - - -16Rc /巨细胞病毒种群相比)。标志着细胞增殖减少(图6 (b))和增加传播Rc / CMVPAI相比Rc /巨细胞病毒转染子与一个大约22倍增加PAI-1表达式。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图5

拉 ₁ 浓度增加PAI-1(范围0.02 - 100 nM) v -有效地抑制增长采用无血清-transformants (a)以及serum-supplemented (b)媒体。在(b), PAI-1被添加到最后一个级别的20海里。PAI-1也抑制EGF-induced HaCaT扩散,评估结晶紫染色的细胞与EGF刺激(10 ng / mL) 5天没有或存在PAI-1 (c)(20海里)。增长逮捕EGF-treated HaCaT角质细胞反映PAI-1-induced G块明显早在24小时后添加PAI-1相比突出s阶段人群的边后卫——或者控制EGF-treated文化(d)。开始静止人口在无血清培养基(1天)几乎没有DNA-synthesizing细胞。

(一)

(b)

(一)
(b)

图6

^KD 拉 5 PAI-1反义和意义表达向量被用来生成PAI-1击倒(4 hh;PAI-1)和overexpressing (Rc / CMVPAI)细胞系,分别(a)。PAI-1-deficient 4 hh细胞抵抗NaB-mediated白细胞郁滞逮捕PAI-1-induced增长但仍敏感。NaB的组合+ PAI-1最终减少人口密度相似PAI-1独自文化(b)。Vector-driven PAI-1超表达在v -转化株也抑制细胞生长与结果一致PAI-1再添加实验(例如,图)。数据绘制表示一式三份的平均值±标准偏差的评估最终的细胞密度(即。,% confluency)。

4所示。讨论

微阵列的数据挖掘和基因表达谱的连续分析确定PAI-1水平的特点具体增长逮捕状态(例如,23,27,35,36,39,42- - - - - -46])。类似于其他HDACi-regulated基因,其中一些消极的调节细胞周期进展(10- - - - - -13],PAI-1是一个特别有关候选人SERPIN变弱uPA - / plasmin-dependent生长因子活化和细胞增殖反应(22,23),调和p53-dependent白细胞郁滞[23- - - - - -26),需要TGF -β1-mediated抗增殖反应(27]。细胞中表达激活拉或英国皇家空军此外,致癌基因诱导PAI-1发起的订婚senescence-like表型(28- - - - - -31日),对于那些细胞逃脱拉全身的衰老,逮捕程序可以“拯救”在接触某些HDACi(例如,NaB)伴随高层PAI-1感应(16,17,32]。而分子事件潜在NaB-stimulated PAI-1表达不清楚,NaB提高Smad3磷酸化并强化TGF -β全身PAI-1表达式(47),伴随NaB-induced G₁逮捕[48]。事实上,过度的SMAD3 v-Ha -拉转换角化细胞诱导抑制细胞生长的反应,刺激PAI-1启动子(3 tp-lux记者)端依赖转录,和衰老的发病率增加上皮细胞(49]。目前的研究结果是一致的与这些TGF -和以前的数据β启动增长抑制以及衰老逮捕PAI-1-dependent [23,27此外,)并建立PAI-1 NaB-initiated中介的白细胞郁滞。这种反应是否可以用于指导人类癌症的“衰老疗法”,还有待评估。

NaB移植细胞周期抑制剂p21^{WAF1 / CIP1}和p16^INK4A人类成纤维细胞虽然p21的目标中断只弱影响HDACi-induced senescence-like增长逮捕。p53^−−/小鼠胚胎成纤维细胞(mef),此外,对NaB-initiated白细胞郁滞表明这个肿瘤抑制衰老是一个主要的决定因素在mef (50],NaB-mediated人类黑色素瘤细胞凋亡是p53-dependent [51]。nutlin-3, MDM2抑制剂在肿瘤细胞恢复p53功能,保留野生型p53,配合几个HDACis(包括NaB)在p53诱导细胞死亡野生型肿瘤细胞系而不是p53-null曲泽前列腺癌可能由HDACi-induced p53 hyperacetylation和/或MDM2 /[差别MDM4对这些52]。这可能是依赖,部分NaB p53表达增加反应的程度(53]。同样,NaB-stimulated p53转录活动开始不可逆转的G₁/ S细胞周期阻滞在c-Ha -拉改变了老鼠胚胎成纤维细胞p53的野生型,但与一个灭活细胞p53 [54]。虽然p21的实际贡献和INK4A / ARF-encoded基因(如p19) NaB-induced增长逮捕是不确定的55,56],p53的作用(至少在mef)可能更贴切,因为需要p53 PAI-1表达式和增长逮捕(见[27,57];在准备和Overstreet et al .,)。p53的地位,因此,可能是一个主要的方面HDACi-induced通过其转录控制PAI-1和细胞周期阻滞,从而PAI-1-dependent白细胞郁滞。

承认

这项工作是由美国国立卫生研究院的资助GM57242支持。

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