Rac1和Stathmin但不是EB1所需入侵IGF-I乳腺癌细胞的反应

文摘

细胞迁移是必要的入侵,伴随定向细胞突起称为板状伪足的形成。在浸润性乳腺癌mda - mb - 231细胞,板状伪足的形成是之前易位的肌动蛋白细胞骨架调节蛋白WAVE2前缘。WAVE2易位和板状伪足的形成需要许多信号分子,包括PI3K Rac1, Pak1, IRSp53, stathmin, EB1,但这些分子是否必要入侵仍不清楚。在非侵入性乳腺癌MCF7细胞,没有板状伪足被IGF-I诱导,而mda - mb - 231细胞,Rac1 stathmin, EB1过表达。损耗Rac1或由小型干扰RNA废除stathmin IGF-I-induced mda - mb - 231细胞的入侵;然而,EB1不枯竭,表明Rac1的必要性及stathmin但不是EB1入侵。导致细胞入侵的信号通路可能不是相同但股票一些常见的分子,导致细胞迁移通过板状伪足的形成。

1。介绍

细胞突起如板状伪足的形成前缘的迁移细胞是由黄蜂/波家族的肌动蛋白细胞骨架调节蛋白WAVE2 [1- - - - - -3]。板状伪足形成之前,WAVE2转移到前缘沿着微管(4- - - - - -6),它是由许多信号分子和监管。与IQGAP1 WAVE2形式复杂,马达蛋白kinesin1 [6,7],Pak1 [8],IRSp53 [9在静止细胞的细胞质和收集额外的IQGAP1 kinesin1 [6),释放rac1 -视频- 170复杂(7),与胶质瘤细胞刺激后或IGF-I。与此同时,WAVE2-bound Pak1 Rac1-dependently激活,进而能灭活stathmin, microtubule-destabilizing蛋白(10,11),通过磷酸化(8]。Stathmin是蛋白质结构上与microtubule-end-binding EB1 [12),磷酸化stathmin-EB1复杂招募到微管结束后,熊WAVE2复杂IGF-I刺激(8]。易位后前缘,WAVE2 PtdInsP捕捉到₃通过WAVE2-bound IRSp53 [13]。PtdInsP₃是由PI3K IGF-I受体IGF-IR附近局部激活膜地区面临IGF-I [13]。这些结果表明,许多信号分子和监管,包括IGF-IR PI3K, Rac1, Pak1, IRSp53, stathmin,和EB1参与诱导迁移细胞的定向板状伪足的形成。然而,这些分子,是否除了WAVE2 [14),是至关重要的入侵mda - mb - 231细胞仍不清楚。

我们报告Rac1, stathmin, EB1在浸润性乳腺癌mda - mb - 231细胞相比,非侵入性乳腺癌MCF7细胞。在MCF7细胞,没有诱导板状伪足的形成,并通过IGF-I Rac1没有激活。其他分子的表达和激活细胞系之间没有显著差异。Rac1枯竭和stathmin但不是EB1 IGF-I-induced的RNA干扰导致显著抑制mda - mb - 231细胞的入侵。stathmin,这些结果表明,Rac1和EB1在侵入性mda - mb - 231细胞,而Rac1和stathmin但不是EB1所需IGF-I入侵的细胞反应。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人乳腺癌mda - mb - 231和MCF7细胞获得美国类型文化集合(马纳萨斯,弗吉尼亚州)和维护(如前所述9,13]。在刺激50 ng / mL IGF-I (Peprotech、伦敦、英国),细胞被孵化serum-starved介质中含0.1%的边后卫16 h。

2.2。板状伪足形成和WAVE2易位化验

细胞生长在载玻片钱伯斯(BD猎鹰,贝德福德,MA)沾rhodamine-phalloidin(表达载体,卡尔斯巴德,CA)或anti-WAVE2抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。量化的板状伪足的形成和WAVE2易位,细胞的频率与板状伪足或前缘WAVE2染色的细胞数(如前所述6,8,9,13]。

2.3。细胞入侵检测

细胞进行入侵检测,使用入侵室(24-well 8 -μ米孔隙大小;BD生物科学,贝德福德,MA)。细胞中含有0.1%的边后卫(low-serum介质)放置在室插入膜涂层与基底膜矩阵和孵化6 h向low-serum介质包含50 ng / mL IGF-I或缺乏。通过毛孔细胞入侵和扩散室膜的底表面沾有染色的解决方案,和入侵细胞的数量在3×3毫米区域确定膜(7]。

2.4。免疫沉淀反应和免疫印迹分析

细胞细胞溶解与细胞粉碎机里帕缓冲区(6,8)和蛋白质在细胞溶解产物免疫沉淀反应和抗体p85 PI3K的亚基,Rac1(微孔,泰梅库拉,CA)和主动Rac1(莫尔文NewEast Biosciences, PA),其次是蛋白质的泥浆A-Sepharose(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。sds - page和免疫印迹过程进行详细描述(早些时候8,9,13)使用抗体IGF-IR Pak1、stathmin EB1, IRSp53(圣克鲁斯生物技术),PI3K p85, Rac1, WAVE2(微孔)。

2.5。免疫荧光分析

细胞玻片固定,permeabilized,阻塞,沾rhodamine-conjugated phalloidin或抗体phospho-IGF-IR (Tyr1135/1136) (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和WAVE2 [13]。

2.6。PI3K活动分析

PI3K活动是由免疫沉淀反应的PI3K p85 anti-p85抗体,其次是激酶反应免疫沉淀反应的酶联免疫试剂盒PI3K活动(雁行生物科学,盐湖城,UT),根据制造商的指示。

2.7。Rac1活动分析

Rac1活动与抗体以免疫沉淀反应活性形式GTP-bound Rac1 (NewEast生物科学)。免疫沉淀反应的活跃Rac1进行集中细胞溶解产物4 - 8倍总Rac1相比。免疫沉淀反应受到sds - page和免疫印迹anti-Rac1抗体。

2.8。RNA干扰试验

细胞培养与50 nM的不匹配负控制小干扰RNA (Dharmacon)或两个不同的小干扰RNA Rac1, stathmin或EB1(表达载体)48 h使用RNAiMAX(表达载体)。人类的目标序列Rac1 (Rac1) stathmin (STMN1) [8],EB1 (MAPRE1) [13)使用5′-CACCTCAGGATACCACTTTGCACGG-3′(Rac1-1) 5′-TATCCCATA-AGCCCAGATTCACCGG-3′(Rac1-2) 5′-TTGACCGAGGGCTGAGAATCAGCTC-3′(stathmin-1) 5′-CTTTCACCTGGATATCAGAAGAAGC-3′(stathmin-2) 5′-TGCT-AGAAGTGAGAGGTTTCTTCGG-3′(EB1-1)和5′-TTCAACTGCAGAGACTCA-TTGATCC-3′(EB-1-2),分别。细胞生存能力是决定使用现场/死亡可以解决的死细胞染色工具包(表达载体)。评估效率的小干扰RNA,相同数量的总细胞溶解产物在sds - page缓冲区被解决通过sds - page和抗体进行免疫印迹分析β肌动蛋白(Sigma-Aldrich)和Rac1、stathmin或EB1。

2.9。统计分析

一式三份的平均值之间的统计学意义使用未配对学生的分析计算t以及。数据被认为是重要的P值小于0.05。

3所示。结果

3.1。不同表型的入侵和板状伪足形成mda - mb - 231和IGF-I MCF7细胞反应

确定的细胞能力板状伪足的形成和入侵响应IGF-I,我们为板状伪足的形成进行了化验,WAVE2易位,mda - mb - 231细胞入侵和MCF7细胞。Phalloidin染色的细胞显示框架构成的静止的mda - mb - 231细胞后被重新安排在前缘形成板状伪足IGF-I刺激(图1(一))。相比之下,一个不错的f -肌动蛋白网络在静止MCF7细胞的细胞质形成的框架或构成的不同地方聚集后的细胞外围IGF-I刺激(图1(一))。虽然板状伪足的频率在mda - mb - 231细胞被IGF-I显著增加(P< 0.003),它仍然显著低MCF7细胞后IGF-I刺激(图1 (b))。同样,WAVE2易位前缘IGF-I显著提升的mda - mb - 231细胞(P< 0.0001;图1 (c))。然而,细胞外围WAVE2很低的频率在静止和IGF-I-stimulated MCF7细胞(图1 (c))。当细胞在入侵孵化室膜涂层与基底膜矩阵、均值的入侵mda - mb - 231细胞孵化后6 h对IGF-I-containing中3×3毫米地区是1382年和347年明显大于静止细胞孵化向low-serum媒介缺乏IGF-I (P< 0.004;图1 (d))。相比之下,几乎没有入侵MCF7细胞观察(12)之前或之后IGF-I刺激(10)(图1 (d))。

3.2。类似的表达和激活IGF-IR和PI3K的mda - mb - 231和MCF7细胞

澄清不同的信号通路,导致2 WAVE2易位和板状伪足形成乳腺癌细胞系,我们首先检查的表达和激活IGF-IR 0.5和6 h后IGF-I刺激。IGF-IR几乎是常数的表达水平在mda - mb - 231细胞前后IGF-I刺激,而在MCF7细胞,IGF-I刺激后下降到50%左右的静止mda - mb - 231细胞(图2(一个))。我们使用抗体进行免疫荧光试验在Tyr1135/1136 phospho-IGF-IR (p-IGF-IR)评估IGF-IR激活(15]。结果显示,p-IGF-IR局部分布在mda - mb - 231细胞的前缘IGF-I刺激后0.5或6 h(图2 (b))。在MCF7细胞,p-IGF-IR分布式的短IGF-I刺激(图后细胞突起2 (b))。这些结果表明当地激活IGF-IR的细胞系以应对IGF-I。

因为PI3K和激活的激活IGF-IR招募,我们接下来相比PI3K的表达和激活2细胞系。免疫印迹分析显示,p85亚基的表达水平PI3K在细胞系比较之前和之后IGF-I刺激(图2 (c))。PI3K活动2静止细胞系之间的可比性,而活动增加了20 - 40%的mda - mb - 231细胞MCF7细胞下降了30%在孵化IGF-I(图2 (d))。

3.3。IGF-I激活Rac1 mda - mb - 231细胞中过表达

通过PtdInsP PI3K的GTPase Rac1是激活₃绑定RacGEF (16]。确定PI3K Rac1激活信号传播,我们比较Rac1 2细胞系表达和激活。而Rac1 mda - mb - 231细胞中表达下降略igf - 1刺激后6 h,它仍然低MCF7细胞之前和之后IGF-I刺激,在29 - 43%的范围,在静止的mda - mb - 231细胞(图3(一个))。活跃的相对数量Rac1总Rac1 mda - mb - 231细胞逐渐从11%上升到14%和18%,此前IGF-I刺激0.5和6 h,分别(图3 (b))。相比之下,只有微量的Rac1激活了IGF-I MCF7细胞(图所示3 (b))。

3.4。可比Pak1的表达、IRSp53 WAVE2 mda - mb - 231和MCF7细胞

Pak1的下游效应器Rac1 [17),由与观察WAVE2 mda - mb - 231细胞(8]。而Pak1的表达水平略有减少mda - mb - 231细胞后6 h与IGF-I孵化,它仍然低MCF7细胞之前和之后IGF-I刺激,在33 - 51%的范围,在静止的mda - mb - 231细胞(图4(一))。易位前缘后,WAVE2 PtdInsP有关₃由WAVE2-bound IRSp53 [9,13]。免疫印迹分析显示,IRSp53表达式同样降低两种细胞系IGF-I刺激期间,保留可比水平(图4 (b))。WAVE2 2细胞系中的表达水平差不多,整个孵化有或没有保持几乎恒定IGF-I(图4 (c))。

3.5。过度的Stathmin和EB1 mda - mb - 231细胞MCF7细胞相比

在刺激与IGF-I mda - mb - 231细胞,激活Pak1反过来磷酸化stathmin,从而导致招聘的磷酸化stathmin-EB1复杂微管结束后,承担WAVE2复杂(13]。stathmin仍然几乎不变的表达水平在两个细胞系IGF-I前后刺激;然而,他们低MCF7细胞(22 - 26%)静止的mda - mb - 231细胞(图5(一个))。类似于stathmin, EB1 IGF-I刺激前后MCF7细胞表达水平不到30%的静止mda - mb - 231细胞(图5 (b))。

3.6。Rac1和Stathmin但不是EB1所需入侵IGF-I mda - mb - 231细胞反应

Rac1被IGF-I激活mda - mb - 231细胞而不是MCF7细胞(图3 (b))、和表达水平的Rac1 stathmin, EB1明显高于在mda - mb - 231细胞比MCF7细胞(数字3(一个),5(一个),5 (b))。探索这些蛋白质的必要性IGF-I-induced入侵mda - mb - 231细胞,我们研究了这些蛋白的抑制两种不同的小干扰rna(图6)。Rac1表达式时耗尽了Rac1-1小干扰RNA,入侵细胞的平均数量是非常小的(104)之前和之后IGF-I刺激(157),与控制文化中它被IGF-I从335增加到906。在IGF-I-stimulated细胞中,相对入侵Rac1-deficient细胞数量显著低于控制细胞(P< 0.0002)(图6(一))。同样,入侵细胞的数量是非常小的(109)之前和之后都在stathmin-deficient IGF-I刺激(109)与stathmin-1小干扰RNA转染的细胞。相比之下,入侵细胞转染的平均数控制小干扰RNA显著增加,从315年到1356年由IGF-I刺激。因此,入侵细胞的相对数量stathmin-deficient细胞明显小于IGF-I刺激后,在控制细胞(P< 0.0001;图6 (b))。与这些相反,入侵细胞的平均数量EB1-deficient静文化(574)显著高于控制静文化(312年P< 0.04)。此外,IGF-I刺激导致的平均数量显著增加入侵细胞在两种控制(1341年P< 0.005)和EB1-deficient文化(1082P< 0.02)。因此,值没有显著不同于彼此IGF-I-stimulated文化(P> 0.3;图6 (c))。

4所示。讨论

化验为板状伪足的形成、WAVE2易位和细胞入侵透露,IGF-I板状伪足形成的诱导频率显著增加,WAVE2易位,mda - mb - 231细胞入侵细胞。相比之下,IGF-I未能诱导板状伪足的形成,WAVE2易位或入侵MCF7细胞。这表明,mda - mb - 231细胞有能力入侵通过入侵室膜和MCF7细胞并不会形成板状伪足和入侵响应IGF-I。

信号通路导致板状伪足的形成通过WAVE2易位mda - mb - 231细胞是由许多分子,包括IGF-IR PI3K, Rac1, Pak1, IRSp53, stathmin, EB1 [8,9,13]。所有这些分子对于IGF-I-induced板状伪足的形成,但他们是否也需要入侵还不清楚,除了WAVE2 [14]。mda - mb - 231和MCF7细胞的比较显示,表达和激活IGF-IR和PI3K并不明显不同的前后2细胞系IGF-I刺激。这表明这两个细胞系IGF-I和生产PtdInsP回应₃,依赖PI3K。小GTPase Rac1,板状伪足的关键诱导物(18)和PI3K的下游效应(16),是由IGF-I过表达和激活mda - mb - 231细胞而不是MCF7细胞,在后者Rac1几乎被IGF-I激活。一个可能的解释为缺乏Rac1激活RacGEF MCF7细胞表达减少,但实际原因缺乏Rac1激活仍然未知的在当前的研究中。Rac1关键作用的mda - mb - 231细胞的IGF-I-induced入侵显然证明了RNA干扰测定。Rac1损耗显著抑制入侵的频率在静止和IGF-I-stimulated mda - mb - 231细胞。这表明Rac1的必要性IGF-I-induced细胞入侵细胞。过度的Rac1据报道在乳房癌(19),可能参与入侵神经胶质瘤(20.和巨噬细胞21]。

WAVE2复杂,包括Pak1 [8]和IRSp53 [9),沿微管后发生易位stathmin磷酸化和EB1-mediated绑定的磷酸化stathmin-EB1复杂的微管末端,承担WAVE2复杂(8,13]。通过磷酸化两stathmin失活(22)和EB1绑定微管的目的是促进微管强劲持续增长(23]。然而,stathmin枯竭或EB1 mda - mb - 231细胞中不同细胞的侵入性的潜在影响。Stathmin损耗显著抑制mda - mb - 231细胞的IGF-I-induced入侵,而EB1损耗没有。这表明stathmin但不是EB1对mda - mb - 231细胞至关重要入侵响应IGF-I。因为绑定stathmin-EB1复杂的微管是由EB1[结束13),不仅EB1而且stathmin绑定到微管结束可能不必要的mda - mb - 231细胞入侵。过度stathmin一直在报道乳腺癌癌、肉瘤、肝癌(24- - - - - -26),可能参与肿瘤侵犯或转移潜力(25,26]。

总之,Rac1、stathmin EB1在mda - mb - 231细胞MCF7细胞相比,不形成板状伪足和入侵响应IGF-I。在这些蛋白质,Rac1 IGF-I-induced所需和stathmin但不是EB1也mda - mb - 231细胞的入侵。这些结果表明,信号通路导致细胞入侵都是不相同的,但是股票一些常见的分子,导致细胞迁移通过板状伪足的形成。进一步调查所需的信号分子和足够的细胞入侵可能会增加细胞浸润和转移的规定的理解。

承认

作者感谢Katsuo铃木提供技术援助。

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