设计一个长期代理红细胞生成素融合三个羧基末端肽的人类绒毛膜促性腺激素亚基的N终端和C终端编码序列

文摘

促红细胞生成素是由融合设计的新模拟两个茶多糖N终端和C终端的促红细胞生成素(EPO - (CTP)₃),分别。这种模拟是在CHO细胞表达和分泌的高效。的在体外试验表明,EPO (CTP)的活动₃在TFI-1细胞增殖测定EPO-WT和商业rHEPO相似。然而,在活的有机体内研究表明,与EPO治疗一周一次(CTP)₃(15μ克/公斤)显著增加(~ 8折)血细胞压积rHuEPO相比。此外,发现EPO (CTP)₃比rHuEPO更有效和Aranesp小鼠血液中增加网织红细胞。检测到循环半衰期rHuEPO, Aranesp, EPO (CTP)₃静脉注射后20 IU是4.4,10.8,和13.1 h,分别。这些数据建立了合理使用该嵌合体作为长效促红细胞生成素模拟在诊所。的治疗疗效EPO-CTP模拟需要建立在高等动物和人体临床试验。

1。介绍

促红细胞生成素(EPO)是一种34-kDa糖蛋白激素主要由细胞产生每管状毛细血管内皮的肾脏和调节红细胞生产通过刺激红细胞生成(1,2]。促红细胞生成素合成后的肾脏增加减少组织氧化,它绑定到特定的受体在骨髓中红细胞前体导致增殖,分化,增加血球容积计(3]。生物反应与促红细胞生成素包括激活胞内信号分子,如转录因子信号传感器和激活转录(STAT)蛋白质导致细胞生长和分化。促红细胞生成素受体属于一个家庭homodimerization受体二聚作用的受体需要触发生理反应与促红细胞生成素(4- - - - - -7]。在慢性肾脏疾病患者贫血是由于很多因素,最常见的是异常低的红细胞生成素水平。贫血EPO缺乏是公认的先进的肾功能衰竭而不是早期肾脏疾病。缺乏促红细胞生成素生产导致贫血在人类和动物模型。促红细胞生成素是高度糖基化的一个O联系和三个N与寡糖链。结果发现,O与寡糖链对分泌,没有影响受体亲和力,在体外或在活的有机体内生物活性。另一方面,N与寡糖链没有作用在体外活动,但它是至关重要的在活的有机体内生物活性(8]。

人类促红细胞生成素在1985年克隆基因编码导致的生产重组人促红细胞生成素(rHuEPO) [9,10]。rHuEPO被成功地用于治疗贫血和慢性肾脏疾病有关。它也被批准用于治疗贫血与癌症有关,艾滋病毒感染,手术设置为了减少输血(11- - - - - -13]。关于促红细胞生成素的临床使用的一个主要问题是相对较短的半衰期在活的有机体内由于其快速间隙(~ 5小时)从静脉注射时循环14]。因此,可用刺激药物的临床治疗方案用于治疗的病人需要频繁注射促红细胞生成素。推荐的治疗与rHuEPO每周2 - 3次皮下或静脉注射。因此,可以预期,增强在活的有机体内半衰期每周注射促红细胞生成素的减少。先前的研究表明,有直接关系的唾液acid-containing碳水化合物含量及其血清半衰期和分子在活的有机体内生物活性(15- - - - - -17]。结果表明,融合hCG的羧基末端肽(CTP)β与四个网站相关的亚基O与寡糖链的C终端FSH、TSH、GH和促红细胞生成素cDNA并不影响分泌,受体亲和力,在体外生物活性。另一方面,增加O与低聚糖的骨干蛋白质显著增加了半衰期和长寿在活的有机体内(18- - - - - -22]。我们假设的12O促红细胞生成素的支柱与寡糖链将大大增加促红细胞生成素的长寿。因此,在目前的研究中,三个羧基末端肽(CTP)的hCGβ每个包含四个亚基O与低聚糖识别网站是融合N终端(一)和C终端(两个)人类促红细胞生成素的编码序列,分别。我们的研究结果表明,结扎三茶多糖EPO的编码序列都显著增加在活的有机体内强度和循环半衰期。

2。材料和方法

2.1。材料

酶用于DNA向量的构造和构造是购买来自新英格兰生物学实验室(美国贝弗利,质量)。细胞培养基和试剂获得生物产业(Beit Haemek,以色列)。兔抗血清对EPO买来菲茨杰拉德(美国质量和谐)。真核表达载体(pCI-DHFR二氢叶酸还原酶)中相应的互补脱氧核糖核酸编码hEPO变体插入从Promega购买,(美国加州圣路易斯奥比斯波)。商业重组人促红细胞生成素(Eprex)从Janssen-Cilag购买(北方莱德、新南威尔士、澳大利亚)。

2.2。晶体学

促红细胞生成素及其受体之间的相互作用是结晶如前所述23)的结构生物学,魏茨曼科学研究所的,以色列Rehovot。

2.3。嵌合基因的结构和表达向量

一个盒式基因包含人类绒毛膜促性腺的CTPβ在串联融合促红细胞生成素的编码序列N终端(CTP)和C终端(两个茶多糖)(图1)。DNA片段包含hEPO-cDNA序列和编码序列的CTP合成GeneArt(雷根斯堡,德国)。DNA片段包含限制性内切酶的识别网站;Xba我(在氨基端),不是我(在C终端)。片段包含hEPO和CTP序列介绍了完全测序,以确保没有错误和结扎在合成中XbaI- - - - - -不是我网站克隆网站的真核表达载体,pCI-DHFR。同样,cDNA人类促红细胞生成素(EPO-WT)被构造成pCI-DHFR向量。

2.4。细胞培养和DNA转染

中国仓鼠卵巢细胞(CHO) -DG44 DHFR -,。细胞培养在MEM -α美国媒介(Gibco BRL)补充了青霉素(100 U /毫升),链霉素(100毫克/毫升),heat-inactivated谷酰胺(2毫米),和10%胎牛血清在湿润孵化器37°C包含5%的股份有限公司₂。这些细胞转染了2μg的DNA质粒通过FuGENE6(罗氏,曼海姆,德国)根据制造商的协议。

质粒DNA的细胞选择插入增长培养基的CD DG44没有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)(美国Gibco BRL)补充8毫米谷酰胺(生物产业、拜特Haimic、以色列)和10%的18毫升/ L普朗尼克f - 68(美国Gibco BRL)的解决方案。

2.5。西方墨点法

收集样本的条件培养基从稳定的克隆electrophorised变性15%像之前描述的那样SDS-polyacrylamide凝胶(24]。10分钟的凝胶被允许平衡25毫米三羟甲基氨基甲烷和192毫米甘氨酸20%液(卷/期)甲醇。蛋白质被转移到0.2μ米孔隙大小硝化纤维素膜(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在250年使用迷你马3 h Trans-Blot电泳细胞(Biorad实验室、里士满、CA)根据附带的手册中描述的方法。硝化纤维膜在5%的脱脂奶粉孵化在室温下2 h。膜是孵化与促红细胞生成素抗血清(1:1000浓度)在4°C其次是一夜之间连续三洗PBS中含0.1%渐变(10分钟/洗)。然后,膜与二次孵化抗体结合辣根过氧化物酶(合)(病菌,旧金山,CA)在室温下2 h三洗紧随其后。最后,硝基纸与增强化学发光反应底物(ECL)(皮尔斯,罗克福德,生病,美国)5分钟,干绘画纸表和暴露在x射线胶片。

2.6。在体外生物活性

促红细胞生成素变异的生物活性测试化验了人类erythroleukemic细胞系的增殖依赖TF-1 (Kitamura) (DSMZ)促红细胞生成素和促红细胞生成素变体的存在(25]。文化通常生长在37°C, 5%的公司₂1640年RPMI 72小时中补充10%胎牛血清的边后卫,10毫米玫瑰,1毫米丙酮酸钠,葡萄糖2.5 g / L, 2毫米谷氨酰胺,2 ng / mL rhGM-CSF。96 -孔板细胞转移之前,TF-1细胞被洗了三次冷PBS和悬浮在试验介质(1640中补充10%胎牛血清(的边后卫),但没有添加rHGM-CSF)的密度200000细胞/毫升。试验是在包含50个96孔板μL的细胞悬液。50μL试验介质包含3 IU EPO的变体被添加到井96 -孔板为72小时。细胞生存能力使用MTT测定试剂盒(细胞生物学实验室,圣地亚哥,CA)根据生产程序。

2.7。动物

雄性ICR小鼠从查尔斯河实验室获得,耶路撒冷,以色列人,住在有空调的季度12 h光明/黑暗的时间。标准的食物和水随意。学院伦理委员会批准在活的有机体内协议。动物被规定接受促红细胞生成素变异。

2.8。在活的有机体内生物测定

7组雄性ICR小鼠(7-week-old男性)。促红细胞生成素EPO-WT——(CTP)₃,或商业rHuEPO注射麻醉动物如表所示1。

动物的体重,并收到了相同的金额(5到15μ克/千克)的促红细胞生成素变体四世注射(0.2毫升/动物)。三次治疗的频率是每周(天1、3和5)或一次每周。血细胞压积的水平是决定每周3次实验是三周后停止。血细胞压积决定使用血液样本获得的灌装两种肝素化microhematocrit管从劣质caval静脉麻醉。此外,网织红细胞计数进行了因为这些细胞存在于血液~48小时前发展成成熟的红细胞。网织红细胞是急性实验系统使用一个适当的评价。血液由心脏穿刺获得每个小狗,放置在EDTA涂层管。这是与灿烂甲酚蓝混合和孵化为20分钟37°C。血液和污点被涂抹到载玻片和网织红细胞的数量评估使用×100年石油物镜。

2.9。代谢清除率

代谢清除EPO-WT Aranesp, EPO (CTP)₃确定后四世注入20 IU /动物雄性ICR小鼠。在选定的时间间隔注射后,血液样本收集和促红细胞生成素免疫反应性是由RIA。

2.10。统计分析

数据被表示为均值±SEM。统计分析的数据进行使用学生的t以及和1路的多元方差分析(ANOVA1)来计算价值。值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

Chrystallographic研究表明N终端和C促红细胞生成素的终端不参与绑定的激素受体(图2)。

因此,我们假设结扎的CTPN终端和C终端EPO不会影响受体的亲和力,因此生物活性。因此,三个茶多糖(一个N终端和两个的C终端)结扎EPO的编码序列。人类EPO-WT和促红细胞生成素的互补——(CTP)₃pCI-DHFR插入到真核表达载体,并转染CHO细胞。稳定的克隆表达人类EPO-WT或EPO (CTP)₃被选中。分泌促红细胞生成素是由免疫印迹分析评估在变性条件下使用人类EPO-specific抗血清。EPO-WT迁移速度比EPO (CTP)₃(图3)。

EPO (CTP)₃表现出高分子量(~57 kDa)比较EPO-WT (~36 kDa)由于新增的84个氨基酸和O与低聚糖与CTP有关。这些数据可能表明O与糖基化的认可C终端区域保存即使序列融合不同的蛋白质。EPO-WT水平和促红细胞生成素(CTP)₃数量在条件中通过使用单克隆抗体类RIA。

的在体外促红细胞生成素类似物的生物活性是通过测量刺激TF-1细胞的增殖能力在“材料和方法。“EPO (CTP)的活动₃在TF-1细胞增殖试验相似EPO野生型(由Modigene科技)和商业rHuEPO(图4)。

为进一步药理评价促红细胞生成素(CTP)₃,比较药效学研究促红细胞生成素(CTP)₃在雄性ICR小鼠和商业rHuEPO进行(/组)使用不同的频率和剂量范围如表所示1。的在活的有机体内疗效是通过测量血液中的血细胞压积百分比的平均值。结果表明:促红细胞生成素(CTP)₃明显()比rHuEPO当管理更高效四世一周一次的剂量15μ克/公斤(图5)。EPO (CTP)₃可以成功地增加血球容积计管理和剂量的15一周一次吗μ克/公斤(图5)。每周1次剂量与相同浓度的商业rHuEPO或EPO-WT明显()效率不及周剂量的EPO (CTP)₃。本研究的一个有趣的观察是一个每周注射一次的能力EPO-CTP (15μ克/公斤)显著增加(~8折)血细胞压积的水平。而政府相同的总剂量rHuEPO每周进行三次为5μ克/公斤注射导致显著((图)较低的影响5)。

以前,我们已经表明,单一注射EPO-CTP一周一次,一个包含一个CTP促红细胞生成素在羧基末端端,(15μ克/公斤)增加血球容积计的水平,而同样的效果是通过管理相同的总剂量rHuEPO每周进行三次为5μ克/公斤注入(21]。这些结果表明持续的血液水平的重要性,而不是总剂量的促红细胞生成素。这些发现与假设一致的能力一个注入EPO-CTP增加血细胞压积的结果增加循环的稳定。

EPO-WT效果(EPO-CTP)₃,网织红细胞计数Aranesp图所示6。结果表明,单一四世注入15μ克/公斤(EPO-CTP)₃大幅度增加的网织红细胞数量相比rHuEPO Aranesp。增加生物效能的嵌合体可能反映了他们的变化在活的有机体内长寿。因此,循环半衰期的激素测定。EPO-WT、Aranesp或EPO (CTP)₃注射四世成不成熟的雄性老鼠和RIA监测血浆半衰期。结果表明:促红细胞生成素(CTP)₃在循环半衰期最高(图7)。

Aranesp的半衰期估计EPO-WT, EPO (CTP)₃分别是4.4,10.8,和13.1小时(表吗2)。这些数据表明,促红细胞生成素间隙的机制是影响CTP的存在。估计曲线下的面积(AUC)和最大血浆浓度(Cmax) EPO (CTP)₃高于rHuEPO Aranesp。然而,在等离子体(达峰时间)达成的最大浓度(表相似2)。

先前的研究表明,CTP序列可以穿梭到不同的蛋白质和仍然是一个受体O与低聚糖(18- - - - - -20.]。这是假定的O与低聚糖添加灵活性、亲水性和稳定的蛋白质(26]。这也许可以解释的CTP disinterference蛋白质构象,因此,受体结合和生物活性在体外。另一方面,这是暗示O与低聚糖发挥重要作用在防止等离子体间隙,从而增加循环中的蛋白的半衰期(18,21,22]。这些角色一直以来假设O与低聚糖与唾液酸结束,这是带负电。众所周知,带负电荷的形式的激素不通过肾小球滤过(27]。因此,增加12O与寡糖链骨干的EPO显著降低肾清除率;肾脏的主要网站为糖蛋白激素和间隙,因此,延长其在循环半衰期。

其他研究描述长期代理hyperglycosylated EPO模拟由添加N与低聚糖蛋白质的支柱。为了添加N与寡糖链,克隆人类促红细胞生成素基因的DNA序列被定点诱变(修改28]。这个模拟三倍长血清半衰期和创建在活的有机体内对人类重组EPO-WT效能比较。然而,它的相对亲和力EPO受体~4倍低于rHuEPO。此外,改变5个氨基酸在蛋白质的支柱可能增加新的衍生的免疫原性。

CTP的编码序列的激素FSH、TSH, GH,不影响分泌,受体亲和力,或生物活性在体外(18- - - - - -22]。另一方面,发现结扎CTP的编码序列显著增加在活的有机体内强度和半衰期的激素。此外,发现激素轴承CTP是安全的用于人类和没有免疫原性29日- - - - - -31日]。

本研究描述了一个新颖的长效重组促红细胞生成素受体激动剂设计的融合三个CTP序列EPO的编码序列。这并不妨碍分泌或在体外生物活性。相比之下,CTP序列显著增加在活的有机体内力量和促红细胞生成素的半衰期。这些数据建立一个理由使用这个作为长效促红细胞生成素模拟嵌合体。然而,这个模拟的免疫原性应该进行测试。人类促红细胞生成素广泛临床应用治疗贫血与肾功能衰竭有关,艾滋病毒,和化疗32- - - - - -36]。这个模拟的治疗效果需要建立在高等动物和人体临床试验。

缩写

促红细胞生成素:	促红细胞生成素
RHuEPO:	重组人红细胞生成素
WT:	野生型
促:	人体绒毛膜促性腺激素
FSH:	Follitropin
TSH:	促甲状腺素
CTP:	羧基末端肽
赵:	中国仓鼠卵巢细胞
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
WT:	野生型。

承认

作者要感谢以色列工业和贸易支持。

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