小热休克蛋白HSP25/27 (HspB1)丰富培养的星形胶质细胞与星形病理学和相关进行性核上的麻痹和Corticobasal变性

文摘

丝状tau-positive蛋白质夹杂物在神经元和神经胶质是许多神经退行性疾病中的突出特征称为tauopathies。这些夹杂物进一步的特点是热休克蛋白的存在(休克)。小热休克的组,即HSP27和B-crystallin、与细胞骨架和外来蛋白结合,并防止他们聚合后的压力。进一步研究其对神经退行性疾病的贡献,我们分析了协会HSP27 tauopathies的病理损伤。微阵列和免疫印迹分析表明HSP27 mRNA和蛋白水平的提高影响大脑,而且它与星形病理相关。HSP27的upregulation tauopathies胶质gial病理学意味着不同的机制和神经细胞。这是靠细胞培养研究,证明小热休克是专门和突出表现在轻神经元在神经元和星形胶质细胞,而不是保持在一个相当低的水平,即使压力情况。

1。介绍

丝状蛋白晶体结构中观察到许多神经退行性疾病。他们含有细胞蛋白质,如-核蛋白和τ,经常各种热休克蛋白(休克)和泛素除了细胞骨架蛋白(1- - - - - -4]。热休克作为分子伴侣’再折起受损蛋白质和目标不可逆受损蛋白质降解的ubiquitin-proteasome系统来防止proteotoxic损害。他们在细胞内含物的存在表明失败调节为了防止蛋白质变性和聚合。此外它表明压力情况下,如氧化应激、热应力,或压力引起的蛋白酶体损伤,导致疾病的发病机理(3]。

病态的夹杂物包含microtubule-associated tau蛋白的过度磷酸化形式是一个类的特征标志零星和家族性疾病,称为tauopathies [1,2,4]。在阿尔茨海默病(AD)τ优先聚集形成的神经元,在额颞叶痴呆,如选择的疾病,进行性核上的麻痹(PSP)和corticobasal变性(CBD), tau-positive夹杂物是一致的特性不仅在神经元在神经胶质5- - - - - -8]。神经元和神经胶质丝状病变在PSP和CBD是由过度磷酸化τ有四个微管绑定重复,也就是说,4 r-tau [9]。τ是一种microtubule-binding蛋白大量表达在中枢神经系统。是很重要的微管装配和稳定,在正常的大脑主要位于轴突而不是在健康的星形胶质细胞中表达10]。数据从我们的实验室已经证明,这也是一个重要的组分oligodendroglial细胞骨架(7,11]。根据他们的细胞起源,PSP和CBD tau-positive胶质夹杂物被列为tau-positive星形胶质细胞和oligodendroglial盘绕的身体8,9,12]。星形内含物变化的疾病;他们不形成坚实的包涵体,而是表现出扩散或纤丝的染色模式。植绒的星形胶质细胞和星形斑块是典型的PSP和CBD,分别,而tau-positive盘绕尸体起源于寡树突胶质细胞可以发现在这两个障碍(4,12,13]。

小热休克的集团与分子量的范围12-43 kDa密切相关(14,15]。最著名的代表B-crystallin HSP27、或其大鼠模拟HSP25。它们参与多种细胞过程,特别是与细胞骨架元素相互作用,应力,诱导,显示伴侣蛋白功能和有效结合外来蛋白质,防止蛋白质的聚合后压力(16,17]。培养的大鼠大脑星形胶质细胞持续表达高水平的HSP25,产生保护作用与各种压力的情况下,在少突胶质细胞B-crystallin似乎更重要(18,19]。在广告小热休克被发现与星形胶质细胞在老年斑和神经原纤维缠结与神经元不(20.]。B-Crystallin免疫反应性似乎是特定于疾病与神经胶质病理学(5,21]。

进一步调查的贡献小热休克神经退行性疾病,我们已经分析了协会HSP27病理损伤的PSP和CBD的大脑。此外,由于不同的致病机制和压力蛋白诱导神经元和星形胶质细胞似乎有助于τ病理学,HSP表达和upregulation相比在培养神经元和星形胶质细胞来自老鼠大脑。免疫印迹分析表明HSP27调节PSP和CBD,患者的大脑中,发现与星形细胞夹杂物形态。此外,更突出表现在培养的星形胶质细胞在正常和应激条件下比在神经元。

2。材料和方法

2.1。材料和抗体

细胞培养基是表达载体(大岛,纽约)。

免疫印迹分析或免疫荧光抗体被用于:马伯anti-HSP70 (spa - 810), mAb anti-HSP / HSC70 (spa - 820), mAb anti-HSP60 (spa - 806),多克隆anti-HSP40 (spa - 400),多克隆anti-HSP32 (spa - 895),多克隆anti-HSP25 (spa - 801),多克隆anti-HSP27 (spa - 803),和马伯反从StressGen B-crystallin (spa - 222)(维多利亚,公元前,加拿大)。多克隆抗微管蛋白,马伯反微管蛋白,mAb anti-GFAP来自σ(Taufkirchen,德国)。马伯的混合物anti-tau-14和anti-tau-46(包括稀释1:500)识别磷酸化的所有独立τ亚型,mAb PHF-1(1: 500)识别τ磷酸化丝氨酸残基在396年和404年,mAb Tau-1特定nonphosphorylatedτ抗原决定基位于氨基酸残基189 - 209。免疫印迹分析的工作稀释1:1000如果不是括号中提到。

2.2。连续的脑组织生化分馏

脑组织神经退行性疾病研究中心获得广告中心核心费城大学医学院。脑组织冰冻苍白球的PSP (),CBD ()和正常的控制(在8毫升/ g)均质高盐缓冲(HS)(重量/卷)(50更易/ L三,pH值7.5,750更易与L氯化钠,5 L更易与EDTA;所有缓冲区都补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(完整,罗氏诊断,曼海姆,德国)和磷酸酶抑制剂PhosSTOP(罗氏诊断))和离心机30分钟在4°C。整除的匀浆(TH)用来进行免疫印迹分析。丸提取3 mL / g的HS缓冲区包含1% Triton x - 100 (HS-T)。删除髓,球在500年被均质包含1 mol / L蔗糖L h。浮动髓离心后丢弃。由此产生的颗粒在2 mL / g的均质radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(50更易/ L三,pH值8.0,150更易与L氯化钠,5更易/ L EDTA, 1%诺乃清洁剂p 40, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS))。之后,球被提取2 mL / g SDS缓冲区(62.5更易/ L三,pH值6.8,1更易与L EDTA, 0.1巯基乙醇,2% SDS、10%甘油)。SDS-insoluble颗粒由甲酸进一步提取,但没有透露足够的材料进行分析。五倍浓缩样品缓冲(312.5更易与L三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8,5更易/ L EDTA, 0.5巯基乙醇,10% SDS, 50%甘油、0.05%溴酚蓝)添加到TH, HS, HS-T里帕,所有样本加热到100°C 5分钟。相同体积的样品从每个部分加载在10%和7.5聚丙烯酰胺凝胶。所有分数被免疫印迹分析过程;见下文。在结果部分只有TH和SDS-fractions(图所示1)。微管蛋白的使用规范化的数据。

2.3。免疫印迹分析

细胞层的控制和治疗细胞与磷酸盐缓冲盐水洗(PBS;137毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,1.47毫米KH₂阿宝₄,8.4毫米Na₂HPO₄;pH值7.4)一次,刮掉在样品缓冲(125毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.7,1毫米EDTA, 1巯基乙醇、10%甘油),含2% SDS,煮10分钟。蛋白质含量的样品测定根据Neuhoff et al。22]。免疫印迹,总细胞提取物(10 - 20每车道g蛋白)是由一维的sds - page分离使用7.5%或10%聚丙烯酰胺凝胶,并转移到硝化纤维素膜(Schleicher和Schuell, Dassel,德国)。这些墨迹与TBS-T饱和(20毫米三羟甲基氨基甲烷,液pH值7.5,136.8毫米氯化钠,0.1% v / v渐变20)含5%奶粉和个体抗体孵育过夜4°C。洗后,孵化HRP-conjugated anti-mouse (Amersham生物科学、大力神、钙、美国;1:3000)或anti-rabbit免疫球蛋白(Biorad,慕尼黑,德国;1:3000)进行了1小时,屁股被增强化学发光可视化(ECL)程序所描述的制造商(Amersham,布伦瑞克,德国)。免疫印迹的定量评价是由光密度扫描和ImageQuant软件(分子动力学,桑尼维尔,美国)。

2.4。RNA提取和微阵列分析

研究基因表达谱总RNA提取的控制和PSP苍白球脑组织Miltenyi研究(德国科隆)。六个人类特定PIQOR微阵列(Miltenyi研究,科隆,德国)组成的1208所选基因探针用于生成mRNA的表达谱PSP的大脑与控制。互补脱氧核糖核酸的合成,核糖核酸样本两个控制大脑和三个PSP的大脑是汇集。互补脱氧核糖核酸合成和纯化进行了使用TS标签和检测设备(优秀的,美国)根据生产厂家的说明书(看到优秀的,美国MicromaTS标签和检测装备包MPS521, MPS522详情)。

使用PIQO杂交和posthybridization进行微阵列工具包(Miltenyi研究,科隆,德国)根据制造商的指示。芯片扫描仪(GenePi幻灯片进行扫描美国福斯特城4000 b,轴突仪器)。敏度4.0(分子设计、管理方、美国)是用于信号量化。信号指underexpressed基因,而信号展示过表达基因。

2.5。免疫组织化学

组织获得解剖的时候在10%福尔马林固定,石蜡包埋,切成6米厚的部分。抗原后检索使用向量揭露解决方案formalin-fixed通过免疫组织化学方法分析大脑部分如前所述[23),使用avidin-biotin复杂(ABC)方法(Vectastain ABC工具包,向量实验室,伯林盖姆,CA)。为双immunolabeling,部分被封锁在5% ChemiBLOCKER (Chemicon、微孔Billerica,妈,美国)和2%驴血清在0.1米三,pH值7.6补充0.1% Triton x - 100(忧郁的)抗原检索后在室温下过夜。第一抗体稀释1:100年的悲哀的和孵化在室温下过夜。6洗30分钟后在0.1米三,pH值7.6,部分与二次孵化抗体(1:100年的悲哀的)(美国杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)在室温下过夜。自体荧光被描述使用苏丹黑B [24)和部分安装了Vectashield安装介质(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)包含6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。数字图像的免疫组织化学制剂获得使用一个奥林巴斯BX 51(日本东京)显微镜与数码相机配备具有亮光源,在DP71 (Orangeburg奥林巴斯,纽约),和DP经理(奥林巴斯)。分析了荧光标签使用蔡司显微镜数字化(从德国)配备了数码相机使用plan-neofluar目标(或概述图像)或莱卡TCS SL共焦激光扫描显微镜(位于德国)。

2.6。主要神经细胞培养

单个细胞悬浮液从织老鼠胚胎的大脑半球准备如前所述[25]。组织均质在鹰基础培养基(BME),含0.5% heat-inactivated胎牛血清(FCS)。细胞在无血清培养基与N2-Supplement补充(1:100;表达载体,卡尔斯巴德,CA)、谷酰胺(1:100;表达载体,卡尔斯巴德,CA), 50 U /毫升青霉素,50克/毫升链霉素。实验与7-day-old文化或表示。每周两次,一半的培养基是交换。

2.7。星形胶质细胞培养

神经胶质细胞的主要文化是从1-2-day-old Wistar鼠的大脑准备和星形胶质细胞准备从烧瓶如前所述[6 - 8天之后26]。简而言之,星形胶质细胞从培养瓶trypsinated,切除后小胶质细胞和少突细胞前体细胞,播种10厘米文化菜肴,与10%胎牛血清的DMEM补充(FCS)。3天前的DMEM含有0.5% FCS实验中改变。

2.8。热休克治疗

文化菜用封口膜密封,在水浴浸30分钟44°C,所述前(27]。表示复苏的细胞放入孵化器。控制细胞被封闭了30分钟,但仍在孵化器。

2.9。氧化应激

细胞治疗与过氧化氢(100米)30分钟,媒介是取代,细胞复苏的孵化器表示。

2.10。间接免疫荧光法

细胞培养在poly-L-lysine-coated玻璃盖玻片(细胞每35毫米盘)和受热休克或氧化应激。与PBS洗涤后,细胞被固定在冰冷的甲醇为7分钟。盖玻片是洗了三次,1小时孵化anti-GFAP和反微管蛋白的抗体,其次是适当的二次抗体(1:100)(美国杰克逊ImmunoResearch西树林,PA),洗PBS和安装。原子核是由DAPI染色(1.5g / mL)包含在安装介质(Vectashield;向量的实验室,伯林盖姆,CA,美国)。研究了荧光标记使用蔡司显微镜数字化(从德国)配备了数码相机使用plan-neofluar客观(100 x)。

3所示。结果

3.1。增加τ和HSP27的表达影响大脑的PSP和CBD的病人

苍白球的冰冻组织标本来自5 PSP和4 CBD患者和3例无神经系统疾病的控制。τ的表达和溶解度取决于顺序提取脑组织用缓冲区增加增溶能力(见方法部分)。个人分数被免疫印迹分析程序使用PHF-1抗体识别过度磷酸化τ,tau-1抗体针对nonphosphorylatedτ,鸡尾酒t14和t46抗体。图1显示了免疫印迹的大脑homgenates (TH)和可溶性SDS-fraction最少。大多数过度磷酸化τSDS分数中发现,存在于所有的PSP和CBD大脑样本,尽管在不同的层次,从而确认病理(图1)。脑组织均质每卷重量,相同体积的随后的个人分数被sds - page分离。自微管蛋白是在大约相同级别的TH大脑样本,用于规范化数据(图1 (b))。

研究基因的表达谱在正常和影响大脑,RNA是隔绝PSP大脑组织和正常组织的控制。RNA从3 PSP和2正常控制组织样本是合适的,用于微阵列分析。人类特定PIQO微数组技术被用来分析1208个基因。定量分析显示,38个基因被压抑和26个基因诱导,包括HSP27和HSP70(图2)。HSP27 mRNA的感应是通过rt - pcr分析证实使用相同的RNA准备(没有显示)。

这一结果促使我们分析组织提取HSP27和HSP70蛋白的存在(图1(一))。免疫印迹分析表明HSP27在大脑控制和影响的所有分数检测样本,并与正常对照组相比更加丰富的大脑的影响。在PSP大脑提取,HSP27高架TH、最知名的可溶性SDS-fraction,在CBD的大脑HSP27在TH和SDS-fraction丰富。HSP70,相比控制nonaffected大脑组织,可观察到的在一个高水平的SDS-fraction PSP和CBD的大脑(图1(一))。

3.2。增加HSP27免疫反应性在受影响的大脑

石蜡包埋的相邻部分苍白球组织与PHF-1抗体制备和应用,证实病理和HSP27抗体。与正常对照组相比,明显PHF-1组织化学染色和HSP27在受影响的大脑(图3)。HSP27染色主要是与与星形细胞形态(图3)。尽管PHF-1积极盘绕身体起源于寡树突胶质细胞存在于大脑部分的PSP和CBD,我们没有发现蛇的身体正面彩色HSP27在分析部分。这表明HSP27病理主要是与星形胶质细胞有关。这是进一步证实了双immunolabelling大脑部分使用HSP27抗体和PHF-1(图4)。HSP27免疫反应性存在于许多细胞与星形形态。此外,星形病理学差异观察PSP和CBD的大脑部分。在PSP, PHF-1阳性细胞类似于簇星形胶质细胞也常常是HSP27阳性(图4,PSP病人3)。在CBD的大脑部分,PHF-1积极星形斑块被认为,这中间包含HSP27免疫反应性(图4,CBD病人6)。此外,大星形胶质细胞强烈被包含PHF-1 HSP27抗体标记的免疫反应性细胞扩展通常是可观察到的在CBD的大脑(图4,CBD病人6)。PHF-1 colocalization和HSP27进一步证实了共焦显微镜。覆盖图像演示,虽然HSP27主要是在细胞的中心在细胞质中,PHF-1免疫反应性突出边缘和细胞扩展(图4 (b))。数据进一步表明,并不是所有HSP27-positive细胞或斑块也在积极PHF-1但与tau-immunoreactive包裹体(图的一个子集4)。同时,即使是在大脑中与相对较少的样本PHF-1蛋白表达在免疫印迹(图展示1CBD, PSP 3和8),HSP27大量表达,在细胞中发现的一个子集colocalization PHF-1。星形细胞的身份被证实双immunofluorecent GFAP染色组织部分使用抗体(胶质原纤维酸性蛋白)和HSP27。图4 (c)表明细胞表达HSP27也GFAP阳性,因此代表了星形胶质细胞。

3.3。组成型表达热休克的微分Upregulation培养大鼠大脑神经元和星形胶质细胞

我们实验室以前的数据表明,星形胶质细胞相比,少突胶质细胞来自新生大鼠的大脑表达水平更高的本构的小热休克,因此可能会受压力的情况下(18,19]。自病理也突出的神经元,神经元丝状病变和神经纤维网线程被发现在PSP和CBD,我们准备好的文化老鼠大脑神经元和星形胶质细胞比较既定的模式表达热休克。细胞提取受到免疫印迹过程使用的抗体几个热休克。图5表明,星形胶质细胞和神经元有不同的大量的小热休克,HSP25和B-crystallin,高分子量热休克也同样表达了在这两种细胞类型。

接下来我们测试如果神经元和星形胶质细胞不同加热和氧化应激反应。细胞受到热冲击(商品;30分钟,44°C, 18个小时恢复)或过氧化氢(操作系统;100年米,30分钟,18个小时恢复)。免疫印迹分析表明,HSP25调节神经元在HS和操作系统,但在任何条件在星形胶质细胞(图一样大量表达6)。在神经元,B-crystallin由商品但不诱导后可检测操作系统,而在星形胶质细胞增强后两压力条件。在这两种细胞类型,HSP32诱导氧化应激和HSP70的诱导后只有热应力后,虽然HSP60仍在同一水平(图6)。在星形胶质细胞的存在和upregulation HSP25 HS和操作系统进一步证实了使用HSP25抗体间接免疫荧光和GFAP(胶质原纤维酸性蛋白)。图7表明HSP25 HS后调节和操作系统,分布在胞体和流程和部分与神经胶质纤维有关。因此,这些数据表明,休克蛋白差异表达在神经元和神经胶质细胞对不同压力情况下的upregulation不同压力的蛋白质。这些数据突显小热休克的功能性意义神经胶质和点的结论是,细胞类型特定的反应伴随病理过程。

4所示。讨论

在广告,等tauopathies CBD, PSP,和选择的疾病,τ是细胞内夹杂物的主要成分,这些不仅可以发生在神经元也指出在星形胶质细胞和少突胶质细胞胶质细胞为神经退行性疾病的发病机理8]。错误折叠的蛋白质组装和积累发病神经退化之前,这很可能是一种机制,旨在消除细胞变性蛋白质救援。总量增长和扩大时,他们可能会带来死亡信号和发病机制中发挥重要作用的疾病。有人建议,通过共同的机制可能出现各种类型的夹杂物。它们包含组件的泛素蛋白酶体系统和各种各样的分子伴侣’(28]。分子伴侣’提供的第一道防御错误折叠的蛋白质和密切配合蛋白酶体机械(29日,30.]。HSP25/27可以赋予抵抗凋亡刺激和可能保护细胞骨架在压力(31日,32]。经历动态组装成大骨料和寡聚化已经建议需要伴侣和衬底绑定函数。HSP27的女伴函数的直接证明体内是失踪,但证据积累,有助于增加伴侣展开活动的细胞,结合蛋白质,然后保存在一个称职的状态由HSP70(复合33]。

我们检查HSP27在PSP和CBD的存在,代表tauopathies与丰富的胶质病理学(8,12]。数据显示,在受影响脑组织HSP27增强相比正常的控制,和一个大比例的HSP27只是与洗涤剂破坏细胞骨架可榨出的,也就是说,2% SDS,类似于过度磷酸化τ。还在这个分数HSP70丰富,和微阵列分析表明mRNA水平编码HSP27在大脑PSP和HSP70是增强样品。免疫组织化学数据进一步指出,HSP27与显示星形细胞形态有关,在PSP和CBD的大脑,但我们不能发现蛇的身体积极HSP27的染色。双重免疫荧光标签表明,并不是所有HSP27-positive细胞显示PHF-1免疫反应性,但塔夫茨PHF-1阳性星形和HSP27在PSP大脑部分和PHF-1-positive星形斑块与HSP27免疫反应性的中心通常是出现在CBD的大脑部分。星形塔夫茨是PSP的大脑中的突出特征和星形斑块特征在CBD (12]。我们的数据表明,在这两种疾病的细胞数量显著HSP27表达没有显示τ病理学。这也是在患者的大脑,而低水平的PHF-1蛋白表达。这可能表明,星形胶质细胞的应激反应涉及HSP27 upregulation先于τ的形成存款和试图在保护细胞免受蛋白质聚合过程。

我们的数据支持的一项研究,表明免疫染色B-crystallin HSP27,尽管在一个小得多的程度上,增加了CBD, PSP, FTDP-17 [21]。B-Crystallin染色特别突出在CBD和FTDP-17结构类似蛇的身体。三个PSP案例分析中只显示轻度τ病理学,也只有温和B-crystallin免疫反应性是可观察到的21]。HSP70免疫染色并不是影响和不受影响的大脑区域,增加和HSP27疣主要演示了在胶质细胞在大脑皮层的所有三个病态,但这不是进一步追求在这个之前研究生化反应(21]。

因此,upregulation小热休克似乎是特定的神经胶质病理学,意味着不同的致病机制胶质和神经细胞。这是由我们的数据,证明培养神经元和星形胶质细胞有不同的设置或数量的持续表达热休克和小热休克,B-crystallin HSP25,专门和突出表现在轻星形胶质细胞。即使在压力情况下小热休克神经元的水平仍然很低。同样,少突胶质细胞本构水平较低的小热休克,但应对氧化和蛋白酶体压力的著名的感应B-crystallin, HSP25主要诱发热应力后(18,27]。星形胶质细胞是专门抵御各种压力的情况下,我们近期的数据表明,他们保护HSP25[本构水平高19,32]。Downregulation HSP25的核方法引起的肌动蛋白丝故障在控制细胞在没有压力的刺激和致敏细胞对氧化和蛋白酶体压力(19]。因此程控和stress-specific监管是在细胞培养中可观察到的和可能参与疾病进展。

问题依然存在,为什么小热休克相关的不溶性蛋白质强调细胞,影响大脑的分数。事实上,虽然小热休克可能防止蛋白质易聚合,形成可溶性复合物聚合基质蛋白,它们经常在不溶性detergent-resistant发现分数(19,21,34]。细胞培养的研究表明,在发病的早期状态小骨料和aggresomes形成,这些都是旨在保护其余部分不必要的交互与错误折叠蛋白质的胞体(32,35,36]。在胶质细胞,形成aggresomes MTOC和小热休克和泛素被雇来不断增长的夹杂物作为主要成分(19,37,38]。当外来基质细胞是超负荷,小热休克coaggregate外来蛋白质和紧密联系在一起,可能环绕包涵体。这种情况特别提倡在压力情况下,如由蛋白酶体抑制氧化应激或施加压力。

总结、小热休克似乎特别重要的与胶质神经系统疾病病理。他们杰出的组分在包涵体起源于星形胶质细胞和少突胶质细胞。这些是中枢神经系统疾病与细胞骨架特征的异常。虽然小热休克可以专门与细胞骨架组件和交互可能保持细胞形状和完整性,慢性过度,而不是保护细胞,可能会进一步导致细胞损伤和疾病进展。

确认

这项工作成为可能,并支持了Peebler研究基金会的慷慨贡献和社会进步的核上的麻痹(CurePSP),美国。德意志Forschungsgemeinschaft的支持。作者感谢李约翰Trojanowski博士和弗吉尼亚,在神经退行性疾病研究中心(CNDR),宾夕法尼亚大学医学院,美国费城有益的讨论,在研究他们的慷慨支持。特蕾莎的帮助下,舒克(CNDR)进行免疫组织化学和准备组织部分。脑组织是由大脑的神经退行性疾病研究中心(美国费城费城大学医学院),支持下由美国国立卫生研究院的资助(AG) 10 124)。

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