细胞迁移丝状伪足的贡献:一个机械突出和收缩之间的联系

文摘

无数的f -肌动蛋白包含结构涉及到调节膜突出前沿的能动的细胞。我们调查的结构和动力学的丝状伪足相关事件的前缘和尾肌动蛋白的功能网络。我们发现,尽管丝状伪足含有平行束的肌动蛋白,它们包含了令人惊讶的肌动蛋白结合蛋白的非均匀时空分布。在肌动蛋白丝的长度在一个外肉伪足,最主要包含T-plastin远端部分,而近端部分主要是受辅肌动蛋白和coronin。一些丝状伪足是静止的,但横向丝状伪足的前缘移动。他们之间似乎形成了一个机械联系细胞的肌动蛋白聚合网络在前面细胞和肌凝蛋白汽车活动身体。横向filopodial运动的方向与细胞迁移的方向有关。横向丝状伪足发起时,只朝着一侧的细胞,细胞将filopodial流的方向相反。因此,该filopodia-myosin II系统允许肌动蛋白聚合突出力量的推动下和肌球蛋白II介导收缩力机械协调。

1。介绍

细胞迁移是一个基本的细胞过程必不可少的胚胎发育、伤口愈合、免疫反应和组织的发展。普遍,爬行运动涉及到时空上的四个步骤循环协调力量肌动球蛋白细胞骨架与细胞外粘连:质膜突出前缘,形成新附着网站突出,破坏细胞后,年长的附着力网站的和收缩导致胞体运动(1]。尽管这些过程的许多方面是单独理解,时空上他们是如何协调在很大程度上是未知的。

爬行细胞主要产生两种类型的actin-based伸出的细胞器,板状伪足,丝状伪足,有明显不同的肌动蛋白聚合机械,是由不同的信号通路2- - - - - -4]。lamellipodium的特点是一个密集的网络短,支肌动蛋白丝,由激活Arp2/3复杂,其次是纤维伸长和barbed-end限制。除了膜之间的肌动蛋白丝的两端是假设产生的物理力量突出膜的前缘(5- - - - - -7]。

相比之下,丝状伪足瞬态,薄,含有平行的肌动蛋白束细长的突起。提出了丝状伪足迁移细胞的重组形成的树状网络(8]。另一种模型提出,丝状伪足形成通过平行的肌动蛋白纤维网络的直接聚合形成家族的成员。Dia,许多物种的甲酸精、定位技巧的丝状伪足和成核并行肌动蛋白伸长的一端(9- - - - - -11]。板状伪足也经常包含并行肌动蛋白丝束称为microspikes期间保持嵌入到板状伪足连续突出(12]。这些microspikes可以发展成丝状伪足伸出时超出了前缘(8]。束称为收缩的肌动蛋白丝纤维也可以留下lamellipodium收缩。这三种类型的长,平行的肌动蛋白束中发现lamellipodium是可互换的细胞器8),因此,在这篇文章中,如果未指定,否则,我们将参考这三种类型的外围的肌动蛋白束统称为“丝状伪足”。

一些丝状伪足面向垂直于lamellipodium前面。这些丝状伪足固定对lamellipodium但不是底物及其突出完全是由肌动蛋白聚合的技巧(13,14]。丝状伪足可由焦点固定在基质复合物,这可能会限制他们的运动3]。一些丝状伪足斜相对于前沿,和横向移动衬底和lamellipodium [14,15]。丝状伪足的横向运动的特点是快速变化的方向和频繁的碰撞和融合个人filopodial包(15]。

交联的肌动蛋白丝是一个关键的步骤,提出了丝状伪足形成以来个人长肌动蛋白细丝缺乏有效地推动膜所需的刚度(5,16]。Fascin提出了主要的肌动蛋白交联蛋白在丝状伪足(17- - - - - -19]。然而,许多细胞类型不表达fascin,但是表达其他肌动蛋白交联蛋白,包括α辅肌动蛋白、espin plastin, villin。这些蛋白可能参与丝状伪足的形成尤其在细胞不表达fascin [17,20.]。

在本文中,我们试图理解的分子机制协调细胞迁移期间filopodial行为。我们研究了丝状伪足的行为和动态使用活细胞荧光显微镜在细胞迁移的细胞表达的不同组合荧光标记肌动蛋白结合蛋白,包括肌动蛋白、T-plastin,α辅肌动蛋白1,coronin 1,肌球蛋白II,特别重视检查filopodial组织和运动的变化与细胞周期有关的迁移或胞体易位。

2。材料和方法

2.1。材料

所有试剂都是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)除非另有说明。

2.2。细胞

小鼠黑色素瘤细胞B16F1(写明ATCC crl - 6323)在杜尔贝科修改鹰的培养中有10%的边后卫(亚特兰大生物制剂),2毫米谷氨酰胺,100氨苄青霉素g /毫升和100年g / mL链霉素公司的5%₂。

2.3。荧光蛋白结构和转染

人类T-plastin全长序列从一个包含PLS3 cDNA克隆放大写明ATCC克隆(10437180)通过聚合酶链反应包含限制性位点的引物生态RI /Kpn我和克隆到pEGFP-C1向量(Clontech,帕洛阿尔托,CA)产生pEGFP-T-plastin。这给了一个哺乳动物表达载体产生GFP-T-plastin CMV启动子的控制下。mCherry表达向量,pEF6-mCherry是由切断pRSET-mCherry的Bam HI-EcoR1片段21含有mCherry基因]Bam嗨,Eco RI消化pEF6-GFP(去除GFP基因)。mCherry-T-plastin构造是由削减pEGFP-T-plastinBsr G我和Mfe我和切断Bsr G我/Eco R我切pEF6mCherry向量。这个mCherry-T-plastin向量产生mCherry-T-plastin EF1的控制之下α启动子。从EF1 GFP-actin向量允许表达式α子一直在前面描述的(22]。mCherry-actin向量是由隔离Bsr G1-Eco RI GFP-actin碎片含有肌动蛋白编码序列和切断Bsr G1和生态RI pEF6-mCherry削减。肌凝蛋白II-GFP, (23),α-actinin1-GFP [24]。GFP-vinculin、GFP-paxillin GFP-talin [25),zyxin-GFP coronin 1-GFP [26)探测器前面描述的。

B16F1细胞(50000)与双瞬变cotransfected颜色荧光融合蛋白使用Lipofectamine或Lipofectamine +试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指导方针。在转染后12 - 24小时,B16-F1细胞脱离塑料镀trypsin-EDTA治疗和组织培养的菜肴的有限公司₂独立媒体(表达载体,Inc .)包含10%的边后卫BioptechsδT文化菜(Bioptechs公司。巴特勒,PA)。预镀有5或10g / mL纤连蛋白(BD生物科学,贝德福德,MA)或5到25g / mL层粘连蛋白(南方生物技术,伯明翰,阿拉巴马州)溶解在PBS为1小时。B16F1细胞被允许连接到表面2 - 6小时前观察。在细胞行为或filopodial行为没有区别当镀细胞纤连蛋白和层粘连蛋白。

2.4。延时显微

活细胞观察蔡司Axiovert 200显微镜(蔡司;德国哥廷根)使用100油浸物镜(1.3 NA,蔡司)。盘子被保存在δT打开菜控制器和加热盖(Bioptechs Inc .,巴特勒,PA)。由于长时间暴露于强光导致观察到细胞的光毒性和漂白,帧拍摄间隔30秒时间流逝记录以最小的曝光。图像采集是滨松的虎鲸相机由自动化控制例程使用Openlab开发软件(Improvision Inc .);搬运,MI)。对于人口流动分析,B16F1细胞被允许坚持4小时δT的菜肴,是未经处理或涂以不同浓度的鼠标层粘连蛋白(南方生物技术、伯明翰、AL)或人类纤连蛋白(BD生物科学、床福特,马)。细胞被成像与10每5分钟目的在在公司₂独立媒体在Bioptechs菜肴。

2.5。量化的细胞运动、Microspikes Filopodial强度

细胞运动和translocational速度测量通过手动跟踪每个细胞的细胞核的位移使用手动跟踪插件ImageJ [27]。速度与时间图,荧光强度图绘制使用Excel,箱形图创建使用棱镜(Graphpad软件公司,圣地亚哥,CA)。使用3点速度数据平滑滑动窗口的平均水平。Microspikes和丝状伪足标有ROI的利益(地区)行工具上的8位图像。统计使用学生的差异两个条件确定测试。统计分析和图表创建Excel和棱镜Graphpad 4.0软件。

3所示。结果

3.1。Filopodial行为和肌动蛋白交联蛋白定位在细胞迁移周期

B16F1小鼠黑色素瘤细胞被认为是一种能动的细胞类型,我们使用他们作为描述的动力学模型在运动性周期中肌动蛋白结合蛋白。我们首先定义这个细胞的一般运动特征线在不同的表面。长期延时图像获得了低倍镜下细胞在未经处理的玻璃和镀各种层粘连蛋白的浓度或纤连蛋白(数据没有显示)。之前的研究表明,脊椎动物细胞培养显示一个两相的运移速度响应随着ECM表面涂层浓度增加,可能与细胞表面粘附强度(28- - - - - -31日]。通过分析图像获得在相对较长的时间间隔(5分钟),分析测量translocational运动跟踪细胞的细胞核的位置,而不是测量质心变化与形状变化和突出。最优涂料浓度是52.5 g / mL层粘连蛋白或g / mL纤连蛋白导致平均B16F1细胞迁移速度为0.76±0.16,0.65±0.11分别m / min。

单个细胞的运动模式在最优条件下非常变量。细胞的速度测量的痕迹在16小时为代表细胞移动层粘连蛋白(图所示1(一))或纤连蛋白(图1 (b))。这些细胞的平均速度是正常的范围内各自的数量。在这两种情况下,细胞进入循环模式与他们的速度从大约0.1到1.5米/分钟。单个细胞可以在相对恒定速率期从1到2小时,或会显示快速波动运动。最重要的是,一个细胞平均速度“慢”的分布有时细胞移动的速度比高的平均速度。鉴于这种循环细胞的迁移行为,确定很重要在这个循环细胞驻留时问的相对定位蛋白质参与生成的能动性。这些蛋白质的定位可能遵循循环模式。因此接下来的分析蛋白质的定位是与细胞的迁移行为。

不同的细胞显示不同模式的内部组织的细胞骨架蛋白定位在他们的运动。我们专注于组织的肌动蛋白细胞骨架和丝状伪足有时发现在细胞的前缘。在图2的本地化的能动性周期期间mCherry-actin细胞类似于B1迁移周期的时间窗口,如图1 (b)是检查。的前缘lamellipodium推进从0到10分钟。最初,没有明显的丝状伪足,但他们在1.5分钟开始形成,其数量从1.5分钟增加到10分钟(图2(一个))。丝状伪足开始项目之外的前缘lamellipodium 8分钟。然后前缘开始收缩。在突出阶段(从1到8分钟),核位移速度很低(0.5m / min),丝状伪足,细长,lamellipodium内。的速度filopodial突出匹配的lamellipodial突出(图2和补充电影1网上doi: 10.1155 / 2010/507821)的选择来比板状伪足,丝状伪足伸出更快,有一阵核位移(1.9m / min)(图2和补充电影1)。在收缩阶段,当lamellipodium边缘收回向底座的丝状伪足,预计丝状伪足仍持续增长。胞体(核位移)继续推进速度0.8米/分钟。在这段时间里,似乎有力量把前面细胞和细胞后向底座的丝状伪足导致收缩战线和核位移向丝状伪足的基础。

filoopodial行为的另一个模式被发现在其他细胞移动。在细胞图所示3,静止的丝状伪足的数量(图3(一个)青绿色箭头),垂直于前缘和移动或突出lamellipodium,增加然后减少而细胞继续移动。在细胞运动,细胞膜外的丝状伪足开始突出。然而,像细胞分析在图没有收回2,丝状伪足开始横向移动而lamellipodium继续突出和细胞继续前进(图3,补充电影2)。不同于静止的丝状伪足,这些侧丝状伪足沿着lamellipodium或移向细胞的身体,消失在过渡区到达薄板(图3(一个)红色箭头,补充电影2)。这个细胞的速度不同;数量、类型和filopodial横向运动的速度变化(图3 (b))。此外,横向丝状伪足改变方向,逆时针移动从7.5到10.5分钟,然后切换到顺时针运动期间的电影。因此丝状伪足的外观并不一定信号运动性的易位的最后阶段。

丝状伪足的形成可以在细胞可视化coexpressing GFP-T-plastin mCherry-actin。T-plastin是一个肌动蛋白交联蛋白强烈本地化丝状伪足。最初,明亮的点(图4(一)青绿色箭头,)或fishtail-shaped长丝束(图4(一)青绿色箭头,和)成为可见的前缘lamellipodium。随后,这些结构拉长或相互融合形成独特的细长的丝状伪足(图4(一)青绿色箭头,)。GFP-T-plastin与肌动蛋白探针在整个长度的丝状伪足,(图4和补充电影2)。分析荧光强度的三个随机选择静止的丝状伪足的1分钟形象突出lamellipodium透露,两探针荧光强度的模式是最大的前缘,逐步减少对近端(图4 (b))。两个探测器的强度之比丝状伪足的等效沿整个长度。然而,对于丝状伪足外侧(图4(一)红色箭头,),肌动蛋白的荧光强度的技巧是强于T-plastin(图4(一),红色箭头;图4 (c))。这是延长的丝末端的丝状伪足没有T-plastin协会有了这些新的细丝,而不是从现有细丝T-plastin损失。这些结果表明,可能存在结构上的差异在安排这两种类型的肌动蛋白丝丝状伪足,影响肌动蛋白结合蛋白的亲和力。

我们下一个检查其他肌动蛋白结合蛋白的定位模式丝状伪足。Coexpression mCherry-T-plastin和α-actinin-1-GFP透露一个微分分布这两个肌动蛋白在静止的丝状伪足cross-linkers细胞迁移(图5(一个)和补充电影3)。α-actinin-1本地化强烈的近端部分丝状伪足,但缺席远端部分。T-plastin被发现在整个丝状伪足的长度,但在远端部分α-actinin-1缺席,弱在近端部分α-actinin-1强烈本地化(图5(一个))。没有本地化α-actinin-1可以看到明亮的点或短棒或fishtail-shaped长丝束发起filopodial建设。的α-actinin-1探针与T-plastin从中间丝状伪足的基础,尽管的荧光强度α-actinin-1相对比的T-plastin丝状伪足的底部(数字5(一个)和5 (c),补充电影3),对它们的相对占用肌动蛋白丝。在α-actinin-1-mCherry和coronin-1-GFP coexpressing细胞,GFP-tagged coronin-1板状伪足和丝状伪足(图5 (b)),但类似α-actinin-1,本地化只是板状伪足和静止的丝状伪足的基础。分析三个随机选择的丝状伪足透露,coronin-1的相对荧光强度α-actinin-1沿着丝状伪足的长度不同。底部的丝状伪足,coronin-1信号更强的比α-actinin-1但强度逆转丝状伪足的远端部分(图5 (d))。没有观察到明显的区别在肌动蛋白结合蛋白的分布固定和横向丝状伪足。我们的研究结果显示,不同的肌动蛋白交联蛋白优先本地化丝状伪足的不同部分。最主要T-plastin绑定远端部分,中间部分有相对更多α辅肌动蛋白和近端部分有三个但coronin-1比例相对较高。每个蛋白质可能扮演不同的角色在filopodial形成、运动和稳定。

3.2。横向丝状伪足机械链接与Lamellipodium肌凝蛋白II

我们已经表明,细胞迁移的变化周期与filopodial行为的变化(数据相关联2和3)。不同运动的丝状伪足,如固定与横向,可能代表不同的力量,一个细胞生成为了更有效地适应其微环境。的主要力量之一产生分子可能影响filopod运动是肌球蛋白II。我们可以想象横向丝状伪足的变换成actin-arcs B16F1细胞表达mCherry-actin和肌凝蛋白II-GFP(图64)和补充电影。这些数据与先前发表的观察是一致的在这些结构的成熟32,33]。

肌动蛋白弧的形成发生在细胞周期而前进的。在一个周期的开始,肌球蛋白II纳入knob-like结构在横向丝状伪足(图的基础6,和青绿色箭头)。接下来,肌球蛋白II传播向丝状伪足的技巧进行了横向运动(图6 ,)。有时这是紧随其后的是两个或两个以上的丝状伪足(图的合并6白色的箭头,)。最后,合并丝状伪足涂上绑定肌凝蛋白II形成肌动蛋白弧(图完成6,)。这些细胞中的肌动蛋白弧最终向后方的交通和向前移动的细胞(图6,4),补充电影。随着细胞不断向前发展,新的侧丝状伪足形成两岸的细胞和继续合并,向后面移动。因此肌凝蛋白II似乎没有必要丝状伪足的横向运动,但似乎参与丝状伪足的过渡细胞中肌动蛋白弧的身体。为了探索作用形成肌动蛋白肌球蛋白II的弧线,细胞表达mCherry-actin和肌凝蛋白II-GFP服用50M blebbistatin。在治疗之前,filopodial横向运动与肌球蛋白II协会可以观察到丝状伪足。后治疗,无论是新的还是先前存在的肌动蛋白弧可以观察(数据未显示)。由于肌动蛋白弧迅速消失在blebbistatin没有办法确定是否抑制肌球蛋白II影响他们的运动。

在图3(一个),外侧丝状伪足没有成为细胞肌动蛋白弧而在图6他们所做的。澄清这侧丝状伪足可能成为肌动蛋白弧线,我们检查了许多细胞coexpressed肌凝蛋白II-GFP mCherry-actin或肌凝蛋白II-GFP mCherry-T-plastin。细胞中有大量扇形板状伪足大大的过渡区,肌凝蛋白II没有达到,不能与近端外侧丝状伪足的结束。这些横向丝状伪足,不与肌球蛋白II,不要成为肌动蛋白弧,而是消失在过渡区(补充电影5)。然而,在细胞形状不规则的板状伪足,相对小的薄片和狭窄的过渡区域,相关的肌球蛋白II达到和近端外侧丝状伪足的结束。这些丝状伪足,与肌球蛋白II,经常成为肌动蛋白弧(补充电影6)。

为了解决问题的肌球蛋白II能否与静止的丝状伪足,我们研究了肌球蛋白II的定位固定在细胞丝状伪足大型扇形板状伪足和广泛的过渡区或不规则形状的板状伪足和狭窄的过渡区。在细胞与扇形板状伪足和广泛的过渡区(图7),强烈T-plastin本地化的前沿,而肌凝蛋白II在场的细胞。细胞伸出这张照片系列的持续从一开始,然后开始收缩(图7期间,补充电影7)。lamellipodial突出,大部分固定丝状伪足,细长,lamellipodium一起前进。然而,一些固定的丝状伪足观察增厚、然后退出了lamellipodial肌动蛋白网络,进入过渡区(图7,和箭头)。没有联系的肌球蛋白II可以观察到丝状伪足不管这些丝状伪足向后面移动。相比之下,细胞形状不规则的板状伪足和非常狭窄的过渡区域,肌球蛋白II出现与静止的丝状伪足(补充电影8)。因此,肌球蛋白II协会与丝状伪足似乎依赖于lamellipodium的形状和宽阔的过渡区,不是丝状伪足的运动。肌凝蛋白II和丝状伪足形成肌动蛋白的弧线很重要,然而,并不是所有横向丝状伪足或肌凝蛋白II丝状伪足成为肌动蛋白弧有关。只有肌凝蛋白II相关联的横向丝状伪足曾经观察到成为肌动蛋白弧。

在图6两边,有横向丝状伪足启动细胞的横向移动沿着lamellipodium然后合并进入细胞胞体而继续前进。我们下一个研究丝状伪足的运动细胞转变。这些细胞有横向移动的丝状伪足,但是在这种情况下,合并和收敛,而是丝状伪足都朝着相反的方向转变。在mCherry-T-plastin表达细胞(图8和补充电影9),横向移动外肉伪足发起顶部的细胞(图8、青绿色箭头),顺时针沿着lamellipodium(图8青绿色箭头)。细胞既不是朝着原来的方向lamellipodial突出(图8,黄金箭头)和横向移动的丝状伪足的方向(图8)。相反,细胞(图8,白色箭头)是前进的逆时针旋转,而横向丝状伪足在顺时针方向移动。没有肌凝蛋白II与这些协会的横向移动丝状伪足,表明这种类型的运动与其他力发电系统(补充电影10)。

激活cdc42导致装配vinculin含有焦复合物在细胞边缘,沿着和技巧不断增长的丝状伪足(3]。建议这些领域的密切接触可能提供瞬态安克雷奇网站向前突出的丝状伪足在迁移过程中(34]。我们有检查是否粘连的分子标记与横向丝状伪足使用GFP-tagged粘附蛋白标记,包括vinculin [35),蛋白(36)桩蛋白(37,38],zyxin [39]。没有明显的蛋白定位,桩蛋白,或vinculin侧可以观察到丝状伪足,尽管他们所有局部固定丝状伪足(数据没有显示)。Zyxin局部固定和横向丝状伪足。在mCherry-actin zyxin-GFP coexpressing细胞,zyxin与肌动蛋白在静止的丝状伪足的近端部分(图9,,绿色箭头和补充电影11)和暂时性的横向丝状伪足(图的长度9,粉色箭头)。然而,zyxin的存在并不代表坚持基础自zyxin-associated丝状伪足继续横向移动。

4所示。讨论

丝状伪足似乎是由许多细胞类型用作传感细胞器探索细胞外基质(ECM)和其他细胞的表面,确定合适的目标粘连,然后生成指导线索和牵引力量将胞体(40,41]。近年来,很多工作都集中在启动的机制和丝状伪足的形成,然而他们如何功能一旦形成在很大程度上仍然是未知数。很明显,许多不同的结构可以被丝状伪足的名义。这些结构的分子起源并不清楚。一些可能出现甲酸精介导的成核,而其他人则可能发生交联的现有的肌动蛋白丝束。

我们的研究结果支持协调前沿的生物力学观点突出和肌球蛋白II迁移细胞的收缩性。在这个视图中,丝状伪足形成肌动蛋白聚合之间的机械连接网络的前沿和肌球蛋白马达活动。为板状伪足内丝状伪足源自肌动蛋白树突网络(8),他们都被认为是直接连接到lamellipodial肌动蛋白网络。丝状伪足也粘连的起始位点。因此,当一个马达蛋白结合丝状伪足,产生收缩力,力量将传递给粘连和板状伪足。因此,该filopodia-myosin II系统允许肌动蛋白聚合,肌球蛋白II力量,和粘附机械协调。

灯丝捆绑filopodial需要稳定,肌动蛋白细丝不是有效地推动。它已经表明,fascin丝状伪足的主要肌动蛋白交联蛋白(17,18和对丝状伪足的形成至关重要19]。我们的结果表明,T-plastin丝状伪足的形成中可能起着重要的作用。它存在在丝状伪足的生命周期,从fish-tail-shaped起始点,通过伸长和运动。指定的融合模型,锥形或fish-tail-shaped结构是丝状伪足启动(先决条件8]。允许高效的推动,预计交联的纤维发生聚合后不久,这样个人丝最后一个交联后的有效长度是短。T-plastin是丰富的远端部分丝状伪足和板状伪足表明T-plastin协会发展的肌动蛋白束发生在与肌动蛋白组装。T-plastin之一可能是filopodial尖端复杂的组件负责连接肌动蛋白丝的带刺的结束。T-plastin存在横向和静止的丝状伪足,暗示在丝状伪足的形成和运动是很重要的。

其他肌动蛋白结合蛋白也与丝状伪足,但有一个非均匀分布的肌动蛋白结合蛋白以及丝状伪足的长度。T-plastin通常是与整个丝束,除了在横向丝状伪足的技巧,α辅肌动蛋白存在于中间部分,coronin 1更多的底部。T-plastin和α辅肌动蛋白属于同一calponin-homology (CH)域总科和一个高度保守的f -肌动蛋白绑定域(ABD) [42- - - - - -47])。Coronins是一个高度保守的家庭的成员与守恒的基本的氨基端主题和三到十WD重复集中在一个或两个核心域(Uetrecht AC &熊我,2006)。他们绑定丝状肌动蛋白和lamellipodial Arp2/3复杂和发挥重要作用的突出和全细胞活性48- - - - - -50]。由于丝状伪足认为包含连续长肌动蛋白丝,这些蛋白质的机制不同绑定相同的不同部分肌动蛋白细丝是极大的兴趣。ABP的绑定属性的可能在某些方面监管外肉伪足内,或可能会有一些不同的肌动蛋白丝本身改变不同绑定蛋白的亲和力。值得注意的是绑定蛋白肌动蛋白细丝可以改变肌动蛋白螺旋的转折和改变其他分子的结合亲和力51,52]。也有可能ATP / ADP的肌动蛋白的核苷酸结合是重要的调节蛋白结合丝(53]。

我们的研究结果表明,丝状伪足可持久和逃避解聚与肌球蛋白II和关联后进入胞体形成肌动蛋白弧。这些结果符合Nemethova et al。33),但不同于那些Medeiros等人的发现肌凝蛋白II切断肌动蛋白束板状伪足的底部54]。在细胞迁移周期,固定丝状伪足发起和细长而细胞继续前进。接下来,静止的丝状伪足开始项目超出了前缘。在这一点上,细胞会继续与丝状伪足伸出和迁移横向移动,或开始收回前缘。前缘缩回时,胞体仍然可以把前进直到收缩停止。这表明没有肌动蛋白聚合,收缩可能导致胞体易位。因此,部队由前缘突出或胞体收缩会导致向前移动。

以前,肌球蛋白II据报道已经缺席板状伪足的鱼,可见(55]。然而,肌动蛋白和肌球蛋白II显示高度相关分布在lamellipodium之间的过渡区和胞体在大鼠胚胎成纤维细胞(56],鱼表皮可见[55)和神经生长锥(54两种蛋白质),集中在独特的弧形纤维(54- - - - - -56]。弧形的肌动蛋白丝经常可以观察到下背薄板表面扩散和迁移细胞(57,58]。这些肌动蛋白弧领先平行板状伪足(58]。Hotulainen和Lappalainen报道,肌动蛋白生成弧α-actinin-decorated肌动蛋白丝和肌凝蛋白组装竖着束形成收缩结构(59]。然而压力纤维不可能扮演了一个重要的角色在细胞高度等。发现肌凝蛋白II和横向丝状伪足参与actin-arc组装(显示15,32,33]。在这里,我们提供更详细的肌球蛋白II协会与新形成的弧线。我们假设横向丝状伪足,肌球蛋白II和板状伪足的联系,可以生成一个前沿的细胞生物力学力量。支持这一假设,我们研究了许多细胞的运动和形状横向和/或静止的丝状伪足和肌凝蛋白的关系。当细胞大,扇形lamellipodium和广泛的过渡区,肌球蛋白II的定位似乎局限于胞体和薄板,并不是与横向或静止的丝状伪足。当细胞小,形状不规则的板状伪足和狭窄的过渡区,肌球蛋白II不仅是细胞的身体和薄板,而且lamellipodium的后面。肌凝蛋白II在这些细胞可以与丝状伪足,横向和静止。因此,肌球蛋白II协会与丝状伪足细胞取决于lamellipodium的形状,和宽阔的过渡区。然而,肌动蛋白弧的形成取决于丝状伪足的横向运动和肌凝蛋白二世的协会。外侧filopodia-myosin II系统可以提供额外的力量这些细胞没有完美的板状伪足前进。 Actin cross-linking proteins can bundle long actin filaments together to form filopodia, which not only become efficient at pushing the cell membrane, but also efficient at pulling the cell body. In our filopodia-myosin II model, myosin II is linked to filopodia in the lamellipodium and the actin cortex and adhesions in the lamella and cell body. This would allow myosin II to provide the actual pulling forces to retract the cell body.

丝状伪足的行为有三种模式在这些细胞。在一些细胞,它们长不动,然后消失了。当横向移动的丝状伪足出现时,在某些情况下,他们从双方和聚合中心的细胞,和在其他情况下所有丝状伪足朝着一个方向。如果没有filopodial横向运动或有运动融合,细胞通常会继续直接。filopodial运动可能是部队的结果应用于细胞骨架,或迫使生成机制的一部分。我们假设当横向丝状伪足两边发起一个细胞,由丝状伪足的横向运动的力量平衡,因此细胞可以直接移动。当横向丝状伪足发起从一边的一个细胞,应用于细胞的力量不平衡和细胞。我们提出一个模型的远端外侧丝状伪足的两端与肌动蛋白相关网络lamellipodium和近端结束相关的细胞的细胞骨架。当横向丝状伪足发起lamellipodium从一边,远端结束正在沿着lamellipodium和导致力量应用于lamellipodium通过近端。继续lamellipodial突出但伸出的肌动蛋白聚合的力量现在受到或结合横向丝状伪足的力,因此细胞形状和变化。 Thus, cells do not simply move in the direction of actin polymerization or the direction of contractile force, but rather they move in the direction that is the sum of the various forces. Thus, it is likely that the coordination of actin polymerization, adhesion dynamics and myosin activity modulate cell migration velocity and direction.

确认

本文是由国立卫生研究院的资助R01 GM40599 d Knecht博士。作者非常感谢肯尼斯·m·山田提供GFP-vinculin博士GFP-paxillin, GFP-talin构造。他们也感谢钱罗根博士提供mCherry质粒,卡罗尔博士Otey提供α肌凝蛋白II-GFP -actinin1-GFP,劳拉博士Machesky,塞尔吉奥·格林博士coronin 1-GFP。作者感谢朱丽叶Lee博士有价值的讨论。

补充材料

引用

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