评价X-Inactivation地位和人类皮肤成纤维细胞的细胞遗传学稳定后长期的文化

文摘

人类主要成纤维细胞是一个受欢迎的类型的体细胞诱导多能干细胞(iPS)细胞的生产。这里我们基本成纤维细胞的生物学特征特性细胞生长速率、细胞遗传学稳定性和不活跃的X染色体的数量在长期使。我们生产八行女人类皮肤成纤维细胞(HDFs),发现正常核型和预期的模式X染色体失活(XCI)在低通道(通道P1-5)。然而,四的八HDF线在高段数字()表现出重复的标志不活跃的X染色体包括两个强调信号组蛋白H3赖氨酸27 trimethylation (H3K27me3)和X inactive-specific成绩单(XIST)在大约8.5 - -18.5%的细胞RNA信号。我们的数据表明,不活跃的X染色体拷贝数的一个子集的女性HDF是增加了一个双重的。一致,DNA荧光原位杂交(FISH)确定3 - 4 X染色体的副本在一个原子核在这个子集不活跃的细胞有两个X。我们得出结论,女性HDF文化表现出更高的风险的基因异常,如携带X染色体的数量增加包括活跃的和不活跃的X染色体在一个较高的通道()。

1。介绍

成纤维细胞是最常用的体细胞产生诱导多能干细胞(iPS)细胞(1,2]。因此,至关重要的是确定的遗传和表观遗传稳定性成纤维细胞在长期的文化。它已经表明,长期的在体外体细胞的文化细胞衰老的风险增加,染色体非整倍性,以及multiploidy分析(3,4]。然而,表观遗传基因调控的潜在变化在人类成纤维细胞长期培养的调查并不好。

剂量补偿X染色体的女性在哺乳动物细胞是一种表观遗传基因调控的经典例子。它是通过一个事件被称为X染色体失活(XCI)的两个X染色体是在开发过程中沉默5- - - - - -7]。XCI X-inactivation中心发起的X染色体,其中一个基因编码X inactive-specific成绩单(XIST仅仅灭活的X染色体)表示。XIST基因对XCI至关重要,因为它直接与非编码RNA和外套不活跃的X染色体。XCI完成后,女性的两个X染色体细胞由微分转录的区别XIST基因、DNA甲基化和组蛋白修饰,如组蛋白H3赖氨酸27 trimethylation (H3K27me3) [8,9]。

在这项研究中,人类皮肤成纤维细胞(HDFs)成功来自八个不同的女性捐赠者。然后我们检查细胞生长速率,XCI在短期和长期稳定的通道。我们发现女性HDFs的早期文章保留正常核型与预期XCI模式而high-passage细胞表现出更高的风险的多个副本不活跃的X染色体由于X染色体的三个或四个副本的存在在一个核。

2。材料和方法

2.1。推导和HDFs的细胞培养

这个研究项目伦理委员会批准和监控在南京医科大学第一附属医院。书面知情同意了所有8女病人之前收集他们的皮肤组织标本。组织标本用磷酸缓冲盐(PBS)解决方案与100 U /毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升。脂肪和结缔组织被移除,表皮被操作刀片刮掉。残余组织被剪成几块约1毫米³种植,然后统一到25厘米的底部²烧瓶。烧瓶内,然后倒放在5%的股份有限公司₂孵化器在37°C。八小时后,然后把烧瓶。培养基由杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM、pyruvate-free high-glucose配方;英杰公司)补充20%胎牛血清(的边后卫;英杰公司)。培养基是改变每3天。7天的潜伏期后,我们检查了HDF外植体组织块。当细胞达到80 - 90%的融合,文化是分裂的比率1:2。

2.2。监测细胞增殖率

细胞通过5 - 10在6-well培养板的密度每口井。培养基再次改变了每3天。六天后,8 HDF细胞系的生长曲线通过计算得到细胞的数量/每24小时。

2.3。核型分析

进行了核型分析每个HDF细胞系通过Giemsa-banding (G-banding)段落5 - 10之间。当80 - 90%融合达到25厘米²瓶,培养基是0.1改变和补充μ从10 g / mL秋水仙胺的解决方案(稀释μg / mL,猫。不。15212 - 012。英杰公司)。15个小时后,收集细胞和悬浮在5毫升的0.075米氯化钾溶液。然后暂停孵化37°C 30分钟。2毫升的固定液(甲醇:冰醋酸1:3)添加和混合在一起,然后这些细胞被收集。两轮固定后,细胞悬液是安装在75°C到幻灯片和烤3小时。常规染色体G-banding分析然后进行。每张幻灯片二十分析检查。

2.4。免疫荧光和荧光原位杂交(FISH)

2.4.1。细胞的准备

细胞在通道1、5、10每一行被收集。细胞被镀在幻灯片或盖玻片后冲洗三次1 x PBS 5分钟然后用4%多聚甲醛固定在室温下20分钟。然后用1 x PBS细胞被洗了三次,存储在EtOH 70%为后续分析。所有试剂用于RNA与diethylpyrocarbonate鱼准备——(DEPC -σ)治疗H₂O。

2.4.2。XIST RNA鱼

细胞被洗了三次1 x PBS和70%乙醇脱水2分钟,90%乙醇为2分钟。然后在37°C细胞杂化一夜之间杂交缓冲(50%甲酰胺/ 2 x标准柠檬酸盐(SSC)使用Cy3-hXD1-3探针如前所述在[10]。第二天,盖玻片与杂交缓冲冲洗两次30分钟每个在37°C一旦1 x PBS。随后,添加DAPI 5分钟之后,细胞被安装到幻灯片。

2.4.3。H3K27me3免疫荧光

上述细胞准备冲洗和孵化顺序通过以下过程:细胞与1 x PBS冲洗三次,孵化100年Triton x - 1 x PBS + 0.4%(σ)20分钟再冲洗1 x PBS在室温下的三倍。阻塞的非特异性染色进行10% normalgoat血清1 x PBS 1小时在室温下,一夜之后,这些细胞被孵化与一只兔子anti-H3K27me3抗体(1:1000年,从更新生物技术,美国)在4°C调湿室。1 x PBS的细胞随后被冲洗三次,孵化1小时在黑暗中与FITC-conjugated二级抗体(1:200年,北京钟山金桥生物技术有限公司,中国)。1 x PBS的细胞被冲洗三次,复染色与4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI Vysis, Inc .,,美国),5分钟后,安装到幻灯片。

2.4.4。X染色体DNA的鱼

幻灯片是沉浸在2 x SSC溶液罐,摇晃了5秒,10分钟后删除。杂交领域,和变性温度的解决方案(70%甲酰胺/ 2 x SSC)维持在73°C。大约5分钟后,幻灯片在70% EtOH脱水1分钟,1分钟85% EtOH紧随其后,然后1分钟EtOH 100%。同时,探测器混合制备和放置在一个73°C水浴5分钟。10μL探针混合物被添加到一个又一个目标区域的盖玻片立即被应用。然后幻灯片被置于prewarmed湿润箱在一夜之间37°C。第二天,在盖玻片被从一个幻灯片,幻灯片立即沉浸在0.4 x SSC解决方案2分钟70°C。最后,幻灯片是在黑暗中脱水和10μL复染色的应用到目标区域的幻灯片和盖玻片补充道。商用探针(Vysis Inc .,,美国)针对X染色体的着丝粒区域(绿色荧光)是用来评估X染色体的细胞的数量。

信号随后由荧光显微镜检测。二百个细胞进行随机从每个文化,数字信号在每个细胞核数。

3所示。结果

3.1。形态和增殖率的HDF

HDFs被成功分离和扩大从8种不同的女性组织标本。第一次接种24小时后,真皮组织完全坚持烧瓶底部和HDFs开始在接下来的日子里成长。当HDFs融合达到80 - 90%,他们通过所述材料和方法。10通道内,很少的细胞表现出衰老包括膨胀、树状,细胞死亡。生长曲线表明,HDF缓慢增加的数量后在第一个24小时。从24到96小时,HDF数量成倍增长。HDF细胞从96到144小时后进入固定相(图1)。

3.2。HDF的核型分析

G-banding进行确定8 HDF细胞系的分析,结果表明,每种文化表现出正常核型在20中期检查前10通道内传播(数据没有显示)。

3.3。分析的X染色体失活和X染色体拷贝数的不同段落的HDFs

H3K27me3疣状,XISTRNA鱼用来检测XCI模式。H3K27me3密集点状的信号之一被发现在大多数HDF细胞核内通道1和5(图2)。偶尔,我们还发现细胞表现出零或两个强调染色信号。随机选择和计算核的数量后0,1,2 H3K27me3信号,我们发现细胞的数量没有H3K27me3点状的信号出现在更高的通道数增加(表1)。的XISTRNA鱼分析产生相同的结果作为H3K27me3疣状(图3)。

有趣的是,在四个总量的8个细胞系(# 1、2、3、8),我们的统计数据显示,两个积极的信号XISTRNA涂层或H3K27me3染色不活跃的X染色体的出现在约% HDF细胞通道10(数字2和4)。与不活跃的X染色体的增加数量一致,少数细胞显示三个或四个X染色体DNA的信号副本鱼总数X染色体的分析。我们的统计数据显示,大约6%的细胞表现出三份的X染色体和16%有四个X染色体的拷贝(图4)。

4所示。讨论

多能细胞被认为是再生医学的主要资源,和成纤维细胞是最常用的细胞类型产生“诱导多能性”细胞重编程(1,2]。为了生产高质量“诱导多能性”细胞,成纤维细胞的生物学特性首先必须重组前的特点。这些包括细胞生长状态,稳定的X染色体失活等细胞遗传学和表观遗传状态。

细胞衰老研究的先驱,海弗利克是第一个建立一个可靠的协议保持纤维母细胞生长在体外(11]。早期研究表明,HDFs可以达到50岁以上人口倍增在衰老,但其增殖能力取决于和活检供体的年龄(12]。在我们的文化中八女HDF线,与梭状细胞形状和衰老表型是最小的在早期的文章,表明细胞内通过10是健康的。尽管如此,在体外文化仍可能影响培养HDFs的遗传和表观遗传稳定。通过计算使细胞数量后,我们绘制细胞生长曲线,表明细胞在潜伏在第一个24小时后细胞的通道。然后细胞迅速扩散指数增长阶段从24到96小时,进入固定相(图96 - 144小时1)。

以前的在体外文化研究报告自发突变克隆在大多数物种,特别是在啮齿动物,通常在5 - 7段落。这些突变克隆有异常核型形成包括染色体非整倍性和multi-ploidy分析(3]。在我们的结果中,我们没有发现任何明确异常核型形成通过标准G-banding核型分析。然而,在X-inactivation现状的详细分析,我们发现部分细胞(8.5 -18.5%)一半的文化(四个八HDF行)表现出两份以上的x染色体。我们的数据表明,识别不活跃的X染色体的数量XIST RNA鱼或鱼的X染色体DNA分析总数是一个更敏感的方法来检测染色体变异比标准G-banding核型分析。

XCI是一项基本在女性体细胞表观遗传机制,涉及X-linkage基因的剂量补偿(13]。任何不当X-linkage基因的剂量的变化会影响体细胞的正常功能。研究人类女性胚胎干细胞(ESC)线表示,XCI在使这些线的模式可能会改变。XIST基因表达在培养hESC线路不稳定,受到表观遗传沉默了DNA甲基化(10]。在这项研究中,XIST基因RNA鱼和H3K27me3进行免疫荧光检测XCI状态通道1、5、10 HDF细胞。结果表明,在大部分细胞核XCI只有一个信号(绿色现货H3K27me3或红斑XIST观察RNA),很少的细胞没有XCI标记(数字2和3)。倾向于增加细胞数量没有XCI信号连同HDF人口倍增(表),这可能是DNA甲基化的XIST子沉默表达(10]。此外,两个XISTRNA信号耦合与3 - 4信号同样可以观察到X染色体的核在几个细胞通道10(图4)。两个的存在XISTRNA信号表明两份不活跃的X染色体,与X染色体总数量的增加保持一致。

总之,我们现在的研究表明,早期的段落的女性HDF文化比文化经过10通道基因更稳定。通过监测XCI地位和不活跃的X染色体的数量,我们可以有效地确定人类女性体细胞的染色体倍性改变的细胞培养。基因组稳定性的信息是很重要的对于评估这些细胞是否适合其他应用程序,如诱导多能干细胞在再生医学的推导。

确认

这项研究得到了国家973年和863年计划(2006号。2006 cb944005 aa02z4a4, 2011 cb965102), PCSIRT(没有。IRT0631),江苏省医学科学基金会(JHB06-13号、LJ200606 XK200702)。作者Zhi-Gang雪、独到的风扇和Jia-Yin刘同样的贡献。

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