决定因素出现在受体羧基尾巴负责Subtype-Specific耦合的差异<年代vg style="vertical-align:-4.698pt;width:13.15px;" id="M1" height="21.9375" version="1.1" viewbox="0 0 13.15 21.9375" width="13.15" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 肾上腺素能受体,磷酸肌醇3-Kinase

有趣的是它已经表明,刺激<年代vg height="17.262501" id="M21" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术还可以招募GRK膜。的相互作用<我>βar与GRKs亚型主要是通过细胞内循环和羧基尾巴的受体5]。当激活时,GRK诱发某些丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化的两个羧基的尾巴<我>βar亚型导致功能分开他们的主要受体的信号通路。GRK2磷酸化也有利于随后的互动<我>β-arrestin。这与<我>β-arrestin进一步逐渐脱敏受体和随后参与受体的内吞作用[6,7]。

羧基的尾巴GRK与分子相互作用因素的受体,我们假设不同的耦合<年代vg height="17.262501" id="M22" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> - - -<年代vg height="17.262501" id="M23" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术与PI-3K可能是由于位于受体的这一部分的决定因素。本研究旨在确定各自的效率<年代vg height="17.262501" id="M24" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,<年代vg height="17.262501" id="M25" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术来刺激PI-3K通路并验证上述假设。

2。材料和方法

2.1。DNA结构、细胞转染和文化

小鼠<年代vg height="17.262501" id="M26" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术和人类<年代vg height="17.262501" id="M27" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术subcloned pcDNA3被用于这项研究。两个嵌合受体组成的<年代vg height="17.262501" id="M28" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的第七个跨膜域和羧基末端尾巴的<年代vg height="17.262501" id="M29" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术和互惠<年代vg height="17.262501" id="M30" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的第七个跨膜域和羧基末端尾巴的<年代vg height="17.262501" id="M31" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术建立了如下。Hpa限制网站我是由聚合酶链反应(PCR)在2070的位置<年代vg height="17.262501" id="M32" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术。网站的新限制<年代vg height="17.262501" id="M33" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的诞生与三个引物。两个引物用于杂交与受体序列。这些引物包含21个碱基对和,分别CGCCTCAGAAGCCATAGAGCC和TCGTGTGCACAGTGTGGGCCA序列。第三个引物是用来介绍网站的限制。因为这篇文章包含24个碱基对有下列顺序:GGTGGAAAGCGTTAACCACGTTGG。变异的<年代vg height="17.262501" id="M34" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,<年代vg height="17.262501" id="M35" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar wt与Hpa I和双消化Xho即消化的结果是两个片段的突变的6540个基点和486个基点<年代vg height="17.262501" id="M36" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术和两个片段5998个基点和1362个基点<年代vg height="17.262501" id="M37" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar wt。适当的限制片段(包含第七个跨膜域和受体的carboxy-terminal部分)被孤立,对同行交换,religated。阳性克隆被酶消化和测序确认选择。

的<我>β基于“增大化现实”技术的野生型(wt)嵌合受体,显性负PI-3激酶(p85ΔPI-3K),和/或carboxy-terminal GRK2域(ct-GRK2)是暂时性的转染人类胚胎肾细胞(HEK 293)使用磷酸钙沉淀的方法。在48小时posttransfection我们进行实验,即在最大受体表达取决于配体结合。一夜之间,细胞被饿死在实验前24小时没有胎牛血清的培养基。HEK 293个细胞在DMEM补充维持10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素和链霉素,谷氨酰胺1毫米,0.25<我>μ克/毫升二性霉素b的氛围中95%的空气/ 5%的公司<年代ub>2在37<年代up>°c .当天实验,细胞治疗1<我>μM表示时间和分馏的异丙肾上腺素胞质或膜隔间。在一些实验中,细胞使用百日咳毒素(0.1<我>μg / mL;σ),18小时前与异丙肾上腺素刺激。

2.2。制备胞质和膜分数

细胞被洗了三次10毫升的磷酸盐在4<年代up>°C和机械分离1毫升的冰冷的缓冲区包含5毫米Tris-HCl, pH值7.4,2毫米EDTA, 5<我>μg / mL亮抑酶肽,5<我>μ10 g / mL大豆胰蛋白酶抑制剂,<我>μ克/毫升苯甲脒。细胞被细胞溶解与超声发生器(3在最高速度的10秒),和溶菌产物离心机在1000×4 g 5分钟<年代up>°c .上层清液离心机在45 000×g 20分钟,被认为是胞质制备。蛋白质含量是评估使用布拉德福德方法(Bio-Rad)。250年resuspended颗粒状膜<我>μL增溶的缓冲区(缓冲)包含50毫米三pH值7.5,20毫米<我>β氟化钠甘油磷酸盐,20毫米,5毫米EDTA, EGTA 10毫米,1毫米Na<年代ub>3签证官<年代ub>4PMSF,苯甲脒10毫米,0.5毫米,10<我>μg / mL亮抑酶肽,5毫米德勤,1<我>μM国内外LR,特里同x - 100 1%;和可溶性2小时4<年代up>°c .然后膜离心机在000 g×15分钟。蛋白质含量是评估使用Lowry方法(Bio-Rad)。

2.3。放射性配体结合试验

放射性配体结合试验进行了本质上如前所述[8与~ 5]<我>μg的膜蛋白总量为0.5毫升含有250点<年代up>125年我]10 CYP的存在与否<我>μ米阿普洛尔定义非特异性结合。绑定在室温下反应是孵化90分钟和终止通过与冰冷的25毫米Tris-HCl快速过滤,pH值为7.4,在绘画纸GF / C玻璃纤维过滤器preincubed≥30分钟在缓冲区包含25毫米Tris-HCl, pH值7.4,0.1%的牛血清白蛋白,0.3%的表面进行。

2.4。西方墨点法

西方墨点法进行了如前所述[9]。简单地说,50 - 75整除<我>μg的胞质或膜蛋白制剂受到10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(如前所述)。转移了Trans-Blot SD半干转移细胞(Bio-Rad) Protran硝化纤维素膜(曼德尔、蒙特利尔、QC、加拿大)。用朱红色年代染色蛋白质传输效率进行评估。膜被封锁在TBS-T使用脱脂奶粉5%(10毫米三(pH值7.4),150毫米氯化钠,和0.05%渐变20)和膜孵化在4<年代up>°与初级抗体(C隔夜anti-Phospho-Akt (Ser 473)和anti-Akt从细胞信号技术,(米瑟索格族、加拿大)或anti-PI-3K,反<年代vg height="17.262501" id="M38" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ——或者反<年代vg height="17.262501" id="M39" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术从圣克鲁斯(美国加州)稀释1:1000 TBS-T 5%脱脂奶粉。随后,膜清洗和孵化了45分钟在室温下用二次抗体(稀释1:5000 5%脱脂奶粉到TBS-T)结合辣根过氧化物酶。膜清洗和接触科学成像膜(珀金埃尔默生命科学、)或量化使用柯达ImageStation 440 cf使用增强化学发光试剂(珀金埃尔默生命科学)。带强度进行了分析使用柯达1 d v.3.5.5科学成像软件。

2.5。免疫组织化学和受体内化

封存的<我>β基于“增大化现实”技术被immunolocalisation观察。受体激动剂治疗后,与PBS和3%多聚甲醛固定细胞被洗15分钟。这些洗后,非特异性的网站被封锁0.2% BSA和0.15% Triton x - 100(屏蔽解决方案)10分钟。主要抗体(<年代vg height="17.262501" id="M40" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> - - -<年代vg height="17.262501" id="M41" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 从圣克鲁斯ar),准备在屏蔽解决方案(1:200),在室温下增加了30分钟。一系列的洗,二次抗体(antirabbit、圣克鲁斯)也准备在屏蔽解决方案(1:50 0)增加了30分钟。最后一系列洗后,幻灯片被安装和使用徕卡epi-illumination显微镜查看。

2.6。PI-3K活动

PI-3K活动测量如前所述[10]。简单地说,250 - 375<我>μg的胞质和胞膜蛋白沉淀anti-phosphotyrosine抗体conjuged生物素(1:50,加州圣克鲁斯、美国)一夜之间在4<年代up>°c .免疫复合物是颗粒状(与链霉亲和素珠子),洗了三次裂解缓冲和两次磷酸盐缓冲包含0.1毫米Na<年代ub>3签证官<年代ub>4。然后免疫颗粒悬浮在激活缓冲区(35 mM ATP, 0.2毫米腺苷,MgCl 30毫米<年代ub>2、L - 10毫克/毫升<我>α磷脂酰肌醇,20<我>μCi<年代vg height="20.275" id="M42" style="vertical-align:-3.56265pt;width:43.224998px;" version="1.1" viewbox="0 0 43.224998 20.275" width="43.224998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> atp;加拿大(Amersham法玛西亚生物技术,Baie-d 'Urfe)和在室温下孵化20分钟。100年的反应是停止的<我>μL盐酸1米和200<我>μL氯仿:甲醇(1:1)。水相的被丢弃。八十年<我>μL盐酸:甲醇(1:1)被添加到水相在丢弃之前。二十<我>μL的有机相<年代up>32P-phosphatidylinositol通过薄层色谱法来解决在转K6硅胶板(绘画纸,克利夫顿,新泽西,美国)在溶剂系统中含有氯仿:甲醇:氢氧化铵(45:35:10)。盘子被暴露于电影(80−3到5天<年代up>°C)。

2.7。统计分析

结果表示为±SEM和评估使用方差分析用于因子实验设计。必要时进行正交化(11]。<年代vg height="11.375" id="M43" style="vertical-align:-0.1638pt;width:50.549999px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.549999 11.375" width="50.549999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。的表达<我>β基于“增大化现实”技术的亚型和P85ΔPI-3K HEK 293个细胞

HEK 293细胞是暂时性的转染与互补dna编码<年代vg height="17.262501" id="M44" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的Wt,<年代vg height="17.262501" id="M45" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的Wt,<年代vg height="17.262501" id="M46" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,或者<年代vg height="17.262501" id="M47" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,在某些情况下,p85ΔPI-3K。转染后48小时<我>βar表达水平约500 fmol /毫克的蛋白质(10 - 20 fmol相比/毫克untransfected细胞)。表达p85ΔPI-3K由免疫印迹增加3.24倍比野生型细胞(数据没有显示,<年代vg height="11.125" id="M48" style="vertical-align:-0.1638pt;width:36.237499px;" version="1.1" viewbox="0 0 36.237499 11.125" width="36.237499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> )。

3.2。的刺激<年代vg height="17.262501" id="M49" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术而不是<年代vg height="17.262501" id="M50" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术诱发PI-3A / Akt通路的激活

PI-3K激活的<年代vg height="17.262501" id="M51" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ——或者<年代vg height="17.262501" id="M52" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术测定L -的体外磷酸化<我>α磷脂酰肌醇。转染细胞与异丙肾上腺素刺激1<我>μM 0、5、15分钟37<年代up>°c的刺激<年代vg height="17.262501" id="M53" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar - 5到15分钟诱导显著增加PI-3K活动相比,基础条件(nonstimulated;图1)。相比之下,<年代vg height="17.262501" id="M54" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激没有影响PI-3K活动。因此,刺激<年代vg height="17.262501" id="M55" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术而不是<年代vg height="17.262501" id="M56" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术由异丙肾上腺素诱导激活PI-3K在我们的模型中。我们怀疑PI-3K激活明显高基础水平观察到在我们的细胞系可能是由于phosphotyrosine PI-3K抗体用于免疫沉淀反应激活。我们使用这种抗体,免疫沉淀反应其他PI-3K亚型以及phosphotyrosine蛋白质,虽然没有激活<我>β基于“增大化现实”技术可能仍为基底的激活水平作出贡献。

图1

PI-3K活动<我>β基于“增大化现实”技术的刺激 μ ■ 2 。HEK 293细胞转染基于“增大化现实”技术,或者基于“增大化现实”技术。转染后48小时,细胞被刺激与1M表示时报异丙肾上腺素。PI-3K活动是由水平的决定- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -π的刺激产生的基于“增大化现实”技术()或基于“增大化现实”技术()表达细胞。上面板是一个代表性的放射能照像TLC分离()。从这些实验数据是量化在底部面板中所描述的部分。与0分钟。

确认两个刺激之间的差异<我>β基于“增大化现实”技术的亚型PI-3K活动中,我们使用的一种蛋白激酶(下游PI-3K效应)激活。Akt激活,473年由丝氨酸的磷酸化状态后显著增加<年代vg height="17.262501" id="M65" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> -AR-stimulation 5和15分钟比基底状态(图2)。的刺激<年代vg height="17.262501" id="M66" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术没有修改一种蛋白激酶的磷酸化状态控制相比,确认<年代vg height="17.262501" id="M67" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术激活不能刺激pi3激酶/ Akt通路的激活。与异丙肾上腺素刺激untransfected HEK293没有导致任何重要的Akt激活(数据没有显示)。

图2

一种蛋白激酶激活后<我>β基于“增大化现实”技术的刺激 μ ■ 2 。HEK 293细胞转染基于“增大化现实”技术,或者基于“增大化现实”技术。48小时后,转染细胞被刺激,1M表示时报异丙肾上腺素。Akt激活状态是一种蛋白激酶的磷酸化形式由免疫印迹的总量相比Akt的刺激基于“增大化现实”技术()或基于“增大化现实”技术()表达细胞。上面板是一个代表免疫印迹实验()。从这些实验数据是量化在底部面板中所描述的部分。与0分钟。

3.3。刺激的<年代vg height="17.262501" id="M75" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 或者<年代vg height="17.262501" id="M76" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术诱发PI-3K招聘到质膜

以确定是否<年代vg height="17.262501" id="M77" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术可以招募PI-3K质膜,immunolocalisation PI-3K用免疫印迹anti-P110执行<我>γ抗体。暂时性的转染细胞<年代vg height="17.262501" id="M78" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ——或者<年代vg height="17.262501" id="M79" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术是由异丙肾上腺素刺激1<我>μM 0、5、15分钟37<年代up>°c两<年代vg height="17.262501" id="M80" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> - - -<年代vg height="17.262501" id="M81" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激导致招聘PI-3K颗粒分数(图3)。相比之下,控制(即。,nonstimulated cells), the presence of PI-3K was significantly increased (<年代vg height="11.375" id="M82" style="vertical-align:-0.1638pt;width:50.549999px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.549999 11.375" width="50.549999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> )的膜受体激动剂刺激的分数<年代vg height="17.262501" id="M83" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,或者<年代vg height="17.262501" id="M84" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的5到15分钟。没有发现显著差异之间的5和15分钟的刺激。因此,要么亚型<我>β基于“增大化现实”技术可以招募PI-3K膜受体激动剂后刺激但只有<年代vg height="17.262501" id="M85" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术导致PI-3K激活。

图3

PI-3K分区PI-3K的膜 μ μ ■ 2 。转染后48小时,细胞被刺激与1M表示时报异丙肾上腺素。膜分离、可溶性和大约100克10% sds - page凝胶膜蛋白分离。膜相关PI-3K与细胞表达水平增加基于“增大化现实”技术()或基于“增大化现实”技术()。上面板是一个代表免疫印迹实验()。从这些实验数据是量化在底部面板中所描述的部分。与0分钟。

3.4。招聘PI-3K质膜是G<我>βγSubunit-Dependent

它已经表明,PI-3K和GRK2形成胞质复杂2]。确定PI-3K招聘到质膜的机制是G<我>βγsubunit-dependent,<年代vg height="17.262501" id="M91" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ——或者<年代vg height="17.262501" id="M92" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar与羧基末端部分(ct)瞬变cotransfected GRK2 (G的螯合剂<我>βγ)在HEK 293细胞。细胞cotransfected<年代vg height="17.262501" id="M93" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ——或者<年代vg height="17.262501" id="M94" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar和ct-GRK2刺激与1<我>μ异丙肾上腺素5分钟。ct-GRK2转染独处时没有影响PI-3K活动。刺激的<年代vg height="17.262501" id="M95" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar 5分钟与异丙肾上腺素在细胞cotransfected ct-GRK2导致显著降低(<年代vg height="11.375" id="M96" style="vertical-align:-0.1638pt;width:58.712502px;" version="1.1" viewbox="0 0 58.712502 11.375" width="58.712502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 颗粒分数(图)PI-3K招聘4),而刺激<年代vg height="17.262501" id="M97" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar表达了孤独。当细胞表达了类似的结果<年代vg height="17.262501" id="M98" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术是刺激与受体激动剂5分钟,也就是说,ct-GRK2显著下降(<年代vg height="11.375" id="M99" style="vertical-align:-0.1638pt;width:58.712502px;" version="1.1" viewbox="0 0 58.712502 11.375" width="58.712502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 膜(图)PI-3K招聘4)。因此,PI-3K招聘的质膜<年代vg height="17.262501" id="M100" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ——或者<年代vg height="17.262501" id="M101" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激是G<我>βγsubunit-dependent虽然只有<年代vg height="17.262501" id="M102" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 在随后的PI-3K激活-AR-dependent招聘结果。

图4

GRK2 carboxy-terminal域降低PI-3K招聘膜分数来响应<我>β基于“增大化现实”技术的刺激 β μ ■ 2 。cotransfected ct-GRK-2和HEK 293个细胞基于“增大化现实”技术的子类型。48小时后,转染细胞被刺激,1异丙肾上腺素5分钟。pi3激酶招聘与细胞表达颗粒分数降低基于“增大化现实”技术()或基于“增大化现实”技术()存在cotransfected ct-GRK2。上面板是一个代表免疫印迹实验()。从这些实验数据是量化在底部面板中所描述的部分。与0分钟。

3.5。PI-3K / Akt通路激活后嵌合的刺激<年代vg height="17.262501" id="M108" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,<年代vg height="17.262501" id="M109" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术

确定针对受体因素的重要性<我>βar羧基尾巴PI-3K激活,我们构造了两种嵌合的受体由<年代vg height="17.262501" id="M110" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的近端第七跨膜域和carboxy-terminal尾巴的<年代vg height="17.262501" id="M111" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(<年代vg height="17.262501" id="M112" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术)以及由相应的受体<年代vg height="17.262501" id="M113" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的carboxy-terminal尾巴<年代vg height="17.262501" id="M114" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(<年代vg height="17.262501" id="M115" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术)。当<年代vg height="17.262501" id="M116" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术刺激了1<我>μ异丙肾上腺素5 - 15分钟,pi3激酶活性显著增加(图5;<年代vg height="11.375" id="M117" style="vertical-align:-0.1638pt;width:50.549999px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.549999 11.375" width="50.549999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> )。另一方面,激动的刺激<年代vg height="17.262501" id="M118" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的5到15分钟没有导致pi3激酶活动增加。这些结果表明,carboxy-terminal尾巴的<年代vg height="17.262501" id="M119" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术包含分子pi3激酶激活所需的决定因素。

图5

PI-3K活动与嵌合<我>β基于“增大化现实”技术的刺激 μ ■ 2 。HEK 293细胞转染基于“增大化现实”技术,或者基于“增大化现实”技术。转染后48小时,细胞被刺激与1M表示时报异丙肾上腺素。PI-3K活动是由水平的决定- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -π的刺激产生的基于“增大化现实”技术()或基于“增大化现实”技术()表达细胞。上面板是一个代表性的放射能照像的TLC分离()。从这些实验数据是量化在底部面板中所描述的部分。与0分钟。

确认结果两嵌合PI-3K激活介导的<我>β农业研究所,我们再次确定一种蛋白激酶的激活状态。嵌合受体刺激了1<我>μM异丙肾上腺素为0、5、15分钟或37<年代up>°c .一种蛋白激酶磷酸化是显著增加(<年代vg height="11.375" id="M128" style="vertical-align:-0.1638pt;width:50.549999px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.549999 11.375" width="50.549999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> )在HEK 293细胞表达<年代vg height="17.262501" id="M129" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(图6)。的刺激<年代vg height="17.262501" id="M130" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术由异丙肾上腺素没有影响一种蛋白激酶磷酸化与基底条件。因此嵌合<年代vg height="17.262501" id="M131" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术增加了一种蛋白激酶磷酸化和确认的carboxy-terminal尾巴<年代vg height="17.262501" id="M132" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar包含分子PI-3K激活的必要且充分的决定因素。

图6

一种蛋白激酶活性与嵌合<我>β基于“增大化现实”技术的刺激 μ ■ 2 。HEK 293细胞转染基于“增大化现实”技术,或者基于“增大化现实”技术。48小时后,转染细胞被刺激,1M表示时报异丙肾上腺素。Akt活动是由测量水平的磷酸化Akt相比总刺激产生的一种蛋白激酶基于“增大化现实”技术()或基于“增大化现实”技术()表达细胞。上面板的代表免疫印迹试验()。从这些实验数据是量化在底部面板中所描述的部分。与0分钟。

3.6。百日咳毒素治疗的效果<我>β基于“增大化现实”技术PI3-K活动的刺激

建议PI-3K的刺激<年代vg height="17.262501" id="M140" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(百日咳毒素敏感1,12]。确定百日咳毒素的效果<我>βPI-3K ar诱导刺激,我们培养的细胞PTX 18个小时后跟一个刺激和1<我>μ异丙肾上腺素15分钟。我们的研究结果表明,在PTX面前,没有激活PI-3K观察<年代vg height="17.262501" id="M141" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激(图7(b))。在嵌合的受体,PTX治疗与嵌合废除PI-3K观察到的激活<年代vg height="17.262501" id="M142" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(图7(d))。符合我们之前数据,无论是<年代vg height="17.262501" id="M143" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(图7(一))也没有<年代vg height="17.262501" id="M144" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(图7PTX预处理(c))敏感。这些结果表明,刺激PI-3K<年代vg height="17.262501" id="M145" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术是百日咳毒素敏感。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图7

百日咳毒素的影响<我>β-AR-mediated PI-3K激活 μ μ 1 2 。26小时后转染细胞被孵化,0.1g / mL百日咳毒素18个小时。细胞被刺激与1 5分钟M异丙肾上腺素前处理薄层色谱图中描述和部分。PI-3K活动是由水平的决定- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -π的刺激产生的基于“增大化现实”技术(一)基于“增大化现实”技术(b),基于“增大化现实”技术(c)ar表达细胞。(;对基底和PTX-Iso条件)。

3.7。参与PI-3K激活<我>β基于“增大化现实”技术的封存

细胞表达<年代vg height="17.262501" id="M153" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术与异丙肾上腺素治疗15分钟。刺激后,很少<年代vg height="17.262501" id="M154" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 室内隔间的基于“增大化现实”技术观察细胞治疗和观察无显著差异存在的cotransfected p85ΔPI-3K或PTX预处理(数据8(一)8(d))。相比之下,我们观察到显著的内化<年代vg height="17.262501" id="M155" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术在类似时间的受体激动剂刺激集群分布如图所示的受体(图8(f);细胞的轮廓定义糟糕的在这个特定的条件)。<年代vg height="17.262501" id="M156" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的内化是抑制的要么cotransfected p85ΔPI-3K或PTX预处理(数据8(g)和8(h))。这些结果confimed功能PI-3K封存的很重要<年代vg height="17.262501" id="M157" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术和证明的有效性我们p85ΔPI-3K cotransfection或PTX预处理。

图8

p85ΔPI-3K减少agonist-induced<年代vg height="14.475" id="M158" style="vertical-align:-3.13504pt" version="1.1" viewbox="0 0 14.9375 14.475" width="14.9375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 2 基于“增大化现实”技术的封存 β μ 。HEK 293细胞转染p85ΔPI-3K和两个基于“增大化现实”技术的子类型。细胞被刺激与1异丙肾上腺素15分钟(b)和(f)的刺激基于“增大化现实”技术- - - - - -transfected细胞诱导集群分布特征的受体内化(f)。这封存被废除的要么cotransfected p85ΔPI-3K (g)或PTX预处理(h),没有明显的ar封存观察在不同条件下用于这些实验(一)- (d)。代表图像的几个实验()所示。

4所示。讨论

当前研究的结果表明,刺激<年代vg height="17.262501" id="M162" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,但不<年代vg height="17.262501" id="M163" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,诱发PI-3K百日咳toxin-sensitive激活的机制。这subtype-dependent Akt激活增强了事实,下游PI-3K效应,也有选择性地激活<年代vg height="17.262501" id="M164" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激。然而,这两种受体亚型可以招募PI-3K等离子体膜通过G<我>βγsubunit-dependent机制。那加普拉萨德et al。2]曾表明,PI-3K和GRK2形成胞质复杂和质膜的酶的招聘是通过G<我>βγ子单元agonist-dependent方式。我们的研究结果证实,PI-3K招募到质膜通过G<我>βγsubunit-dependent机制。GRK-2 PI-3K招聘到质膜很重要,因此我们认为这可能表明,羧基末端PI-3K激活的受体是重要的领域,因为羧基末端的域<我>βar包含网站由GRK2磷酸化。此外,Shiina et al。13)表明,羧基末端域和第三胞质循环区域主要负责内化行为之间的差异<我>β基于“增大化现实”技术的子类型。

确定潜在的羧基末端领域的贡献<年代vg height="17.262501" id="M165" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> - - -<年代vg height="17.262501" id="M166" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的PI-3K激活,嵌合<年代vg height="17.262501" id="M167" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> - - -<年代vg height="17.262501" id="M168" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的第七个跨膜域和羧基末端域已经交换了。我们观察到,嵌合<年代vg height="17.262501" id="M169" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术可以激活PI-3K与野生型<年代vg height="17.262501" id="M170" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术。相反地,<年代vg height="17.262501" id="M171" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> ar失去了能力,激活PI-3K carboxy-terminal域是用来交换的<年代vg height="17.262501" id="M172" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术。这个结果证明了<年代vg height="17.262501" id="M173" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的羧基末端域包含PI-3K激活的重要分子的决定因素。

目前的研究证实PI-3K激活<年代vg height="17.262501" id="M174" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激中观察到其他研究[2,12]。然而PI-3K激活之前报道的动力学<年代vg height="17.262501" id="M175" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激是本研究中观察到的不同。PI-3K迅速激活<年代vg height="17.262501" id="M176" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激和10分钟后回到基础水平。在我们的研究中,我们观察到一个重要PI-3K激活以5分钟<年代vg height="17.262501" id="M177" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激,保持15分钟后。激活模式的差异可能是由于所使用的受体激动剂浓度。在前面的研究(2),10<我>μM使用异丙肾上腺素比这里使用的浓度高出10倍。更高浓度的受体激动剂可能诱发更快速PI-3K招聘的膜,从而激活酶更快,但也可能刺激机制终止这些信号。

预处理和百日咳毒素导致的损失PI-3K激活<年代vg height="17.262501" id="M178" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的刺激其他研究中确认结果(1,12]。本研究提供的新信息是carboxy-terminal部分受体受体之间的相互作用是非常重要的,刺激胃肠道heterotrimers(取决于G<我>α和G<我>βγ子单元),PI-3K。事实上,嵌合受体<年代vg height="17.262501" id="M179" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术可以激活PI-3K百日咳毒素敏感而嵌合受体机制<年代vg height="17.262501" id="M180" style="vertical-align:-4.0404pt;width:50.075001px;" version="1.1" viewbox="0 0 50.075001 17.262501" width="50.075001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术无法激活PI-3K。然而,其他地区满激活受体可能也很重要的或法规响应的脱敏机械。

我们的研究结果表明isoproterenol-stimulated<年代vg height="17.262501" id="M181" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术(15分钟)不能激活PI-3K。这些结果与报道的一项研究中激活PI-3K刺激后观察<年代vg height="17.262501" id="M182" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的转染HEK 293细胞(2]。几个可能可以解释这两项研究之间的差异。首先,1<我>μM异丙肾上腺素虽然轻快足以引起高频的腺苷酸环化酶活性(8)不能诱导PI-3K激活。其次,在我们的研究中我们使用暂时性的转染细胞表达约500 fmol受体/毫克的膜蛋白,更接近生理水平比看到那加普拉萨德的研究等。2]。之间的相互作用也很明显,两个受体的信号和内化机械不同,尽管他们可以与许多相同的蛋白质。这项研究提供了另一个这样的例子,<年代vg height="17.262501" id="M183" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,<年代vg height="17.262501" id="M184" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术导致PI-3K GRK2招聘;信号和脱敏的结果对这些事件是明显不同的。一些研究也表明,<年代vg height="17.262501" id="M185" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,形成鲜明对比<年代vg height="17.262501" id="M186" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,不能激活<年代vg height="15.5125" id="M187" style="vertical-align:-3.27605pt;width:16.0875px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.0875 15.5125" width="16.0875" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> (14而另一些人认为它可以(15]。有可能是其他细胞和组织因素可能控制这些事件。

在这项研究中,我们观察到<年代vg height="17.262501" id="M188" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的内化是占主导地位的存在抑制负面PI-3K p85ΔPI-3K,结果,类似于之前的研究2,16]。我们也观察到,<年代vg height="17.262501" id="M189" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的封存和百日咳毒素预处理可以废除。相比<年代vg height="17.262501" id="M190" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术,我们观察到<年代vg height="17.262501" id="M191" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术的封存与15分钟的刺激最小。这类似于10%封存中观察到<年代vg height="17.262501" id="M192" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 铃木获得的ar表达细胞et al。17]。自磷酸化产生的脂质PI-3K是受体内化的关键动力学(18,19),它是合理的,弱者封存的观察<年代vg height="17.262501" id="M193" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术可能是由于弱PI-3K激活受体亚型的刺激引起的。结果百日咳预处理和p85ΔPI-3K还表明,激活PI-3K对受体封存很重要。

总之,我们观察到PI-3K激活<我>βar特定亚型的差异是由于分子因素出现在carboxy-terminal尾巴的受体。PI-3K激活百日咳毒素敏感和封存的是必要的<年代vg height="17.262501" id="M194" style="vertical-align:-4.0404pt;width:16.3375px;" version="1.1" viewbox="0 0 16.3375 17.262501" width="16.3375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink"> 基于“增大化现实”技术。

确认

第二作者是一个学者的昏聩de la矫揉造作的魁北克健康,心脏与中风基金会和栅网在桑特Cardiovasculaire。第四作者Chercheur国家的昏聩de la魁北克桑特精心设计的。第五作者是一个学者的昏聩de la魁北克桑特精心设计的。这项工作受到了国家科学与工程研究委员会加拿大(250234 - 07)。