优化组合Insulin-Transferrin-Selenium和胎牛血清的海藻酸兔关节软骨细胞在三维支架的文化

文摘

胎牛血清(的边后卫)据报道,影响软骨细胞单层培养的生物合成。Insulin-Transferrin-Selenium(它)是调查部分替代的边后卫在体外培养的兔关节软骨细胞在三维藻酸盐支架。Chondrocyte-seeded海藻酸水凝胶在杜尔贝科修改鹰的培养基培养是加上10%的边后卫,1% + 2%的边后卫,1%加上4%的边后卫,或者1% + 8%的边后卫。在设计时间点,Chondrocyte-seeded海藻酸水凝胶是收获和评估组织染色技术、免疫组织化学和定量基因表达分析。活细胞密度和细胞分裂也被评估。软骨细胞生物合成和细胞分裂在1%与2%的边后卫介质是类似于中添加10%的边后卫。总共3周的文化,表型的基因表达在chondrocyte-seeded水凝胶是维持在高水平中有1%加上2%的边后卫,虽然在其他组不同程度下降。总之,有1%,中有2%的边后卫可以促进软骨细胞生物合成和细胞分裂,并阻止细胞去分化三维藻酸盐支架。

1。介绍

在单层培养的软骨细胞去分化的倾向(1,2],串行扩展在单层培养的软骨细胞肉瘤逐渐降低II型胶原蛋白的生产(3,4]。因此,为了维持软骨细胞的表型,三维支架是组织工程(5- - - - - -7]。海藻酸水凝胶是一种常用的软骨组织工程支架。长期固定文化后,兔关节软骨细胞在藻酸盐凝胶仍表现出代谢活动,分工的模式,以及合成和分泌细胞外基质的大分子如II型胶原和蛋白聚糖(8]。软骨细胞的同种异体的植入藻酸盐凝胶测试体内重建的人为full-thickness-damaged兔关节软骨(9]。因此,在这项研究中,海藻酸被选为一个三维支架。

目前,基本培养基补充10%的边后卫是用于提高细胞在体外软骨细胞的三维培养活动。然而,据报道,的边后卫将导致细胞增殖过度(10]或软骨细胞表型不稳定(11]。研究表明,Insulin-Transferrin-Selenium(其)阻止人类软骨细胞去分化和推广高品质的形成人类透明软骨组织工程(12]。它被用作基线中补充有关软骨移植组织体外研究,以及软骨细胞扩张或再分化13,14]。然而,Insulin-Transferrin-Selenium和胎牛血清的最佳结合的文化兔关节软骨细胞在三维藻酸盐支架没有被广泛研究。

在这项研究中,假设一个体积小的边后卫在中有1%可以维持细胞外基质合成和维持软骨细胞生物活性的海藻酸水凝胶。为了选择一个合适的边后卫浓度、培养基补充1%加上2%的边后卫,1% + 4%的边后卫,1% + 8%的边后卫,或中等+ 10%的边后卫被选为兔软骨细胞的三维培养。软骨细胞的生理、生化特性播种在海藻酸水凝胶进行了评估与组织学染色、免疫组织化学、定量基因表达分析。

2。材料和方法

2.1。培养基

基础培养基是high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco),抗坏血酸盐(50g / mL),青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100g / mL)。基础培养基添加1% Insulin-Transferrin-selenium(它;Gibco) + 2%胎牛血清(的边后卫;表达载体),1%加上4%的边后卫,1%加上8%的边后卫,或10%的边后卫chondrocyte-seeded水凝胶的体外文化。

2.2。隔离和软骨细胞的文化

还是雄性新西兰兔软骨细胞是隔绝的。兔子被麻醉过量牺牲。膝盖、臀部、肘关节软骨片收获,剁碎,然后洗了三次在PBS。这些碎片在0.25%胰蛋白酶消化30分钟C,其次是消化在0.2% (w / v)胶原酶II为3小时。与70年消化后,暂停过滤不锈钢网。上层清液中的细胞释放被离心法收集(100克/分钟、5分钟)。孤立的软骨细胞被洗了三次,计算血细胞计数器的台盼蓝染料排斥。软骨细胞在DMEM停牌的边后卫和100 U /毫升青霉素10%和10050 g / mL链霉素,克/毫升抗坏血酸盐和培养在烧瓶的初始密度细胞/。软骨细胞是孵化C, 5%,95%的湿度,媒介改变了每三天。融合细胞收获和subcultivated 80%。

1.5% (w / v)海藻酸(σ)解决方案在0.01 PBS准备和消毒过滤通过0.22米孔隙大小polyethersulfone过滤器(微孔)。第二代软骨细胞用于播种在1.5%海藻酸溶液的密度细胞/毫升。藻酸盐支架封装,孤立的软骨细胞resuspended 1.5%海藻酸的解决方案。chondrocyte-alginate悬架用移液器吸取到8毫米直径使硅烷化塑料戒指(150L /环)24-well盘子和稠化10分钟通过添加过量体积的102毫米₂,然后环和Ca₂解决方案被移除。设计,各种媒体被添加到24-well盘子和放置在一个细胞培养孵化器。每三天之后,媒体被改变。

2.3。软骨细胞的形态学海藻酸水凝胶培养在各种媒体

软骨细胞的形态和增殖海藻酸水凝胶培养在各种媒体使用倒置相差显微镜检查(奥林巴斯)。

2.4。扩散分析

细胞活动的软骨细胞培养支架被麻省理工估计(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)测定。在这项研究中,一个改良MTT试验采用根据Zund等人报告(15]。总之,在不同的时间点,800年无血清培养系统L和80年L MTT方法在PBS(5毫克/毫升)被添加到每个样本,其次是孵化MTT甲瓒形成C为4小时;然后中被转换后的染料溶解在800年L 10%十二烷基硫酸钠(SDS)在0.01 M盐酸。毕竟晶体可溶性,溶液的光密度是决定在570 nm SDS溶液为空白使用ELISA板读者。四个并行复制读取所有样本。

2.5。组织学和Imunohistochemistry

梗塞部位水凝胶在星期1和星期3收获。收集样本在PBS隔夜paraformalydehyde固定在4%C,然后洗,在分级乙醇脱水,二甲苯清除,嵌在石蜡中。6部分m是通过样品的横截面和准备组织学和免疫组织化学检查。有些部分与甲苯胺蓝染色染料溶液。

免疫组织化学分析,进行免疫组织化学检测软骨细胞标记II型胶原蛋白的表达。部分胃蛋白酶处理0.4% 30分钟C用PBS洗净处理0.6%在甲醇,再冲洗PBS。胶原蛋白的免疫组织化学染色然后执行与兔子II型胶原抗体(Calbiochem,在PBS)在晚上c .下列操作进行了使用链霉亲和素/过氧化物酶(SP)染色工具包(SP - 9002,中山金桥生物技术有限公司有限公司)根据制造商的指示和最后的颜色是diaminobenzidine (DAB-kit,矢量)。细胞核与迈耶的苏木精复染色(σ)和嵌入式显微镜幻灯片使用中性胶(σ)显微镜检查。在整个实验过程中,操作是严格控制并为每个样本染色的时间是相同的。

2.6。通过半定量实时PCR定量基因表达分析

半定量的实时PCR进行确定软骨细胞分化的基因表达(II型胶原蛋白和aggrecan核心蛋白),和去分化(I型胶原蛋白)。在星期1和星期3,总RNA chondrocyte-seeded水凝胶是由试剂盒提取试剂(Gibco)根据生产的指令。RNA样本转换为互补DNA与RevertAid(互补)^TM第一个链cDNA合成装备(Fermentas)根据生产的建议。引物的兔子Glyceraldehyde-3-phosphatase脱氢酶(GAPDH看家基因),胶原蛋白I型,胶原蛋白II型,Aggrecan核心蛋白质与引物设计表达v 3.0软件(应用生物系统公司)与资源库,并炮轰数据库非常具体的引物序列。引物序列如下所示:

胶原蛋白II型: 转发:-CAGGATGTCCAGGAGGCT -相反:-GCAGTGGCGAGGTCAGTAG -;胶原蛋白I型: 转发:-GCAACTTGAACAAGGCTGTC -反向:-CAAGGAAGGGCAAACGAG -;Aggrecan: 转发:-CGAGAATCAAATGGAGCCG -反向:-CACAACACCTTTCACCACGAC -;GAPHD: 转发:-ATGTTTGTGATGGGCGTGAA -反向:-TGGAGGCAGGGATGATGTT -。

半定量的实时PCR进行25L反应系统,程序运行35周期。最终产品与1.5%琼脂糖凝胶电泳分离和结果进行了分析与紫外线指数图像软件经过凝胶图像捕捉系统(Bio-Rad)。

2.7。统计评估

所有数值数据提出了平均值±标准平均误差(SEM)。组之间的区别被学生的评估以及。在统计学上意义重大。

3所示。结果

3.1。软骨细胞的形态学海藻酸水凝胶培养在各种媒体

为了揭示了细胞培养的形态学三维海藻酸水凝胶在不同媒体、细胞培养7、14、21天检查。

之间没有显著差异观察软骨细胞培养下四种测试媒体。似乎增长模式、细胞聚合、殖民和利率之间的测试组相似的从一开始文化时期的结束。软骨细胞在藻酸盐凝胶培养在不同的媒体可以看到形成细胞胰岛细胞与球形骨料,可以保持典型的软骨细胞的外观(数据没有显示)。

3.2。扩散分析

MTT试验进行测量细胞的可行性。图1显示软骨细胞培养的细胞生存能力与不同媒体在不同的时间点,没有显著差异(四组之间)。此外,在所有组软骨细胞的细胞的异常增加了与文化时间和软骨细胞开始进入日志阶段约为6天。

3.3。组织学和免疫化学分析

生产葡糖氨基葡聚糖(笑话)海藻酸水凝胶的软骨细胞培养在各种媒体证实了甲苯胺蓝染色(图2)。为chondrocyte-seeded海藻酸水凝胶在培养基培养补充1% + 2%的边后卫21天,软骨细胞和细胞外基质的重要染色为集群是指出,表明大量呕吐软骨细胞周围的基质中积累。组织培养的培养基与染色显示最低的8%和10%,这似乎是明显不同于其他人。

免疫组织化学染色的软骨细胞海藻酸水凝胶培养在各种媒体中看到数字3。为II型胶原染色显示重大pericellular矩阵染色chondrocyte-seeded海藻酸水凝胶在培养基培养补充1%加上2%的边后卫,在中有1% + 4%的边后卫。然而,组(数据3 (c)和3 (d))培养中补充了1%与10%加上8%的边后卫和介质的边后卫,染色是不积极的。数据显示,中补充1% +低的边后卫更有利于软骨细胞生产和沉积II型胶原等细胞外基质分子和GAG-containing蛋白聚糖。

3.4。定量基因表达的软骨细胞海藻酸水凝胶在不同媒体

半定量rt - pcr分析显示胶原蛋白II,胶原蛋白I, aggrecan表达式的软骨细胞海藻酸水凝胶培养与不同媒体(图4)和五个实验的数据代表。在第一周,aggrecan表达的组织培养中有1% + 2%的边后卫,介质为1% + 4%的边后卫是大于其他测试组;在星期3,aggrecan表达的组织培养中有1% + 2%的边后卫,中有1%加上4%的边后卫,介质为1% + 8%的边后卫在中等略高于10%的边后卫。在第一周,chondrocyte-seed海藻酸水凝胶在培养基培养为1% + 2%的边后卫表示最高水平的II型胶原蛋白与其他三组相比,在星期4,组织培养中有10%的边后卫II型胶原蛋白的表达水平最低,而那些培养中有1% + 2%的边后卫,中有1%加上4%的边后卫,介质为1% + 8%的边后卫保持相对较高的II型胶原蛋白的表达。除此之外,在星期3,chondrocyte-seeded水凝胶在培养基培养的1%加上8%的边后卫和介质的10%的边后卫表示相对高水平的I型胶原蛋白,表明软骨细胞表型的丢失。相比之下,那些培养中有1% + 2%的边后卫保持低水平的I型胶原蛋白的表达。这些结果表明,介质为1% + 2%的边后卫足以维持软骨细胞表型在藻酸盐凝胶。

4所示。讨论

本研究的最终目标是找到一个最优组合和胎牛血清的海藻酸兔关节软骨细胞在三维支架的文化。血清可以为细胞的生长提供营养,促进细胞合成和胎牛血清是经常所选元素的文化软骨细胞(15- - - - - -18]。然而,增加血清会导致软骨细胞改变其形态学特征成为单层培养更成纤维细胞的去分化(19,20.]。此外,与血清中补充导致过度退化组织肿胀和外植体属性(21]。最近,一些报告(14,22]显示潜在的或无血清培养的软骨细胞体积小的血清。商用其被用于这项研究支持细胞生长在低血清培养基。它证明中补充了1% + 2%的边后卫能够促进软骨细胞增长和降低体外培养软骨细胞的去分化过程。因为只有1%的培养基培养软骨细胞有一个相对贫穷的增长率,这些数据我们没有礼物。

无血清或low-serum文化,大多数先前的报道集中在单层。由于三维文化可以维持表型在很长一段时期,它是更实际的调查血清在三维培养的软骨细胞支架的影响。这是证明,藻酸盐支架生物材料具有巨大的潜力为软骨组织工程软骨组织支架(5,8,9,23),因此我们采用海藻酸水凝胶作为一种三维支架。

在藻酸盐凝胶,软骨细胞分布在整个网络的球形形态学矩阵和维护。软骨细胞种植在不同的培养基,观察甲苯胺蓝染色的显著差异和II型胶原免疫组织化学。与其他测试组相比,密集的染色显示软骨细胞培养在培养基补充1% + 4%的边后卫以及1% + 2%的边后卫。这些结果表明,减少百分比的边后卫可以促进软骨细胞表型的维护。半定量结果反向transcriptase-polymerase连锁反应分析也支持这个建议。在培养7天后,II型胶原蛋白和aggrecan的mRNA表达所有标本和I型胶原蛋白的表达太差了。然而,经过较长时间的文化,四组之间的差异被发现;I型胶原蛋白的表达成为明显的软骨细胞培养中有1% + 4%的边后卫,介质为1% + 8%的边后卫,和中有10%的边后卫,而表达水平保持在低位的软骨细胞培养中有1% + 2%的边后卫。

总之,1%补充加上2%的边后卫导致更高的分化能力虽然高容量的边后卫导致更少的细胞外基质在长期的文化积累。减少动物的数量用于血清培养基从10%到2%在三维软骨工程提供了有价值的影响。然而,需要做进一步研究探讨机械变化对海藻酸水凝胶在这种培养基。

5。结论

这项研究表明,介质补充1% + 2%的边后卫可以刺激软骨细胞增殖,提高软骨基质合成。此外,1%的存在降低了软骨细胞去分化的过程。软骨细胞播种在藻酸盐凝胶可以维持软骨细胞表型中补充下长周期文化1%加上2%的边后卫,这可能是广泛应用于三维组织工程软骨细胞培养。

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