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m . Zimowska a . Duchesnay p . Dragun a . Oberbek j . Moraczewski马特里, ”Immunoneutralization的TGF1改善骨骼肌再生:对成肌细胞分化和粘多糖含量的影响”,国际细胞生物学杂志》上, 卷。2009年, 文章的ID659372年, 16 页面, 2009年。 https://doi.org/10.1155/2009/659372
Immunoneutralization的TGF1改善骨骼肌再生:对成肌细胞分化和粘多糖含量的影响
文摘
受伤时破碎,修复slow-twitch比目鱼肌鼠肌肉,不同于增大联盟,与纤维化有关。作为TGF1,活动可以由葡糖氨基葡聚糖(呕吐),在肝纤维化中起着重要的作用,我们假设的TGF水平1和恶作剧的内容可以解释这个微分再生的质量。在这里,我们表明,再生的比目鱼肌是伴随着升高和更持续的TGF1级反伊斯兰教英国防御联盟。中和的TGF1影响TGF抗体1或其受体TGFr1改善肌肉修复,特别是比目鱼肌,增加成肌细胞的体外生长,加速他们的分化。这些过程都伴随着呕吐内容的改变。这些结果表明,TGF的控制1活动是重要的受伤的肌肉,加快提高再生成肌细胞分化,部分通过咽肌细胞构成环境的变化。
1。介绍
骨骼肌再生的反应有很大的能力伤害或疾病(<一个href="#B1">1,<一个href="#B2">2]。再生过程归因于单核的细胞中发现的成人骨骼肌位于质膜和基板之间的肌肉纤维。最近的研究表明,这些所谓的卫星细胞是一个异构的人口组成的干细胞和祖细胞(了<一个href="#B3">3- - - - - -<一个href="#B6">6])。刺激肌肉纤维受损,卫星细胞进入细胞周期激活;他们融合在一起或肌纤维以恢复肌肉结构和功能或多或少的效率(<一个href="#B2">2,<一个href="#B7">7,<一个href="#B8">8]。
大多数肌肉是快和慢的马赛克纤维(<一个href="#B9">9,<一个href="#B10">10]。由于其组成、比目鱼肌的肌肉和肌肉的增大趾长伸肌肌腱牵向前(edl)被广泛用作模型,因为它们在大部分或几乎完全由缓慢或快速纤维相互地类型,这取决于动物物种。研究这两种肌肉损伤的再生反应,诱导,例如,通过microlesion [<一个href="#B11">11]或麻醉剂注射(<一个href="#B12">12,<一个href="#B13">13),发现不同的方式这两种肌肉得到修复。尤其是在整个肌肉挤压模型大鼠比目鱼肌发生纤维化与反伊斯兰教英国防御联盟肌肉再生正确(<一个href="#B14">14]。
卫星细胞参与肌肉修复的内在特性的微分修复过程可能导致快速和慢速在大鼠骨骼肌。一些研究,包括我们之前的作品<一个href="#B13">13,<一个href="#B15">15- - - - - -<一个href="#B17">17)报道,成肌细胞分离肌肉,或快或慢的生长在体外显示一些微分生长和分化特性。成肌细胞的差异从快和慢的肌肉保持独立的表型转变引起的肌肉纤维的慢性电刺激。
细胞因子和生长因子的活动可以提出考虑微分骨骼肌再生慢速和快速的特点。在生长因子调节再生过程,这些属于转化生长因子β(TGFβ)家庭似乎肌肉发展中扮演特定的角色和受伤后(<一个href="#B18">18]。在1980年代和显示TGF之后β负调节肌肉细胞增殖和分化<一个href="#B19">19]。这个细胞因子也可以影响肌肉损伤后再生肌纤维类型模式(<一个href="#B20">20.]。此外,TGFβ家庭成员是众所周知的发挥主要作用在纤维化发展和疤痕形成,因为他们刺激细胞外基质(ECM)生产、调节的表达ECM-degrading酶和蛋白酶抑制剂(<一个href="#B21">21,<一个href="#B22">22]。在C2C12成肌细胞细胞系,TGFβ1可以刺激自己的合成以自分泌的方式和触发细胞分化成myofibroblasts在受伤的肌肉<一个href="#B23">23]。TGFβ1也与纤维化在先天性肌肉萎缩症和杜氏的萎缩症(<一个href="#B24">24- - - - - -<一个href="#B26">26]。因此,细胞因子启动在骨骼肌纤维级联需要受阻(<一个href="#B24">24,<一个href="#B27">27,<一个href="#B28">28)和减少TGFβ1表达或活动会出现承诺改善肌肉修复,所显示早期的研究(<一个href="#B25">25,<一个href="#B29">29日]。
差异矩阵组件环境也可以诱发肌肉再生能力特别是占整个肌肉的粉碎模型。肌肉环境对居民的再生能力有深远的影响肌肉前体细胞和植入细胞(<一个href="#B30">30.,<一个href="#B31">31日]。在ECM组件和膜相关组件,导致细胞环境,蛋白聚糖(后卫)参与许多生理和病理过程,如酶调节,细胞粘附、生长、迁移、分化(<一个href="#B32">32,<一个href="#B33">33]。PG的影响主要是由于粘多糖(GAG)这些分子的一部分,主要是硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸dermatan / chondroitine硫酸盐(c / d)(见[<一个href="#B34">34,<一个href="#B35">35评论])。特别是,海关在骨骼肌发育和生理中起着重要作用[<一个href="#B36">36]。我们已经证明,海关在分化成肌细胞(增加<一个href="#B37">37]。ECM合成生长因子包括TGF水库β(<一个href="#B38">38,<一个href="#B39">39]。属于肌肉动力环境中,其中一些decorin等实验,betaglycan涉及TGF的规定β在骨骼肌生物利用度,调节肌细胞生成过程(<一个href="#B26">26,<一个href="#B40">40]。人们普遍认为,TGFβ信号是由其绑定蛋白聚糖betaglycan TGF然后β我和受体II型异质二聚体从一个信号转导<一个href="#B41">41- - - - - -<一个href="#B43">43]。尽管TGFβ被绑定到betaglycan核心蛋白(<一个href="#B44">44在呕吐),修改这个PG调节TGF的一部分β绑定TGFβ受体和调节下游信号(<一个href="#B45">45]。因此,熟悉组织损伤后呕吐的内容和组成可能是特别重要的在组织修复过程的理解。TGF等分泌细胞因子之间的平衡β和插科打诨网络可能代表体内平衡机制旨在控制骨骼肌修复过程。
目前研究的主要假设是,TGFβ1水平至少可以部分占比目鱼肌的微分再生能力和EDL肌肉通过调节成肌细胞分化和恶作剧的细胞环境。TGF的障碍β使用注射anti-TGF活动实现β1或anti-TGFβ我(T受体βRI)抗体成碎比目鱼肌或EDL体内肌肉或治疗肌母细胞的主要文化孤立从肌肉与这些抗体。这些治疗方法的影响进行了分析肌肉再生和成肌细胞分化。注意力还集中在石斑鱼的环境卫星细胞和再生肌肉。总的来说,结果表明,转化生长因子β1和笑料相互作用在调节肌肉修复和成肌细胞分化。
2。材料和方法
2.1。材料
杜尔贝科修改基本培养基(DMEM),胎牛血清(的边后卫)和马血清来自Gibco,英杰公司生活的技术。初级和二级抗体来自圣克鲁斯生物技术。PVDF膜和免疫印迹检测试剂来自罗氏。对ELISA试剂测定来自研发、BD生物科学。其他试剂购自σ。
2.2。外科手术和再生实验
所有程序涉及动物伦理委员会批准的动物保健和使用的(192/2002)。比目鱼肌和EDL肌肉的再生诱导在三月大的雄性Wistar鼠(<一个href="#B14">14]。简言之,老鼠麻醉的腹腔内注射氯胺酮(6毫克/公斤)和xylasine(60毫克/公斤)混合物和肌肉被曝光。肌腱保存在地方,但运动神经被切断的肌肉表面。然后从肌腱肌腱与肌肉被赞颂歌止血钳。肌肉然后放回床上。皮肤关闭后,动物被允许恢复,回到他们的笼子里的食物和饮料在被随意。这个过程保证良好的再生过程的再现性和诱导的肌肉分解的纤维从而进一步验证生化分析肌肉受伤。抗体TGFβ1或TGFβ我(T受体βRI)注射后粉碎(100每肌肉在50 gL)治疗被称为肌肉的肌肉。受伤后在不同天,动物euthanasized每个动物的再生肌肉被移除和衡量。肌肉被直接用于生化调查或冻结在异戊烷在液氮预冷,然后储存在−80°C等待组织学或生化研究。三只老鼠被用于每个肌肉类型和实验重复3次。侧完好无损的肌肉也采取比较受伤的肌肉。
2.3。组织学分析再生肌肉
横向截面的控制或治疗比目鱼肌和EDL肌肉被削减(10米厚的)在低温恒温器(Microm、德国)和彩色Gomori组织学检查的三色的技术。
2.4。成肌细胞的主要文化
从比目鱼肌卫星细胞分离与链霉蛋白酶或联盟3个月大纯种雄性老鼠的肌肉,如前所述[<一个href="#B16">16]。细胞被播种(2 000个细胞/ c)菜肴上涂上0.1%明胶和不断生长在含10%胎牛血清的DMEM马血清,5%和10%在37°C。天4、6、8、10、12、14细胞增长是通过计算测量胰蛋白酶化后的细胞中收集和细胞均相免疫印迹或呕吐测量。组织学方面的文化被霍夫曼对比观察评估(尼康显微镜)。一些文化沾肌管的Giemsa-May-Grunwald技术分析和融合指数测定。肌管的尺寸是评估通过计算细胞核中发现每个肌管的数量。融合指数代表的比例细胞核中发现肌管除以总数量的核的文化。这些计数进行10代表每个板块属于多种文化的微观领域。
2.5。细胞治疗
在一些实验中,成肌细胞培养与anti-TGF接受治疗β1或anti-Tβ国际扶轮抗体。根据初步实验确定的最佳浓度和频率进行抗体治疗,比目鱼肌或EDL成肌细胞培养在第四天进行处理,然后随着介质改变1每2天g / mL anti-TGFβ1抗体。要么1.51.0 g / mL或anti-T g / mLβ国际扶轮是用于比目鱼肌和EDL成肌细胞,分别。
2.6。免疫印迹分析
实验进行控制或治疗再生肌肉和细胞培养。再生肌肉体内或体外细胞生长在冰冷的缓冲区包含20毫米Tris-HCl细胞溶解,EGTA 5毫米,5毫米EDTA, 150毫米氯化钾,诺乃清洁剂1%,0.5%钠脱氧胆酸盐,0.01%亮抑酶肽,0.5毫米PMSF和10毫米β巯基乙醇在pH值7.5。所有操作进行冰。蛋白浓度定量确定使用布拉德福德Biorad蛋白质分析。二十g蛋白质Laemmli示例缓冲被加载到一个十二烷基硫酸钠10%,丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜和孵化TGF引起的多克隆抗体β1、Tβ国际扶轮或纤连蛋白最终稀释(一夜之间,4°C)。这些墨迹被孵化与peroxidase-conjugated antirabbit抗体(1.5小时,室温)。凝胶的加载是经常使用反控制-tubuline [<一个href="#B46">46]。由化学发光免疫印迹的可视化和暴露在电影(柯达)。的图像使用GelDoc2000扫描仪和蛋白质的凝胶被乐队进行了分析使用数量一个程序使用Excel (BIORAD)和画。每个实验进行了3次,结果是用百分比表示的意思SE。
2.7。ELISA测定TGFβ1
免疫测定进行了提取与控制比目鱼肌或EDL再生肌肉。肌肉均质裂解缓冲;使用布拉德福德Biorad测定蛋白质浓度测定。一百年包含20 L的样本克总蛋白是根据制造商化验过程。为每个标准和样品进行重复测量。
2.8。硫酸化GAG测量
总硫酸化笑料测量巴博萨et al . 2003中描述<一个href="#B47">47]。总之,从细胞匀浆层或肌肉片段进行磷酸盐缓冲剂(惠普50 mM, pH值8.0)。细胞提取物50被处理g / mL蛋白酶K在磷酸缓冲56°C过夜。加热十分钟准备在90°C灭活蛋白酶K,在这一步中,整除的DNA样本的数量是由4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI)测定使用鲑鱼精子DNA作为标准(<一个href="#B48">48]。消化组织被对待DNAse(试剂盒、法国)使用7.5户/ 100毫克鲜重一夜之间在37°C,以消除干扰DNA。这些准备工作都是用于硫酸化呕吐定量。
总硫酸化的笑料和HS GAG物种量化使用基于dimethylmethylene蓝色共同沉淀的插科打诨的方法根据(<一个href="#B47">47]。HS是量化治疗后总插科打诨的准备与chondroitinase ABC(20亩/ 100L,σ2小时)。
2.9。统计分析
每个实验至少重复三次。数据表达的意思标准误差(SE)。统计学意义使用学生的决心t以及(GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。
3所示。结果
3.1。微分粉碎后比目鱼肌和EDL肌肉再生的特点
组织学的比目鱼肌和EDL肌肉crush-induced再生过程中显示在图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/659372/fig1/" target="_blank">1。粉碎后,一个完整的肌肉纤维肌溶解在肌肉中均可发生,也就是说,几乎实现了在第三天(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/659372/fig1/" target="_blank">1控制图片)。在第七天,无数的小纤维可以观察到在比目鱼肌和联盟的肌肉。然而,而反伊斯兰教英国防御联盟肌肉再生正确,显示一个结构良好的肌肉在粉碎后14天、64天,比目鱼肌显示不同种类的纤维尺寸粉碎后14天。再生没有进一步进展,纤维化,已经明显的14天,仍在64天。这两种类型的肌肉也不同肌肉调节因子(MRF)蛋白质模式。实际上,磁流变液在早些时候被激活再生EDL比目鱼肌。在这两种肌肉,MyoD和myogenin先后的含量也增加了。然而,在比目鱼肌,MyoD 14天5 - 7,myogenin天达到高峰,而在EDL肌肉这些mrf早些时候达到高峰,MyoD在其最大的第三天,myogenin第七天(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/659372/fig2/" target="_blank">2)。
