压敏电阻器的细胞随周期变动的本地化钙通道和神经内分泌细胞的有丝分裂器线(AtT-20)

文摘

细胞内钙的变化是必要的成功发展在许多细胞有丝分裂。海拔和减少细胞内钙可以干扰有丝分裂的机制仍然是不清楚的。在这项研究中,我们探索跨膜电压门控钙通道的作用(CaV渠道)监管机构有丝分裂的鼠标corticotroph细胞系(AtT-20)。我们报告CaV1.2 nifedipine-sensitive对碘氧基苯甲醚是本地化的“向极一侧”kinetechores中期期间和胞质分裂过程中中间体。CaV1.3,第二个nifedipine-sensitive同种型是目前在末期mid-spindle区,但也见过中间体。硝苯地平减少细胞增殖率,利用延时的显微镜,我们表明,这是由于一块在前中期阶段的细胞周期。使用Fluo-4我们检测钙离子通量网站对应mid-spindle区和中体地区。另一个钙染色,Fura PE3 / AM,使之前的抑制有丝分裂后期我们属性胞内钙的螯合物。结果证明小说,isoform-specific CaV1频道定位在细胞分裂和揭示了这些渠道可能作用在垂体corticotrophs calcium-dependent事件潜在的有丝分裂进程。

1。介绍

压敏电阻器钙通道(CaV渠道)multisubunit介质的跨膜蛋白细胞外钙离子进入细胞的神经,肌肉,和内分泌组织(<一个href="#B1">1]。基因组研究已经确定了3个家庭的十个基因编码α亚基指定CaV1, CaV2, CaV3 [<一个href="#B2">2]。骑兵通道基因的多样性使得大量的通道亚型,而这些不同的亚型往往表示位于相同的单元中。通过调节变化在细胞内自由钙,骑兵渠道作为关键信号事件的介质如细胞去极化,神经递质和神经肽分泌,调节基因表达的<一个href="#B3">3,<一个href="#B4">4]。钙通道生物学的一个重要目标,因此,是了解特定角色为每个通道同种型(s),以及它们的集成在不同的细胞活动。

钙通道的作用之一是耦合膜去极化释放神经递质(<一个href="#B5">5,<一个href="#B6">6]。CaV2.1和CaV2.2都直接与互动,和被调制,蛋白质组成神经递质释放装置(网罗复杂)。Colocalization渠道和释放机械促进积极的钙通道和钙之间的耦合依赖transmitter-containing囊泡与质膜的融合。

神经内分泌细胞,类似CaV1之间的耦合通道和释放机械被认为构成的分泌肽如胰岛素、生长激素、ACTH (<一个href="#B7">7,<一个href="#B8">8]。垂体corticotroph细胞系,AtT-20 ACTH分泌的研究是一个行之有效的模型系统。这些细胞表达多种亚型的骑兵,但只有CaV1通道耦合CRH -或depolarization-stimulated ACTH分泌(<一个href="#B9">9,<一个href="#B10">10]。在最近的一项研究中,我们审查的细胞分布CaV1渠道和网罗AtT-20s细胞蛋白质,发现colocalization CaV1.2,但不是CaV1.3突触机械的组件和可发布的肽(<一个href="#B11">11]。在这项研究中我们观察到CaV1通道附近局部分裂细胞的有丝分裂器组件。这些观察建议AtT-20细胞可以提供一个有用的模型检查的可能角色CaV1渠道在另一个细胞功能,有丝分裂。

钙信号在有丝分裂的作用已经推断出了几十年,然而,钙质机制在细胞分裂过程中,到目前为止,尚未阐明。研究建立了钙的作用和/或证明改变钙梯度在有丝分裂期间(<一个href="#B12">12- - - - - -<一个href="#B19">19]。钙参与调节有丝分裂检查点;通过有丝分裂阶段发展的临界点是密切监管也被证明(<一个href="#B20">20.- - - - - -<一个href="#B24">24]。此外,有丝分裂calcium-dependent激酶的作用也被检查(了<一个href="#B25">25])。

骑兵渠道中观察到分裂AtT-20细胞胞内钙离子通量代表一个可能的因素在有丝分裂期间。拮抗剂CaV1亚型(dihydropyridines(井下供电))已报告阻止有丝分裂的系统(<一个href="#B26">26- - - - - -<一个href="#B29">29日),所以它是可能的,这些通道在有丝分裂过程中扮演一个角色。而有限的进入有丝分裂器可能存在一些药物的障碍,井下供电是高度亲脂性的(<一个href="#B30">30.),因此可能达到内部膜网站。在本文中,我们表明,CaV1通道是本地化的接近有丝分裂结构。然后我们使用几个实验的方法来评估这些通道是否积极参与细胞分裂AtT-20细胞。

2。方法

2.1。细胞培养

AtT-20 / D16v细胞从美式文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。细胞培养试剂都获得表达载体(CA)卡尔斯巴德。AtT-20杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)包含4.5通用葡萄糖/ L和10%胎牛血清。细胞是维持在37°C 5%二氧化碳湿润孵化器和通道如前所述[<一个href="#B9">9]。显微镜、细胞是镀有房间的封面上滑落(纽约罗彻斯特Labtek / Nunc)和增长2到4天之前固定。扩散化验,细胞镀8-well板块(细胞计数)和96 -孔板(MTS试验)用于电镀后2 - 4天(60% - -90%融合)。钙和成像方法,细胞是镀前2 - 4天实验镀膜玻璃底部microwell菜(Mattek集团,MA)。细胞然后转移到前者媒体(炭/右旋糖酐的边后卫治疗;Hyclone,洛根UT) 12 - 18小时之前固定。

2.2。免疫细胞化学

细胞在磷酸盐(PBS)短暂冲洗,然后固定在PBS孵化20分钟含有4%多聚甲醛。三个洗PBS,细胞孵育5分钟100%甲醇20°C。他们在PBS再次清洗,然后在PBS permeabilized包含20毫米NaN3, NP-40 Tween-20 0.2%,和0.5%。所有后续洗采用抗体洗缓冲区(白平衡;PBS Tween-20 + 0.2%和0.05毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA免疫球蛋白g免费;σ,圣路易斯密苏里州)。固定细胞孵化24 - 48小时在4°C与一个或多个主要抗体稀释到世行(以下列出的来源抗体)。5洗白平衡后,细胞孵化的适当组合荧光二次抗体(Alexa-fluor轭合物,表达载体,卡尔斯巴德CA) 1小时22°C。这是紧随其后的是3洗,最后用PBS洗净。染色细胞存储在4°C Slo-fade(表达载体); or in Slo-fade containing the nuclear counterstain DAPI (6-diamidino-2phenylindole;英杰公司)。主要抗体是可以从以下商业来源:抗体CaV1通道α亚基来自Alomone实验室(耶路撒冷,以色列);Anticentromere(峰值)抗体抗体合并(戴维斯,CA);反微管蛋白,克隆DM1Aσ(圣路易斯,密苏里州)。CaV1抗体通道α亚基在兔子反对特定于CaV1.2肽序列(肽序列:TTKIN MDDLQ PSEN edk)和CaV1.3(肽序列:DNKVT IDDYQ EEAE DKD)亚型。一个基本的局部比对搜索(爆炸;国家生物技术信息中心,<一个href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的所有冗余蛋白质序列数据库显示这些以外的任何已知的蛋白质序列相似性大于50%这两个序列;类似鼠标蛋白质数据库的搜索识别肽序列只在这两个频道多肽。特异性的测试中,我们发现没有特定CaV1染色当主抗体是省略的协议,或者当抗体preadsorbed10倍摩尔过剩的肽抗原(没有显示)。

2.3。MTS试验

细胞是镀在96孔板(低密度/),可以成长为24 - 48小时,然后孵化72小时在媒体硝苯地平添加浓度表示。所有井都含有相同浓度的车辆,0.05% DMSO溶液。细胞密度测量使用修改后的甲基四唑协议(MTS;Promega麦迪逊WI)根据制造商的指示。数据归一化细胞吸光度孵化与车辆本身和绘制硝苯地平浓度的函数。所有图表绘制使用v8起源(OriginLab,北安普敦MA)。

2.4。共焦显微镜

我们彩色细胞图像在多个波长使用蔡司510元与倒置显微镜激光扫描共焦站(卡尔蔡司,耶拿,德国)使用63 x 1.4 na油浸的目标。有丝分裂阶段检测到眼睛用DAPI可视化染色体形态;由于共焦系统的局限性三颜色通道,成像的染色体是不可能除了蛋白质。所有频道顺序成像,图像存储为厚实RGB文件。数据组装使用Adobe Photoshop(版本。7.0)。图像有四个标签(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一))显示一些bleedthrough微管的波峰染色法染色。我们纠正使用MetaMorph v4.5开发软件(分子器件、森尼维耳市CA)通过计算的相对强度微管在波峰和微管图片,微管图像乘以价值,减去从波峰图像合成的图像。

2.5。视觉有丝分裂阶段分析

细胞是镀在低密度(/)有房间的封面(纽约罗彻斯特Labtek / Nunc),允许高度为24 - 48小时,然后孵化24或72小时在媒体包含硝苯地平(6米)。多个字段(最少5 /条件)AtT-20细胞相似的细胞密度的随机选择和成像滨松ORCA-ER相机安装在徕卡DMIRB倒置显微镜配有汞灯和DAPI过滤器立方体和40 x 1.25 na的目标。细胞的数量在每个阶段决定在MetaMorph使用“手动计数对象”应用程序。我们组细胞中确定后期、末期或胞质分裂成一个类(a / T / C)在我们的分析由于细胞有丝分裂指数低,很难区分这些阶段中使用染色体形态。

2.6。延时显微

时间序列的DIC图像获得如上所述用30秒的时间间隔。细胞保持了菜在37°C /成像会话的过程中尽量减少渗透性的变化。我们定义了一个重要的有丝分裂“块”,任何阶段的时间等于或大于两个标准差这一阶段所需的平均时间的控制细胞。对于Fura PE3 / AM AtT-20细胞成像通过DIC尼康TE2000U倒置显微镜100 x 0.5 - -1.3 na S萤石目的设置了虹膜领1.3 na使用" 1312黑白CCD摄像机(陷落有限公司)控制简单的PCI软件(Hamamtsu v5.3, Inc .)。细胞保持在37°C使用气流孵化器(AirTherm)。确定,影响细胞周期的进展不是一个功能成像设置或细胞培养条件下,前期细胞成像在整个细胞周期(1.5小时),而不增加Fura PE3 / (4米)在每个实验的一天。然后我们排除所有收集的数据的日子没有完成整个控制细胞有丝分裂周期内的平均时间s.d实验菜孵化与Fura PE3 / (4在37°C M) 20分钟前DIC成像有丝分裂和车辆控制(DMSO)。

2.7。钙成像

Fluo-4荧光成像在活细胞在尼康TE2000U倒置显微镜" 1412 Intensicam II。DIC和荧光图像获得同时使用一个长传球610纳米过滤器DIC照明,双相机适配器连接到相机港口,和565 nm色镜双摄像头适配器直接荧光发射的光线也推出" 1412 Intensicam II和DIC形象"的1312相机。一个萨特DG-4氙弧灯源和快速过滤装置用于照明激发波长的荧光和选择。一组FITC过滤器安装在显微镜下站在白光从DG-4交付。荧光照明和所有图像使用SimplePCI收购控制图像采集软件上运行两个PC电脑,每个相机一个。减少细胞过度的荧光激发光毒性,每一分钟一组10图像获得在1秒的时间间隔。收购模式的速度是由于后期的短时间(分钟)。信号强度确定延时图像系列的多个领域使用SimplePCI强度测量功能的软件。

3所示。结果

3.1。有丝分裂器CaV1.2和CaV1.3本地化

数据<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(B)显示的模式染色观察CaV1.2 CaV1.3,分别为AtT-20细胞捕获和固定在有丝分裂的不同阶段。在中期kinetechores形象化,细胞染色与kinetechore抗体(波峰抗体)除了CaV1.2抗体和CaV1.3。Costaining表明CaV1.2本地化网站毗邻的“两极”kinetechores在中期和后期(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一),(A)、(b)、插入)。值得注意的是,该分布的CaV1.2 kinetechores中期期间整个细胞的体积视为成像使用z-stacking跨整个主轴装置(图中未显示)和支持AtT-20细胞内的定位是,而不是从表面蛋白叠加成像。

细胞有丝分裂纺锤体的微管,形象化也costained与微管蛋白抗体DM1A。在末期,我们观察到CaV1.3(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一)(B),面板)在有丝分裂器mid-spindle区;我们不遵守类似CaV1.2(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一)、面板(A))。然而,随着微管冷凝进一步形成中间体在胞质分裂,CaV1.2和CaV1.3然后在中间体(图可视化<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一)面板(c)和图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(B)面板(B))。这些染色模式表明,直接一个活跃的细胞,isoform-specific再分配CaV1通道在细胞分裂周期。

测试如果有丝分裂通道分布出现在其他细胞,我们检查了CaV1渠道的分布在两个额外的神经内分泌细胞起源:PC12嗜铬细胞瘤细胞和INS-1β胰岛细胞。这两种细胞类型已知表达CaV1频道(<一个href="#B31">31日,<一个href="#B32">32]。图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1表明,在AtT-20细胞,CaV1.2(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一)面板(d)和CaV1.3(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(B)面板(c))是本地化的中间体PC12s在胞质分裂。相比之下,我们没有看到一个类似的模式INS-1 CaV1染色的细胞进行有丝分裂;CaV1.3渠道中间体而CaV1.2渠道不可见(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(一)面板(g);图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1面板(e), (B))。具体染色两种亚型在间期细胞容易可见报道之前(<一个href="#B31">31日]。这些差异在通道同种型染色支持这个想法,我们观察到的模式是由于真正的神经内分泌细胞类型之间的区别,而不是简单的一种非特异性抗体与有丝分裂结构。

作为另一个特异性的考验我们执行相同的成像协议使用epithelial-derived Cos 7细胞缺乏CaV1频道(<一个href="#B33">33,<一个href="#B34">34]。图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig1/" target="_blank">1(C)显示,在这些细胞我们只检测背景染色提示非特异性结合的抗体;没有特定于有丝分裂器的模式。

3.2。孵化与CaV1拮抗剂硝苯地平,减弱细胞增殖

测试CaV1渠道有丝分裂的潜在作用,我们检查的效果dihydropyridine(设计马力)CaV1拮抗剂硝苯地平,细胞生长使用标准测定细胞活力(MTS;见的方法)。细胞培养的不同浓度的硝苯地平72 - 96小时。硝苯地平在细胞分裂的作用是这个孵化后通过测量细胞密度进行了评估。我们使用这个长期孵化放大任何潜在的硝苯地平对细胞分裂的影响。图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig2/" target="_blank">2(一个)显示出剂量依赖性衰减硝苯地平的细胞生长。最大效应的方法减少了60%在细胞密度三天后孵化,对应于一个增长率下降约2.5倍。这个效应的IC50大约是1.5M值大大高于DHP-induced封锁的IC50测量释放ACTH (<一个href="#B9">9]。当的角色CaV1亚型1.2和1.3在分泌尚未明确确立,INS-1细胞中最近的工作表明,只有CaV1.2同种型耦合分泌(<一个href="#B31">31日]。此外,有证据表明CaV1.3通道具有较低的亲和力比CaV1.2井下供电同种型(<一个href="#B35">35),因此可能代表目标负责我们观察硝苯地平对细胞增殖的影响。

3.3。孵化与硝苯地平结果明显有丝分裂阶段的转变

我们接下来研究硝苯地平对细胞增殖的影响使用直接的细胞计数分析。固定AtT-20细胞治疗与核染色(DAPI)允许我们识别细胞在不同的有丝分裂阶段根据染色体形态。最大化我们的检测能力DHP-sensitive影响有丝分裂细胞的一小部分细胞发生细胞分裂在任何时候(4% - -6%),我们计算平均800细胞/条件使用至少5个不同的字段成像(显示为一般没有。细胞/字段)。首先,我们观察到显著减少细胞中的每个字段的硝苯地平(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig2/" target="_blank">2 (b)、控制与硝苯地平、)。第二,虽然总比例的细胞进行有丝分裂基本上是不变的硝苯地平(4% - -6%),有丝分裂人口中我们观察到明显降低的百分比/ T / C细胞(后期和末期/胞质分裂;图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig2/" target="_blank">2 (b),)。这种转变,随着观察硝苯地平累计减少细胞数量随着时间的推移,象征的一块在细胞有丝分裂发生前进入后期。累积效应的性质表明,额外的细胞进入有丝分裂周期,更多的拖延,无法进行完整的细胞分裂。我们也没有发现任何明显的变化在纺锤体形态与硝苯地平对孵化。最后,我们认为这可能是由于减少影响细胞分裂,而不是在我们发现没有证据表明细胞凋亡DNA梯法或其他标记的细胞凋亡在nifedipine-treated AtT20细胞(没有显示)。钙通道块通常是与凋亡的保护作用在模型中细胞死亡(<一个href="#B36">36]。

3.4。在有丝分裂硝苯地平诱发Phase-Dependent块

作为另一个方法来检查对硝苯地平在有丝分裂的影响,我们下一个使用直接的延时显微评估个体的细胞分裂。AtT-20细胞成像的6M硝苯地平(或车辆控制,DMSO)(通过胞质分裂间期)来确定不同阶段的平均时间在这两种条件下每个有丝分裂阶段。图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig2/" target="_blank">2 (c)显示了硝苯地平对细胞的发展前期/前中期/中期到后期。Nifedipinetreated细胞在有丝分裂过程显示一块(52%;细胞)与控制细胞(15%;细胞;)。这个DHP-induced块的大小可以表示为一个“平均完成时间有丝分裂”(垂直的线标准差,虚线)。同时从前期到胞质分裂硝苯地平治疗细胞转移(底板)虽然有两组之间的重叠。换句话说,控制和硝苯地平治疗细胞可以在前中期/中期“停滞”,但这种现象更频繁地发生在硝苯地平的存在。长时间我们观察细胞中观察到的细胞发生染色体decondensation回归相间。最后,尽管可以观察到的细胞死亡,它是控制和nifedipine-treated细胞,特别是成像较长一段时间的课程(例如,时间)。

3.5。钙螯合干扰有丝分裂

我们下了几个calcium-sensitive染料的影响,对他们的潜在影响有丝分裂(由于螯合钙)和作为一种工具来检测钙瞬变的有丝分裂AtT-20细胞。报道在其他系统(<一个href="#B13">13,<一个href="#B14">14),我们发现AtT-20细胞治疗与钙指标Fura PE3 / (4米)干扰有丝分裂前后期各个阶段(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig3/" target="_blank">3 (b),<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig3/" target="_blank">3 (c))。相反,如果Fura PE3 / AM被添加到一个细胞已经在后期和末期,有丝分裂收益没有明显的延迟(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig3/" target="_blank">3 (d))。确定如果弥漫性细胞损伤是发生在细胞内钙的螯合反应的存在Fura PE3 /点,我们间期细胞的成像(或“:”)观察中可以看到如果自发动作电位AtT-20细胞可以通过测量观察随之而来的钙瞬变。见数据<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig3/" target="_blank">3 (b)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig3/" target="_blank">3 (c)相对荧光对应峰值检测钙使用Fura PE3 / AM能够测量附近的间期细胞(箭头所指),表明细胞仍能表现出电活动后Fura PE3 / AM加载;这是图中以图形的方式显示<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig3/" target="_blank">3 (c)。的影响Fura PE3 /我是,因此,与报道一致证明微扰的胞内钙可能导致破坏的有丝分裂。这个“螯合效应”明显不同于细胞内钙含量的变化可能发生的由于CaV1,尤其是:细胞。然而,挑衅,螯合钙和DHP-induced封锁CaV渠道导致有丝分裂一个前中期块,表明细胞内钙要求有丝分裂可能是唯一与这一阶段在有丝分裂有关。

3.6。钙瞬变Colocalize CaV1.2分布和CaV1.3

Fura PE3 /螯合演示了一个明确的有丝分裂calcium-dependence,至少在前后期阶段。然而,由于这一中断,这种染料不允许在这些细胞钙成像。钙瞬变我们使用Fluo-4形象,免费钙指示剂染料亲和力较低钙。钙离子离解常数()Fura PE3 / AM 250海里,虽然这Fluo-4 400海里。使用低亲和力染料,细胞通过有丝分裂进行允许检测钙离子通量的中间体(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig4/" target="_blank">4(一)并发DIC成像(图)作为标识<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig4/" target="_blank">4 (b)),以及在该地区的mid-spindle区。再一次,这些区域与上述采用本地化CaV1.2和CaV1.3频道。

细胞内钙瞬变测量在这些网站很明显高于附近的间期细胞的核区域(区域4)和背景(区域5)如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/487959/fig4/" target="_blank">4(c)。此外,在细胞内钙含量测量海拔地点(区域1 - 3)中间体地区不太可能是由于增加了荧光探针的“体积效应”,由于中间体和邻近地区是高度收缩,因此,代表一个小得多的体积比区域测量在细胞质中。因此,人们会预计潜在的未被充分代表,不代表,钙的浓度。不幸的是,如图所示Fura PE3 / AM,比率分析是可能的。这将是有趣的检测细胞内钙水平变化在多个点状的站点CaV1s也用免疫荧光,如kinetechores在中期。

4所示。讨论

虽然在有丝分裂钙的作用已经涉及了大约2年,关键的钙来源没有,到目前为止,被证实。数据在本文中提供的证据一个有趣的可能角色CaV1-type钙通道的有丝分裂AtT-20 corticotrophs。我们可以确定CaV1.2免疫反应性的“向极一侧”kinetechores, CaV1.3 mid-spindle区免疫荧光,CaV1.2和CaV1.3中体亚型。此外,我们还能在网站对应于图像钙通量mid-spindle区(CaV1.3)和中间体(CaV1.2和CaV1.3)。不幸的是,钙成像在有丝分裂的其他阶段超出我们当前研究的检测阈值。然而,isoform-specific对离散的有丝分裂结构,结合随之而来的钙信号强度变化,符合这些通道的功能作用在细胞分裂。此外,有平行stage-specific扰动在存在设计马力拮抗剂以及钙螯合。而螯合的胞内钙块有丝分裂阶段的后期,细胞孵化CaV1拮抗剂,硝苯地平,导致细胞增殖下降似乎是由于“前中期块。“虽然从力学上看不同,有趣的是,细胞内钙水平似乎有丝分裂在这个关键时刻发挥关键作用。

证据作用的钙在细胞有丝分裂至少在某些类型是长期存在的<一个href="#B13">13,<一个href="#B20">20.]。相比之下,几乎没有证据表明钙通道在有丝分裂的作用,尽管cell-cycle-dependent表达CaV1和CaV3钙电流在平滑肌细胞已经被报道<一个href="#B38">37]。Stage-dependent敏感性钙含量变化也被描述。例如,Groigno和惠特克(<一个href="#B39">38]证明了细胞内钙上升在海胆胚胎后期;增加钙和相关的染色体分离可以阻止与钙螯合和恢复激活关在笼子里的钙。钱德拉(<一个href="#B19">19)再分配LLC-PK1细胞钙的商店,一个对齐的钙mid-spindle区前后期。

鉴于骑士是完整的膜蛋白,我们的观测暗示骑兵渠道必须以某种方式从细胞表面位置附近有丝分裂结构在一个时段内的过程。许多先前的研究已经证明膜重组的重要性在有丝分裂期间(<一个href="#B38">37- - - - - -<一个href="#B43">42]。早期的证据由Pawaletz和Fehst [<一个href="#B38">37]证明了囊泡的不断积累,海拉细胞的有丝分裂器。染色体在有丝分裂过程中囊泡周围指出,核膜消失在前中期,完整的有丝分裂器在中期,然后泡在mid-spindle检测区和中间体,然后reaccumulate在高尔基体在末期,因为它重新出现在这个阶段。Waterman-Storer et al。<一个href="#B40">39)发现膜分布在细胞有丝分裂PtK2和LLC-PK1贴上膜染料,DiOC6,并显示膜在前期的再分配,与管式膜结构调整在前中期kinetechore纺锤波。科切豪斯和他的同事们已经表明,有丝分裂与转移膜回收的平衡,导致净减少在质膜和细胞大小(<一个href="#B42">41,<一个href="#B43">42]。这个内化的过程和质膜的重组涉及SNARE-related蛋白质,如突触融合蛋白,特别是在细胞分裂后期(<一个href="#B43">42- - - - - -<一个href="#B46">45]。自突触融合蛋白和其他SNARE蛋白还在胞外分泌功能,这是挑衅,我们的观察代表一个潜在的平行现象,特别是有许多研究证明直接和间接SNARE蛋白之间的相互作用和CaV频道(<一个href="#B6">6]。

我们观察CaV1频道的网站显示细胞内钙前后期的独特作用。例如,在中期存在一些“检查点”调节有丝分裂进程,直到所有染色体中期板是一致的,正常有丝分裂纺锤体的微管。因此它遵循,这个阶段可能是一个敏感的阶段硝苯地平和钙螯合,降低细胞内钙提供一个共同的机制。中期后,细胞开始后期姐妹染色单体分开的有丝分裂纺锤体,这一过程依赖于适当的动粒微管附件。存在CaV1.3 mid-spindle区域,因此,也感兴趣的。然而,奇怪的是,既不暴露于硝苯地平,螯合钙,AtT-20细胞块后期的发展。一种可能性是,上面讨论的走私渠道可能把目标硝苯地平在内部网站访问。然而,螯合后的细胞内钙的缺乏影响后期的启动也提出了并行的可能性途径参与在这一重要时刻。

最后,它是有趣的,与设计马力拮抗剂孵化,硝苯地平,产生细胞密度下降,与块前后期一致。先前的研究设计马力对细胞增殖的影响证明有丝分裂的抑制血管平滑肌(<一个href="#B29">29日)和富有同情心的成神经细胞(<一个href="#B26">26]。在PC12细胞中硝苯地平也已被证明能够抑制细胞分化[<一个href="#B48">46];这个评论可能与当前可视化CaV1.2和CaV1.3中体的神经内分泌细胞线。结合这些研究,我们的数据表明,本地化CaV渠道在有丝分裂器可能导致井下供电的机制(s)已成功辅助药物化疗方案(<一个href="#B49">47]。

确认

这项工作是支持的畸形儿基金会科研补助金(6 - fy03 - 68), K08指导临床科学家奖(1 K08 DK65929-01),在乎(CAH研究基金会)。Patel博士是趋势,支持培训格兰特(T32 DK 07129)。迈克尔·胡克的成像进行显微镜设施。作者要感谢迈克尔·蔡博士为技术支持和讨论。

引用

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