表达LGI1损害扩散和海拉细胞的生存

文摘

LGI1基因提出函数作为肿瘤抑制的能力,以减少恶性胶质母细胞瘤细胞的特性。在支持这一提案LGI1发现过度的神经母细胞瘤细胞抑制增殖和诱导细胞凋亡。在这项研究中我们执行稳定LGI1表达海拉细胞检查LGI1的有害效应是否可能扩展到癌细胞的多样化的起源。海拉细胞克隆稳定表达LGI1展出扩散的一个重要障碍和一致的增加死亡的细胞相比,控制细胞缺乏LGI1的表情。表达LGI1增加细胞凋亡效应器caspase-3/7的活动;此外它表达下调凋亡BCL2基因和调节proapoptotic伯灵顿基因表达,表明海拉细胞死亡的原因可能是一个容易LGI1诱导细胞凋亡增加。结果表明,LGI1能够抑制生长和存活的细胞腺癌如海拉。

1。介绍

富亮氨酸,神经胶质瘤灭活1 (LGI1)基因被发现在刹车点相应的染色体易位t(10; 19)(抓起;问题)在胶质母细胞瘤细胞系T98G [1]。LGI1蛋白质包括域可能参与蛋白质相互作用等富亮氨酸重复两侧半胱氨酸富裕地区和seven-bladed beta-propeller域(2- - - - - -4]。LGI1表达的基因主要是大脑,它与常染色体显性侧颞叶癫痫(ADLTE) [5,6]。尽管LGI1有待定义的特定功能,建议与Kv1.1钾离子通道形成复合物,大脑和突触传递的重要监管机构也ADAM22转移膜受体的配体,蛋白高表达在大脑的功能仍然是不确定的(7,8]。

LGI1表达式的损失在大多数高级神经胶质瘤肿瘤抑制基因的功能(支持1]。符合这一假说的LGI1 reexpression神经胶质瘤细胞,缺乏内生LGI1,受损的细胞生长和迁移能力(9]。这些表型变化与基质金属蛋白酶(MMP)的差别,对这些基因的LGI1-mediated抑制ERK / MAPK通路(10]。LGI1的角色发展的恶性脑瘤证实了体细胞在LGI1错义突变基因的发现与高收入和低级的神经胶质瘤(11]。LGI1的神经母细胞瘤细胞的抑制增长的结果是由LGI1过度,这是证明损害增殖和诱导细胞凋亡的抑制PI3K / AKT通路(12,13]。进一步支持LGI1的肿瘤抑制功能是提供一个全面研究恶性食管肿瘤(巴雷特有关腺癌)显示,表达LGI1一直表达下调(14]。

本研究的目的是建立LGI1是否能抑制癌细胞的增长不同于胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤。为此我们在海拉细胞稳定表达LGI1执行,这是源于人类宫颈腺癌和蛋白质表达了人类乳头状瘤病毒E6 / E7 (HPV-18) [15]。本质上这些病毒蛋白维持细胞增殖和生存通过肿瘤抑制基因p53的失活和复审委员会,参与细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡(16,17]。这些特性赋予非常剧烈增长,海拉细胞似乎特别适合测试LGI1的影响。

LGI1的结果表明,表达抑制海拉细胞增殖率和增加细胞死亡。此外LGI1改变表达凋亡等细胞凋亡的关键调节b细胞淋巴瘤2基因(BCL2)和proapoptotic b细胞淋巴瘤2-associated X蛋白基因(巴克斯)18]。致命的效果由海拉细胞LGI1表达式表明,提出的肿瘤抑制作用可能会延伸至adenocarcinoma-derived细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和转染

海拉细胞(写明ATCC号:CCL-2)在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM,低的葡萄糖)10%的热灭活胎牛血清(FCS)。对转染细胞()被播种在10厘米直径塑料碗。与质粒转染pcLGI1包括人类LGI1 cDNA(2075个基点)或空向量pcDNA3 (10克/毫升每个;表达载体,格罗宁根、荷兰)是由DNA磷酸共同沉淀。转染后细胞培养48小时;然后他们在低密度山肩。稳定转染细胞克隆选择新霉素G418(1 - 0.5毫米)。

2.2。rt - pcr

总RNA隔绝subconfluent GeneElute哺乳动物细胞的总RNA工具包(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。互补脱氧核糖核酸的合成是由逆转录酶ImProm-II从随机引物考试(Promega,麦迪逊,美国WI)。量化LGI1 mRNA, cDNA片段(236个基点)放大的引物:-TGTAAACTGAAATGGCTAGTGGAA,-AGTAAAAGGCTGAGCGATGACTAC。放大的BCL2段(258个基点)进行了引物:-GGTCATGTGTGTGGAGAGCGT,-ACTTCACTTGTGGCTCAGATAGGC。伯灵顿片段(539个基点)扩增引物:-CCAGCTCTGAGCAGATCATG和-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA。一部分Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH, 909个基点)放大使用引物:-GACCCCTTCATTGACCTCAACTACA和-GGTCTTACTCCTTGGAGGCCATGT(美国Clontech,帕洛阿尔托,CA)。PCR半定量rt - PCR分析不同数量的周期(25)和串行cDNA稀释了建立线性放大的条件。PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离;溴化乙锭染色的净强度乐队决定使用柯达1 D图像分析软件。

2.3。免疫印迹

总细胞蛋白(50g) 10%聚丙烯酰胺凝胶上分离。下面的抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA美国)被用来探测墨迹:抗体C-19指向LGI1 c端肽的(60 KDa),亲和纯化多克隆抗体(伯灵顿21)与伯灵顿蛋白质(KDa 23日),和bcl - 2单克隆抗体和GAPDH蛋白质(28 KDa, 36 KDa,分别。免疫反应是揭示了ECL试剂(法玛西亚Amersham生物技术,小都,英国)和量化的柯达1 D图像分析软件通过评估的净强度。

2.4。扩散试验

一个基于BrDU ELISA免疫测定掺入根据指令来测量细胞增殖过程(德国罗氏诊断)。细胞被镀上一式四份96集群板块(100细胞/毫米²)和培养24小时。吸光度(450 - 690 nm)是用一个盘子读者。

2.5。细胞死亡

确定死细胞的一部分,乳酸脱氢酶(LDH)释放介质,在完整细胞测量使用CytoTox非放射性细胞毒性试验(Promega,麦迪逊,美国WI)。细胞被镀在96孔板(100个细胞/毫米²)和培养24小时。一半的培养基被转移到一个新鲜的确定由死细胞LDH自发释放。溶解的完整细胞进行培养基的另一半。然后四唑盐(INT)转化为红甲瓒产品LDH活性测定吸光度(490海里)。坏死细胞的比例计算如下:%细胞毒性=[自发释放总LDH] /。

2.6。Caspase-3/7

Apo-ONE齐次caspase-3/7化验(Promega)是用来确定caspase-3/7活动。细胞被播种在96孔板(100个细胞/毫米²),caspase-3/7衬底Z-DEVD-R110添加24小时后。反应进行了6个小时,然后测量荧光是由一个盘子荧光光谱仪(485 nm激发波长530 nm发射波长)。LDH化验进行复制的细胞样本以确定活细胞的数量,这是用于规范化半胱天冬酶的活动。

2.7。统计分析

实验数据被表示为。以确定变化的意义,分析学生的价值观以及;水平的被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

稳定转染的海拉细胞建立执行LGI1 cDNA表达LGI1是否会影响细胞的生存能力。LGI1表达水平是评估在三个细胞克隆指定He-LGI1-1 He-LGI1-2,分别和He-LGI1-3(图1)。LGI1 mRNA的量化的结果相当符合的估计价值LGI1蛋白质(表1)。尽管LGI1蛋白质样品中检测出整个细胞,可能是分泌的可能性,因为它发生在293年的t细胞(19)不能被排除在外,因为它可能是绑定到细胞表面。

LGI1的内源性表达nontransfected海拉细胞和细胞克隆稳定转染空载体中无法通过rt - pcr和免疫印迹(见He-pcDNA3;图1和表1)。缺乏LGI1表达在人类子宫肿瘤和正常子宫组织支持的分析表达序列标签(est) UniGene报道和在协议缺乏LGI1表达小鼠子宫(20.]。

BrDU合并过程的影响来评估LGI1海拉细胞增殖率表达式。所有细胞克隆表达LGI1表现出较低的增殖率相比,控制细胞转染空向量(图2),这是类似于nontransfected海拉细胞(没有显示)。He-LGI1-1细胞克隆,LGI1表达式非常少,减少细胞增殖平均为30%。He-LGI1-2细胞,表达LGI1最高水平下降为80%,而70% HeLGI1-3细胞,显示中间的LGI1表达水平(图2)。结果表明,LGI1对细胞增殖的抑制作用是比例与LGI1表达的水平。

建立LGI1表达是否也会影响海拉细胞的生存我们测量的自发LDH释放量在中由于细胞死亡。坏死细胞的比例也显著大于在细胞克隆表达LGI1相比,控制细胞(图3)。特别是He-LGI1-1死细胞的比例平均为7%,略但显著大于He-pcDNA3细胞,这是5%。致命的效果更大He-LGI1-2和He-LGI1-3,坏死细胞的分数平均26%和21%,分别。细胞存活率的下降显然与LGI1表达的水平,同样抑制细胞增殖。以来取得了显著影响细胞克隆HeLGI1-1表达LGI1非常低的水平,它可以表明,细胞增殖和生存的障碍是适当的LGI1活动的结果而不是人工超表达的结果。此外,这些影响细胞上皮起源排除与蛋白质相互作用的要求明确表示在大脑LGI1对比细胞生长和生存的能力。

获得的信息造成的海拉细胞死亡过程的表达LGI1我们测量细胞凋亡效应物的活动caspase-3和7在实验条件下用来监测细胞死亡(图4)。相对特定caspase-3/7发出的荧光底物在乳沟特别加强与He-LGI1-2(7.4倍)和He-LGI-3细胞(4.2倍),而适度增加测量与He-LGI1-1(图3)。结果支持的可能性表达LGI1可能引发海拉细胞的凋亡。

为了证实海拉细胞的诱导凋亡表达LGI1我们测量的水平凋亡BCL2 proapoptotic BAX基因表达的,因为这些蛋白质的相对比例控制细胞的生存中起着重要的作用[18]。显著减少BCL2信使rna和蛋白质在细胞克隆表达LGI1测量与控制细胞相比,而伯灵顿一直增加(图的表达1;表1)。特别是,伯灵顿的upregulation表达式与LGI1水平成比例,与伯灵顿蛋白质的最大增长4.6倍He-LGI1-2(表1)。结果表明,凋亡BCL2基因表达下调,其对手proapoptotic伯灵顿是调节LGI1表达式的结果。

下降的比例BCL2 /伯灵顿支持从线粒体释放apoptogenic分子,激活细胞凋亡的内在途径在各种癌症细胞,包括海拉(21- - - - - -26]。因此LGI1可能增加海拉细胞自发性凋亡的敏感性,同样发生在neurobalstoma细胞(12]。

显然LGI1能有效地抵消人乳头状瘤病毒的致肿瘤性,专门的病毒蛋白E6,防止细胞凋亡刺激p53的ubiquitin-mediated退化,转录监管机构能够提高伯灵顿的表达,抑制BCL2 [16,27- - - - - -29日]。因此这些凋亡因素由E6的平衡来维持细胞生存可能被LGI1动摇支持细胞凋亡。尽管LGI1引起的细胞死亡的机制尚未完全阐明,似乎可能LGI1干扰中央生存如PI3K / AKT途径,因为它发生在神经母细胞瘤细胞(13),因为这个途径的prosurvival效应包括转录调节BCL2基因和伯灵顿(30.,31日]。

总之,本研究支持LGI1可能adenocarcinoma-derived细胞作为肿瘤抑制,巴雷特LGI1报道的差别在对这些相关的腺癌,与先前的研究在胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤细胞9- - - - - -14]。

引用

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