snRNP:丰富的核机构风信子胶l .小孢子和花粉细胞的发展

文摘

本工作的目的是在小孢子核体的特征和发展中花粉细胞风信子胶lAg-NOR的结合,免疫荧光技术被用于这项研究。然后,电镜下观察结果显示存在高度agyrophylic extranucleolar身体在小孢子和发展中花粉细胞,最后确定为卡哈尔的身体。在所有情况下,一个强大的积累snRNP-indicating分子包括TMG帽,Sm蛋白和U2核内小rna,检查核中可观察到的身体。与数量的大小确定结构在花粉发育没有明显变化。在小孢子和花粉粒CBs的营养细胞是多比的生殖细胞。花粉发育的后期,在观察CB数量急剧减少,在开花期之前,这些结构是完全没有显示在两个花粉细胞核。在这些结果的基础上,以及我们的以前的研究,我们假设一个强大的关系卡哈尔身体数字和RNA合成的水平和拼接机械元素在小孢子和花粉细胞的发展。

1。介绍

基因内区移除是pre-mRNA处理的关键步骤之一。剪接反应发生在大,核糖核蛋白复合物,叫做剪接体。大多数剪接体的基本元素是snRNPs的五类,U1, U2, U4 / U6, U5,剪接因子从SR的家人和大约300个不同的蛋白质1]。

大规模的采用和原位杂交技术在过去的二十年启用步骤定义的本地化的分子参与细胞的基因表达。这些方法允许我们研究不同的RNA的分布类型以及蛋白质参与pre-mRNA拼接。结果表明,RNA转录分子参与处理非随机分布在细胞核。基于这些结果,斯佩克特(2)提出了他们所称的“核域”的概念。“核域”这一术语用于描述空间和功能组织在细胞核的基因表达。到目前为止,三核领域被表示为参与pre-mRNA拼接:(1)perichromatin纤维(PFs), (2) interchromatin颗粒(IGs)和核称为卡哈尔身体或盘绕的身体(CBs)2- - - - - -7]。

卡哈尔的身体特征(蛇的身体)是最好的核结构存在于植物和动物细胞。这些球形结构,直径从0.5到10米,存在1到5的速度每核不同的细胞类型8]。CBs展览高亲和力银离子和分子标记是一种磷蛋白质p80-coilin。卡哈尔尸体的确切功能仍然未知;然而,关于其分子设备和频繁的与核内小rna的基因编码,snoRNA和组蛋白,他们被认为是一个重要的角色在提到的基因的表达。到目前为止,它已经表明,卡哈尔的身体包含(1)分子参与核糖体RNA代谢(fibrillarin nucleolin, U3,与和U14 snorna),(2)转录和pre-mRNA剪接因子(RNA聚合酶II,真沸点蛋白质,基底TFIIF转录因子,TFIIH,所有的拼接snRNPs和Sm蛋白),(3)分子参与组蛋白基因的转录和处理(得以核内小RNA和SLBP蛋白质),(4)细胞周期蛋白(E / cdk细胞周期蛋白),和(5)等其他分子拓扑异构酶I,核纤层蛋白A,端粒酶RNA (8- - - - - -11]。

卡哈尔的身体不pre-mRNA拼接的地方,因为它们缺乏SC35剪接因子,pre-mRNA和(8]。然而,由于这一事实CBs尤其富含拼接机械元素,包括snRNPs和Sm蛋白,建议他们是细胞的一个重要元素拼接系统。根据假设马泰拉(12),核内小rna编码基因的转录发生在哥伦比亚广播公司的外围和新成立的核内小rna是针对细胞质,Sm核心领域的组装和TMG帽形成(3,13]。最后,snRNPs返回到细胞核和本地化卡哈尔体内,这些分子发生的甲基化和pseudourydilation [14]。最近,越来越多的报道强烈建议卡哈尔的身体也可以microrna的网站和siRNAs生源论(15]。因此,看来CBs多功能核结构参与生物起源、回收和/或存储的分子参与关键步骤新陈代谢活跃的真核细胞的基因表达。CBs是动态的结构能够从核仁外围核浆;因此他们可以找到相邻或全神贯注于核仁以及免费的核浆(9,11,16]。此外,他们的数量和大小取决于细胞代谢活动和细胞周期9,16,17]。

植物卡哈尔的身体通常特点是类似于动物CBs。他们也显示包含分子参与pre-mRNA处理,包括snRNPs和Sm蛋白,以及rRNA加工机械,包括U3 snoRNA和fibrillarin17- - - - - -20.]。因此,类似于动物细胞、植物卡哈尔的身体似乎与核仁的新陈代谢和浸渍银,以同样的方式作为纤维组件的核仁20.]。然而,没有DNA或rRNA表示在这些结构在植物细胞中21]。可视化的哥伦比亚广播公司(CBs)植物细胞和生活答:芥植物转染GFP-U2B“编码融合结构表明,植物CBs也动态结构与移动的能力,在核分裂和加入彼此22]。此外,结果表明,CBs在植物细胞的数量变化在细胞周期和分化8]。鉴于这些事实,甚至尽管低相似性脊椎动物p80-coilin和最近发现植物Atcoilin [23),它通常看来,卡哈尔的身体是高度保守的核在所有真核细胞结构和执行类似的功能。

到目前为止,只有少数报告有关卡哈尔的身体在雄性配子体细胞的植物。识别这种类型的核落叶松的身体在小孢子母细胞24),小孢子的道格拉斯(25)和落叶松的元素二地区的机构(26)以及小孢子和花粉细胞的芸苔属植物显著(27,28),甜椒(28]。然而,后者的研究大多是集中在卡哈尔的身体大小和数量的变化伴随着小孢子胚胎发生重组。

在目前的研究中,我们报告的鉴定和分子分析卡哈尔的身体中风信子胶l .花粉的开发。在先前的研究中,我们进行了详细的分析的代谢活动,包括RNA合成和加工,在小孢子和区分花粉细胞的风信子29日- - - - - -32]。因此,我们选择了这些细胞作为实验模型来检查以及哥伦比亚广播公司(CBs)的数量是否与核活动的水平的小孢子和花粉细胞的发展。此外,小孢子和区分花粉粒是独特而优秀的模型研究基因表达的组织,因为他们表现出改变RNA合成和经历的生理(自然)抑制转录(成熟的花粉粒)在他们的发展过程中,与其他实验系统中,细胞的代谢活动是人工调制使用不同种类的抑制剂。

2。材料和方法

2.1。植物材料

发展中风信子胶l .小孢子和花粉粒被用于调查。灯泡的风信子胶l .简历粉红珍珠(可展曲面,托伦,波兰)种植在塑料锅,冰箱里为8周6在黑暗中。接下来,锅被生长室,每个灯泡都覆盖着宝塔纸管。植物被种植在26岁在16-hour-light / 8-hour-darkness (LD条件)周期(130摩尔 凉爽的白色的日光灯,Polam2 - 4周,华沙,波兰)。条件下,区分花粉粒,每24小时收集了14天。这段时间包括所有阶段的小孢子和花粉粒的发展,以前被Bednarska [29日]。

2.2。Ag-NOR技术

为Ag-NOR技术,花药被固定在Carnoy的解决方案。随后修改反应根据豪厄尔和黑色(33]。固定材料水分降低浓度的乙醇,洗在5%乙酸,最后在蒸馏水。浸渍后,花药放置在显微镜载玻片覆盖着明胶和干冰冷却15分钟。接下来,解决方案中的材料是孵化含有2.5%明胶(美国底特律Difico实验室)和50%的水溶液AgN与比在室温15分钟。孵化的时间估计基于显微观察。孵化后,幻灯片用蒸馏水洗净了30分钟,然后用5%硫代硫酸钠10分钟。用蒸馏水洗涤后,材料在增加一系列乙醇脱水,嵌入Euparal。样本在尼康Eclipse 80我光学显微镜分析。

2.3。定量测量

计算核体的数量由AgNOR染色,30小孢子和花粉粒在每个阶段从三个不同的准备。分析使用卢西亚通用软件(实验室成像,布拉格,捷克共和国)兼容尼康Eclipse 80我显微镜配备了CPI计划萤石100(数值孔径,1.3)浸油的目的。

测试多个样本(团体,即差异。,number of nuclear bodies in different stages), a Kruskal – Wallis ANOVA test was used. The Mann-Whitney U test as the post hoc comparisons with Bonfferoni adjustments was computed to know what samples are particularly different from each other. All tests were performed with a的值小于0。。

2.4。免疫荧光技术

免疫荧光方法,花药的混合物被固定在4%多聚甲醛和0.25%戊二醛在PBS隔夜4。的材料脱水乙醇浓度增加,过饱和,然后嵌入BMM树脂(甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、安息香乙醚的0.5%,10毫米二硫苏糖醇;丙烯酰胺化学GmbH是一家现代化的、书、瑞士)。嵌入式材料切成semithin (1.5米)的部分,放在显微镜载玻片覆盖Biobond(英国Biocell国际、卡迪夫、英国)。TMG核内小rna检测通过孵化主要鼠标anti-TMG抗体(Calbiochem,坏Soden,德意志联邦共和国)稀释1%牛血清白蛋白(BSA)准备在PBS, pH值7.2,一夜之间在4。然后用二级样本孵化山羊anti-mouse Alexa萤石488(分子探针)抗体稀释在1% BSA在PBS 1小时37。Sm蛋白被发现通过孵化主要鼠标日元抗体稀释1%牛血清白蛋白(BSA)准备在PBS, pH值7.2,一夜之间在4。接下来,样本与二次孵化山羊anti-mouse抗体与Cy3共轭荧光染料(Sigma-Aldricht)。DNA染色4.6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)(丙烯酰胺)。控制的反应是由省略主要抗体(数据未显示)。

2.5。荧光原位杂交

使用寡核苷酸探针TOR50 U2核内小rna检测,这是互补的第一个20 U2核内小rna的核苷酸(有机化学、分子和大分子的研究中心,波兰科学院)。调查与Cy3化学标记的荧光染料结束。小时后prehybridization、鱼进行了至少12小时37在杂交缓冲(30%的甲酰胺,4 xssc, 100鲱鱼精DNA的g / ml)。片洗的SSC,SSC和SSC,连续。DNA与DAPI染色(丙烯酰胺)。控制反应是使用杂交缓冲执行有调查。

观察的幻灯片进行Eclipse尼康80我荧光显微镜。居民消费价格指数(CPI)计划100年萤石(数值孔径,1.4)DIC H / N2油浸物镜和窄带滤波器(UV-2EC, B - 2 ec, G-2EC)。结果是注册一个尼康DS-5Mc颜色冷却数码相机和图像分析卢西亚G软件(实验室成像,布拉格,捷克共和国)。

2.6。Immunogold标签

技术,然后在电镜下观察材料固定如上所述,在酒精脱水,嵌入LR黄金(Sigma-Aldricht)。使用的材料切成超薄部分徕卡超微切片机,放在formvar-coated镍网格。TMG核内小rna检测通过孵化主要鼠标anti-TMG抗体(Calbiochem,坏Soden,德意志联邦共和国)稀释1%牛血清白蛋白(BSA)准备在PBS, pH值7.2,一夜之间在4。网格被孵化与二级山羊antimouse免疫球蛋白抗体共轭10纳米金(英国BioCell)稀释在1% BSA准备在PBS 1小时37。Sm蛋白被发现通过孵化主要鼠标日元抗体稀释1%牛血清白蛋白(BSA)准备在PBS, pH值7.2,一夜之间在4。然后网格和二次孵化山羊antimouse抗体共轭10纳米金(英国BioCell)稀释在1% BSA准备在PBS 1小时37。此外,网格上面反应后沾1% PTA在水中(phospho-tungstic酸)和5% (w / v)醋酸双氧铀。控制与遗漏反应进行的主要抗体(数据未显示)。

2.7。Ultrastrucutral U2核内小rna的本地化

在超微结构水平,U2使用TOR50探测器检测到核内小rna,化学的标签和酶标记结束结尾digoxigenin (f . Hoffmann-LaRoche有限公司、Rotkrenz、瑞士)。杂交进行12小时42。为了可视化调查,部分与初级孵化鼠标antidigoxigenin抗体(f . Hoffmann-Roche)一夜之间在4。接下来,网格和二次孵化山羊antimouse 15纳米金免疫球蛋白(英国BioCell)稀释在1% BSA准备在PBS 1小时37。最后,网格沾1% PTA (phospho-tungstic酸)和5% (w / v)醋酸双氧铀。控制反应了使用杂交的探针。

2.8。DNA检测

根据后三十(技术然后TdT电镜下观察了34),与修改。网格在37孵化30分钟用以下的解决方案:20M Br-dUTP(σ),200毫米甲次砷酸盐,钾25 mMTris-HCl, 250g / mL牛血清白蛋白(BSA)、pH值6.6;5毫米CoCl2 4M dCTP dGTP dATP 2.5 U /L末端转移酶(罗氏)。材料然后再蒸馏的水清洗和孵化与PBS先后,5% BSA在PBS和PBS。孵化与anti-BrdUTP抗体(罗氏),稀释在PBS,进行了1小时37。网格然后用PBS和孵化antimouse抗体加上15纳米金(BioCell)。最后,网格沾5%醋酸双氧铀。

超微结构分析进行了使用在80千伏Jeol 1010电子显微镜操作。

3所示。结果

3.1。Agyrophylic核结构的核心风信子胶l .小孢子和花粉细胞的发展

Ag-NOR技术揭示了存在agyrophylic结构小孢子和区分花粉细胞的细胞核。强大的银浸渍的极化小孢子的地方都是细胞核的核仁和常规核机构相邻或自由局部核浆(图1箭头)。身体在小孢子的数量从1到4之间每核,和它的平均数量是每核(图2.22)。检查结构的直径从1到2m。其余的小孢子核浆领域表现出降低硝酸银的亲和力。就在小孢子分裂,agyrophylic蛋白质被证明存在于花粉细胞(图1),在营养核强大的银离子积累观察在常规形核核仁以及身体,直径从1到2不等m(图1一个箭头)。在这个发展阶段,营养核agyrophylic尸体的数量变化从1到3,平均的数量除以2(图2)。其余地区的营养核浆表现出相对较低水平的银浸渍(图1a)。年轻的花粉粒生殖细胞核的硝酸银的高亲和力都显示,核仁和单一,小型核的身体。这些结构不同的直径从0.8到1m(图1一个箭头)和他们的平均数量不超过0.5核。应该注意的是,在整个过程中花粉的开发,研究结构的平均数量明显高于营养核的生成(图2)。在进步的生殖细胞分离sporoderm(图1b),最强的银染色是在花粉细胞核的核仁,以及核体,通常营养核(图中观察到1b,箭头)。描述身体的直径相当恒定的分析期间的发展和变化从0.8到2.2m。生殖核浆显示银离子的浓度高于营养,和生殖细胞核的核仁的分离通常是在这个发展阶段(图观察1b)。完成分离后的生殖细胞花粉壁的显著差异模式的硝酸银染色观察两国花粉核(图1c)和连续下降的平均数量agyrophylic身体营养核(图中可观察到2)。对银离子的喜爱是核仁中所示,和一些核体直径约为1.5米营养核(图中1c,箭头)。在生殖细胞核,高度浓缩的染色质在开发这一时期的花粉,agyrophylic蛋白质通过整个区域的局部核浆。明显,生殖细胞核的亲和力硝酸银相当的亲和力在这个发展阶段(图营养核仁1c),核仁的高度agyrophylic材料是通过生殖核浆(数据分散的1c和1c”)。此外,从这个发展阶段,agyrophylic核尸体不再生成核(图中观察到2)。不成熟的花粉粒,强大的银浸渍观察营养核和核仁的生殖核浆的不同区域(数据1d和1d ')。最后阶段的花粉发展也伴随着完全缺乏银染色花粉核(图核的身体2)。在开花期之前,花粉核显示显著差异在银染色定位模式(图1e),营养核,展品最强的染色质凝结在这个发展阶段和一个摆动的形状特点,agyrophylic蛋白质主要是局部核浆的中心区域(图1e”)。反过来,在生殖核银染色观察不规则集群的形式出现在整个地区的核(图1e)。

图1

风信子胶 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l .银nitrate-stained小孢子和发展中花粉粒(中子核,没有核仁,VN-vegetative细胞核,细胞质VC-vegetative, GN-generative细胞核,细胞质GC-generative)。Bars-10m。图。在小孢子有清晰可见的核心三个extranucleolar agyrophylic身体(箭头)。图的。小孢子有丝分裂后,营养核核仁和三个普通的身体可以看到(箭头)。生殖细胞核、核仁以外,定期和强烈agyrophylic身体存在(箭头)。图b。在这两个年轻的花粉粒核核仁可以观察到。营养核浆两银nitrate-stained身体是可见的(箭头)。图c。花粉粒生殖细胞分离后sporoderm显示。营养核是一个明显的核仁,核体(箭头)。生殖核展品强劲Ag-NOR染色,没有组织核仁和核的身体。图c”。放大的生殖核显示在图c(区域标有虚线)。分散、高度agyrophylic核仁的材料可以看到中心的生殖细胞。图d。成熟花粉粒。只有高度agyrophylic核仁可观测到的营养核浆。生殖核显示出很强的染色。图d’。放大的生殖核显示在图d(区域标有虚线)。强烈Ag-NOR彩色核仁的材料是整个地区的局部核浆。图e。花粉粒antheisis之前。高度agyrophylic flapped-shape营养核,没有组织可以看到核仁。梭形生殖细胞核展品的存在强烈的硝酸银染色以不规则的形式集群。图e”。放大的营养核显示在图e(区域标有虚线)。核仁的材料,在黑暗的形式集群,可以看到在核的中心区域

图2

图说明的平均数量银nitrate-stained extranucleolar身体极化小孢子和区分花粉细胞。在小孢子核体的平均数量为2.2。在整个过程中花粉开发这些结构的数量要高得多的营养核的生成。直到sporoderm的生殖细胞的分离,agyrophylic核体的平均数量在营养核和达成价值最高的/ 2 /核。在后期的花粉发展核的平均数量的身体营养核先后下降。在生殖核银nitrate-stained尸体被发现只有在年轻的花粉粒和他们从来没有达到平均数量超过0.5 /核。在两个原子核的成熟花粉粒无核的尸体被显示。的值表示三个复制实验的平均值;误差棒表示一个平均数标准误差。

3.2。拼接积累snRNPs核体小孢子和花粉细胞的发展

用免疫细胞化学和原位杂交显示特定浓度的snRNP-representing分子核的尸体风信子胶l .小孢子和花粉区分细胞。小孢子,免疫荧光的TMG核内小rna是均匀位于核浆以及常规核的身体,经常毗邻核仁(图3箭头)。然而,核仁没有荧光。在小孢子细胞质只有轻微的标签(图3)。Sm蛋白也被证明是高度集中在核小孢子(图的尸体3a)。此外,核体的面积通常是没有DNA染色(数字3一个,3b和3b”,箭头)。较低水平的均匀荧光,表明Sm蛋白,观察小孢子核浆。在小孢子细胞质,很低的信号(图3),荧光原位杂交检测U2核内小rna也显示这个分子的具体定位在常规核的身体出现在小孢子核(图3c,箭头)。在许多情况下,这些U2 snRNA-rich核仁周围结构毗邻。在周围的核浆,荧光水平显著降低。在核仁以及小孢子细胞质,没有杂交信号(图3c)。

图3

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 浓度snRNP-indicating分子核小孢子的尸体和年轻的花粉细胞显示使用免疫荧光技术(中子核,没有核仁,VN-vegetative核,VC-vegetative细胞质,GN-generative核,GC-generative细胞质)。数据”- - -g”。DAPI染色的小孢子和花粉粒。Bars-10m。图。极化小孢子。免疫荧光定位TMG核内小rna指示其高核体内积累(箭头)毗邻核仁。图身体。核含有高水平的Sm蛋白(箭头)小孢子核浆中可以看到。数据b和b”的放大显示虚线标注的面积数据一个和一个”。没有DNA标签可以观察到在该地区的核体(箭头)。图U2乐队的c。高浓度核内小rna是可见的在两核的身体(箭头)毗邻小孢子核核仁。图d。花粉粒后小孢子有丝分裂。核体含有高水平的TMG核内小rna表示在营养核浆(箭头)。数据e和e”的放大显示虚线标注的面积数据d和d’。缺乏可以观察到DNA核体区(箭头)。图f。年轻的花粉粒。两个Sm-rich核体存在于营养核(箭头)。图g。年轻的花粉粒的营养和生殖核一核的身体,包含U2核内小rna(箭头)表示。图h。控制执行的荧光原位杂交反应U2核内小rna探针感觉(中子核,C-cytoplasm)所示。没有标签中可以看到原子核极化小孢子。图h”。DAPI染色的小孢子在图所示h。

在年轻的花粉细胞的细胞核中,我们还显示核的存在体含有高水平的拼接snRNPs(数字3d -3g,箭头)。在两个原子核新形成的花粉粒,TMG核内小rna被证明存在于整个地区的营养和生殖核浆。然而,最高浓度在核的尸体被发现,通常出现在营养核和核仁附近经常(图3d,箭头)。标签的核仁是免费的。类似的在小孢子核,核体的面积不营养核DNA检测(数字3d,3e和3e”,箭头)。Sm蛋白的免疫荧光定位在年轻的花粉细胞花粉核(图显示他们的存在3f)。信号检测在花粉细胞核以及营养和生殖细胞的细胞质中年轻的花粉粒。通常在营养核,2或3核的身体覆盖着一个强烈的信号观察(图3f,箭头)。就在小孢子有丝分裂后,杂交信号指示U2核内小rna的存在也观察到花粉细胞核。然而,核体(图中发现了最高水平3g,箭头)。应该注意,U2 snRNA-rich核身体营养核中通常是更大、更大量的生殖细胞核。荧光原位杂交实验控制使用U2执行核内小rna探针和没有标记的小孢子核(数字3h和3h”)。控制反应免疫荧光实验由省略主要抗体,显示没有荧光信号检测细胞(数据没有显示)。

强烈的snRNP-representing分子利用免疫荧光和鱼技术积累也证实在电子显微镜级(数字4- - - - - -4本地化的TMG然后b)。电镜下观察小孢子核内小rna的(数据没有显示)和年轻的营养核花粉粒显示强烈的核体(图和特定的标签4箭头)。在周围的核浆,标签的水平显著降低。核仁是没有标签(图4)。金颗粒,表明Sm蛋白的存在也高度集中在核体小孢子(数据没有显示)和年轻的花粉细胞(图4一个箭头)。人数不多,但分散的金颗粒也观察到花粉细胞的核浆。在核仁缺乏观察胶体金(图4a)。U2在EM级别核内小rna原位杂交显示高水平的这种分子在核小孢子(图的尸体4b)和花粉细胞(数据没有显示)。分散的金颗粒,U2核内小rna也观察到在小孢子(图的染色质4b)和花粉细胞核(数据没有显示)。此外,DNA标签在超微结构水平使用TdT技术证实缺乏DNA核小孢子(图的尸体4c)和花粉细胞(数据没有显示)。没有黄金粒子在原子核极化小孢子后原位杂交控制实验中,使用一个执行U2核内小rna探针(图4d)。控制反应,表现为所有通过省略主要抗体抗原,并没有显示任何标签的小孢子和花粉细胞(数据未显示)。

图4

4 4 4 4 4 Immunogold本地化snRNP-indicating分子核小孢子和营养细胞年轻的花粉粒(中子核,没有核仁,VN-vegetative核)。酒吧- 0.5m。图。Immunogold标签的TMG营养核核内小rna的年轻的花粉粒。强大的标签中可以观察到核的身体(箭头)本地化接近核仁。图。超微结构的Sm蛋白定位在年轻的营养核花粉粒。无数金颗粒主要集中在核体(箭头)。图b。U2核内小rna原位杂交是显示。U2在核核内小rna的存在体中可以看到小孢子核(箭头)。图c。DNA标签使用TdT)技术在极化小孢子核(中子核)。没有标签中可以看到核体(箭头)。图d。控制执行的原位杂交反应使用U2核内小rna探针(中子核,No-nucleolus)感觉。没有可以看到黄金粒子核浆和核体(箭头)本地化接近核仁。

4所示。讨论

在目前的工作我们已经表明agyrophylic蛋白质在细胞核的存在小孢子和花粉细胞的发展h .胶。银染色的差异化H.o。花粉核显示模式的重大变化银浸渍在营养和生殖细胞核。在花粉核的核浆,连续观察银染色强度的增加随着花粉的发展。然而早些时候观察过程和更明显的生殖核营养核。在开花期之前在花粉核,核浆的银染色强度最高。最agyrophylic结构在两种花粉细胞核的核仁。在组织良好的营养核核仁观察在开发阶段的花粉的大部分时间里,除了成熟的末尾,当其发生种族隔离和拆卸。观察生殖细胞核的核仁直到sporoderm的生殖细胞的分离。在花粉发育的后期,种族隔离和后续观察生殖细胞核的分裂。在开花期之前,大多数营养核染色质的强烈压缩和agyrophylic蛋白质在flopped-shape均匀局部细胞核。这个时候花粉发育、生殖细胞核不是观察和agyrophylic蛋白质凝聚染色质区域之间存在。 Changes in silver staining pattern observed during风信子胶l .花粉细胞分化强烈反映了染色质凝结状态的变化以及核仁组织这个物种的花粉的开发中,首先描述Bednarska和Gorska-Brylass [30.]。似乎观察核清楚地说明基因活性的状态变化的花粉细胞在分化,也是许多其他植物物种中描述(35- - - - - -37]。然而,银浸渍模式中观察到的核成熟的花粉粒,这被证明是转录沉默(29日,31日),特点,可能反映了特定组织花粉细胞核的核仁的材料。缺乏生殖细胞的核仁在开花期之前被证明是伴随着RNP粒子的存在外围的凝聚染色质团(30.]。本研究使用EDTA染色根据Bernhard [38]。反过来,营养核,类似于生殖细胞核,RNP粒子在perichromatin本地化主要地区的核(30.]。鉴于这些数据,我们认为,银浸渍是特定的不规则的模式表明agyrophylic蛋白存在于这些RNP-positive区域的花粉细胞核。

众所周知,卡哈尔的身体(CBs)包含agyrophylic类型的核仁的蛋白质;因此,Ag-NOR技术也是在不同的细胞类型识别的方法,包括植物细胞(39- - - - - -41]。实际上,这些核结构的大小和形状,以及定位在细胞核中,强烈建议他们卡哈尔的身体。在电子显微镜下观察到核机构作为包装,盘绕的厚interchromatin地区自由线程局部或邻近核仁,核的强烈类似于卡哈尔体的超微结构4,7,18,42]。额外的证据确定结构属于卡哈尔身体阶级snRNP-related分子的特定的和强大的积累。的荧光和电子显微镜显示snRNP-specific粒子积聚在圆形核的身体,经常毗邻核仁,强烈的直径以及超微结构对应于卡哈尔的身体。鉴于所有这些数据,我们假定agyrophylic身体中观察到风信子胶l .小孢子和花粉细胞进化过程中对应卡哈尔的身体,Ag-NOR技术可以作为定量分析的一个非常好的工具,这些结构在花粉发育。

哥伦比亚广播公司(CBs)的平均数量的分析发现在发展中小孢子和花粉粒h .胶表示其有很强的正相关关系,这些细胞的转录活动展示了在我们先前的研究[31日]。在花粉发育过程中,营养细胞表现的更积极比生殖细胞RNA合成。此外,最高水平的转录在花粉细胞中观察到年轻的花粉粒,而发现了RNA合成的连续压制后的花粉发展阶段。成熟花粉粒被显示转录沉默(29日,31日]。的确,结果显示,哥伦比亚广播公司(CBs)更丰富的小孢子和年轻的营养细胞核。在花粉成熟后期,在哥伦比亚广播公司(CBs)的数量大幅减少营养细胞中观察到。在生成的核心h .胶发展中花粉核尸体很少观察到每核(小于0.5),只有在年轻的花粉粒阶段。我们假设这样一个低数量的CBs相关生殖细胞RNA合成的含量明显降低,与这些相比,观察小孢子或营养细胞(31日]。还应该指出,哥伦比亚广播公司(CBs)阶段的生殖细胞中观察到年轻的花粉粒,当转录活性最高(31日]。最近,Segui-Simarro et al。28]分析了孤立的小孢子核体和花药培养的芸苔属植物显著和甜椒l .他们发现,在这两个物种,哥伦比亚广播公司(CBs)的营养细胞存在于小孢子和年轻的花粉粒,刚刚第一个花粉有丝分裂,但在少量。在成熟的花粉,国家统计局很少观察到。基于这些细胞的转录活动,这些结果表明转录活动之间的相关性和哥伦比亚广播公司(CBs)的存在。此外,小孢子胚胎发生后,伴随着转录活动的增加,作者表明,年轻的原胚高度增殖和直径以及CBs每个细胞的数量增加(28]。在许多不同类型的哺乳动物细胞,哥伦比亚广播公司(CBs)也显示出与转录激活,细胞周期进程和代谢活动2,7,8,43,44]。此外,核体增殖活动的变化被认为是潜在的敏感也在植物细胞中45]。因此,我们的结果似乎证实了普遍的观点,CBs特点高新陈代谢活跃细胞,他们的数量和/或大小反映了细胞的转录状态。

我们也发现了一个强大的哥伦比亚广播公司(CBs)的平均数之间的正相关和拼接的水平机械元素在小孢子和区分花粉细胞,在我们之前的报道(32]。我们的研究显示,最高水平的TMG核内小rna, Sm蛋白以及SC35拼接因素发生在小孢子和年轻的植物花粉细胞,而在后期花粉开发水平的检测抗原先后降低并达到最低在开花期之前。在花粉粒成熟,机械拼接元素的水平要高得多的营养细胞的生殖细胞(32]。在小孢子阶段,年轻的营养细胞,哥伦比亚广播公司(CBs)是最丰富的。在花粉发育的后期,拼接的水平机械元素和CBs先后的数量减少。

在这里,我们显示一个强大的积累TMG核内小rna, Sm卡哈尔体内蛋白质和U2核内小rna技术。然后用免疫荧光和电镜下观察所有检测分子也显示特定标记的CBs在花粉小孢子和分化细胞。在新陈代谢活跃细胞RNA合成的集约化和处理通常是观察和导致更高水平的转录/拼接机械元素在这些细胞。模型snRNP生源论,提出马泰拉(12),假设CBs发挥重要作用在核内小rna转录和snRNPs成熟的最后步骤。它已经表明,一些核内小rna编码基因,包括U1和U2核内小rna,空间毗邻CBs外围(46,47]。作者推测,CBs可能参与核内小rna转录的调控。最近的结果Darzacq et al。14)表示的原因一些snRNPs部分积聚在卡哈尔尸体后返回到细胞核。他们发现了一本小说类的小分子rna, scaRNAs(特定卡哈尔的身体rna),只对这些核结构和特定功能pseudourydilation和核内小rna的甲基化的最后步骤snRNP生源论(10,13]。成熟snRNP粒子催化剪接反应做好准备。因为哥伦比亚广播公司在发展阶段中最丰富的snRNPs的水平是最高的,特别是在花粉细胞的细胞质32),我们不能排除他们的存在反映了强化snRNP生源论年轻小孢子和花粉细胞。此外,细胞的转录活动和强化snRNP生源论是紧密耦合的功能;这样看来,马泰拉提出的模型尤其如此,在小孢子和花粉细胞清晰可见h .胶。

这些非凡的核结构的普遍性质,他们的身份也证实了在不同类型的细胞在这种进化遥远的物种,如鞭毛藻类(48),果蝇(49),非洲爪蟾蜍(50),和哺乳动物(9]。哥伦比亚广播公司也一直在观察小孢子和花粉细胞在不同的植物物种,例如,在芸苔属植物显著(27),橄榄21),道格拉斯冷杉(25),和落叶松24,26]。考虑到所有这些事实,似乎卡哈尔身体进化保守核结构,在所有情况下,他们作为一个重要的元素的核基因表达真核细胞的机械。

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